Faserphotometrie CSOM Bildgebung kombiniert genetisch codierte benutzerdefinierte Indikator und optische Fasern, um neuronale Aktivität in frei bewegenden Tieren zu überwachen. Was entscheidend ist, um zu verstehen, wie eine bestimmte Gruppe von Neuronen bei der Regie oder Reaktion auf eine Aktion oder einen Stimulus spielt. Diese Technik ist eine zugängliche Möglichkeit, von bestimmten Hirnregionen, die durch ihre Verbindung oder genetische Profile definiert werden, mit der eingebauten Steuerung zu trennen Signal zu Rauschen zu erfassen.
Demonstrieren den Prozessor wird, Ekaterina Martianova, eine Studentin in meinem Labor. Beginnen Sie mit dem Lösen aller Schrauben am Fünf-Achsen-Übersetzer. Schrauben Sie das Patchkabel an den Adapter, der am Fünf-Achsen-Übersetzer befestigt ist.
Schalten Sie dann das 470 Nanometer Anregungslicht bei geringer Leistung ein und positionieren Sie die Spitze der Faser, die auf einen auto fluoreszierenden Kunststoffschlitten zeigt. Nächster Aufnahme von der kostenlosen Metalloxid-Halbleiter- oder CMOS-Kamera im Live-Modus. Erhöhen Sie die Verstärkung oder passen Sie die Nachsuchtabelle an, bis das Bild im Mittelpunkt des Ziels sichtbar ist.
Bringen Sie den Fünf-Achsen-Übersetzer auf das Ziel zu, um sicherzustellen, dass das 470-Nanometer-Licht auf der Faser am SMA- oder FC-Ende des Patchkabels zentriert ist, bis ein Bild auf der Kamera aufgelöst werden kann. Passen Sie schließlich die X- und Y-Achsen an, bis das Bild zentriert und gut aufgelöst ist. Visualisieren Sie das Licht, das vom Variolenende des Patchkabels emittiert wird, wie es als isotroper Kreis erscheinen sollte.
Beginnen Sie, indem Sie alle Anregungsleuchten einschalten, um die Fasern besser zu visualisieren. Und passen Sie die Kameragewinne so an, dass keine Pixel gesättigt sind und ein klares Bild der Fasern vorhanden ist. Dann machen Sie ein vorläufiges Bild.
Zeichnen Sie Bereiche von Interesse oder ROIS um die Fasern. Und halten Sie sie für die Messung der mittleren Intensitätswerte während der Aufnahmen. Für mehrere Faseraufnahmen, testen Sie für Unabhängige durch Live-Aufnahme von allen Fasern.
Zeigen Sie eine Faser auf eine Lichtquelle und tippen Sie mit einem Finger. Beobachten Sie Schwankungen im Kanal. Dann farbiges Klebeband am Ende der Fasern auftragen, um zu kennzeichnen, welcher ROI welcher Faser entspricht.
Richten Sie schließlich den Aufnahmebereich ein, indem Sie das Patchkabel über der Arena mit Ständern, Klammern und Halterungen aufhängen. Schließlich stellen Sie sicher, dass das Tier nicht in der Bewegung durch die Länge der Faser begrenzt wird und sich frei in der gesamten Arena bewegen kann. Beginnen Sie mit der Inspektion des distalen Endes der Fasern der Patchschnur per Auge und mit einem Mini-Fasermikroskop.
Wenn die Oberfläche der Fasern zerkratzt ist, polieren Sie die Fasern mit Faserpolierfolie mit feinem Körnung neu. Dann reinigen Sie die distalen Enden des Patchkabels mit 70% Ethanol und einem Baumwollspitzenapplikator. Reinigen Sie die Faseroptikkanülen mit 70% Ethanol und einem Baumwollspitzenapplikator.
Verbinden Sie das variole Ende des Patchkabels mit der implantierten Faser mit einer Keramik-Split-Hülle, die mit einem schwarzen Schrumpfrohr bedeckt ist. Stellen Sie während des Anschlusses sicher, dass die Hülse fest ist. Lassen Sie das Tier für ein paar Minuten erholen.
Beginnen Sie dann mit der Aufzeichnung des optischen Signals, und führen Sie das Experiment aus. Während der Aufnahme halten Sie ein wachsames Auge auf die Live-Spur, um qualitativ hochwertige Aufnahmen zu gewährleisten. Und achten Sie auf alle Sprünge in Signal, was darauf hinweist, dass die Hülse nicht fest genug ist.
Für die Dual-Farbaufnahmen fügen Sie dem Photometriesystem eine 516 Nanometer LED hinzu, um den roten fluoreszierenden Kalziumsensor und entsprechende dichroitische Spiegel und Filter zu anregen. Fügen Sie dann einen Bildsplitter zwischen dem Objektiv und der CMOS-Kamera hinzu, um die grünen und roten Emissionswellenlängen zu trennen. Schließlich zeichnen Sie ROIS um alle Fasern in beiden Farben, rot und grün.
Achten Sie darauf, jeden ROI mit der entsprechenden Faser und dem entsprechenden Kanal eindeutig zu identifizieren. Lösen Sie die gleichzeitige Anregung mit 470 Nanometer und 560 Nanometer LEDs aus und wechseln Sie sie mit einer 410 Nanometer LED ab. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die gemessene Fluoreszenz signifikant gleichzeitig mit der Verabreichung von Luftpuffs für Mäuse mit Aktivierung des LHA-LHB-Signalwegs zugenommen hat.
Bei Mäusen, die grünes fluoreszierendes Protein oder GFP exdrücken, wurde jedoch keine Änderung des Signals während der Verabreichung von Luftpuffs festgestellt. Diese Technik ermöglicht es Forschern, von bestimmten Arten von Zellen in verschiedenen Gehirnregionen vernünftig zu erfassen. Während sich ein Tier frei benimmt.
Dies fördert die Fähigkeit, die Funktionen dieser Gehirnregionen zu sezieren, da sie sich auf das Verhalten beziehen.
