Das Gefäßsystem des Gehirns ist ein komplexes Netzwerk aus durchdringenden Arterien, Kapillaren und aufsteigenden Venolen. Diese Gefäße sind von Wandzellen umhüllt, wie z.B. umhüllende Perizyten, die Alpha-Aktin der glatten Muskulatur exprimieren, und befinden sich in den ersten vier Ästen von durchdringenden Arterien. Wir verwenden acta2-RCaMP 1.07 transgene Mäuse, um Kalziumtransienten in diesen Zellen durch die Expression des genetisch kodierten Kalziumindikators RCaMP zu visualisieren.
Kalzium spielt eine starke Rolle bei der Kontraktion dieser Zellen und der Kontrolle des Blutflusses. Kapillare Perizyten befinden sich weiter stromabwärts im Gefäßnetzwerk und können in anderen transgenen Modellen markiert werden. Wir konzentrieren uns jedoch bei dieser Methode auf die Umhüllung von Perizyten.
Unseren Mäusen wurde chirurgisch ein chronisches Schädelfenster implantiert, das den Zugang zum Gehirngefäßsystem für die Bildgebung ermöglicht. Hier skizzieren wir die notwendigen Vorbereitungsschritte und die Injektion von Schwanzvenen, gefolgt von den beiden Photonenbildgebungs- und Analysemethoden, die zur Erfassung von Perizyt-Calciumdaten und Informationen über den Blutfluss bei anästhesierten Tieren erforderlich sind. Für eine Schwanzvenenkatheterinjektion sind folgende Gegenstände erforderlich: Insulinspritzen, ein 15-Zentimeter-Stück PE10-Schlauch, 30-Gauge-Nadeln, Gaze, Kochsalzlösung, Pinzette, grüner Fluorescein-Dextran-Farbstoff, Zange und Schere.
Wir haben auch eine Nadel mit Ketamin-Xylazin-Anästhesie, die wir vor der Bildgebung injizieren, da sie für Blutflussmessungen besser ist als Isofluran. Brechen Sie mit der Zange eine 30-Gauge-Nadel von der Nabe. Führen Sie die Nadel vorsichtig in das Ende des PE10-Schlauchstücks ein, das an einer mit Kochsalzlösung gefüllten Spritze befestigt ist.
Dies ist der Katheter für die Injektion. Betäuben Sie eine Maus mit Isofluran und tragen Sie I-Lube Gel auf. Legen Sie ein Handschuhfeld mit warmem Wasser auf den Schwanz, um die seitliche Vene zu erweitern.
Nachdem Sie den Schwanz mit Ethanol gereinigt haben, führen Sie die Nadel in die Vene ein und injizieren Sie sanft Kochsalzlösung durch den Katheter, um sicherzustellen, dass die Nadel richtig platziert ist. Schalten Sie die Spritze auf den Katheter gegen eine mit Fluorescein-Dextran-Farbstoff gefüllte Spritze ein. Injizieren Sie den Farbstoff langsam, um sicherzustellen, dass keine Blasen in das Röhrchen gelangen.
Ersetzen Sie die Dextranspritze durch die Kochsalzspritze und spülen Sie den Schlauch ab, bis kein Farbstoff mehr im Röhrchen verbleibt. Entfernen Sie die Nadel und drücken Sie mit Gaze. Injizieren Sie Ketamin-Xylazin-Anästhesie zur Bildgebung.
Wenn der Mauskopf auf einem Heizkissen befestigt ist, reinigen Sie das Schädelfenster mit Zahnapplikatoren. Tragen Sie Ultraschallgel auf das Fenster auf und fokussieren Sie durch das Zwei-Photonen-Mikroskopobjektiv. Für die Zwei-Photonen-Bildgebung verwenden wir ein Mikroskop mit abstimmbarem Titan-Saphir-Laser für Fluoreszenz-, Anregungs- und Photomultiplierröhren zur Emissionsdetektion.
Stellen Sie in der Mikroskopsoftware die Wellenlänge auf 990 Nanometer ein, um sowohl RCaMP als auch Fluorescein-Dextran anzuregen. Als nächstes stellen Sie die Laserleistung ein, indem Sie die Pockelzellenspannung und die Empfindlichkeit des PMT-Detektors einstellen. Live-Scanning mit diesen Parametern und höherer Auflösung, RCaMP-positive Wandbildzellen und das fluoreszierend markierte Blutplasma sind zu sehen.
Der Erwerb eines Tiefenstapels wird empfohlen, um Perizyten im Gefäßnetzwerk richtig zu lokalisieren. Wenn Sie an der Oberseite des Gewebes in der Nähe der PO-Gefäße fokussiert werden, stellen Sie dies als Nullpunkt und Oberseite des Zed-Serienstapels ein, fokussieren Sie dann im Gewebe auf die gewünschte Tiefe und stellen Sie dies als Unterseite des Stapels ein. Die Laserleistung muss so eingestellt werden, dass sie zunimmt, wenn sich das Mikroskop tiefer durch den Stapel bewegt.
Öffnen Sie die Zed-Serie in der Bildverarbeitungssoftware, verschmelzen Sie die beiden Kanäle als farbige Bilder und scannen Sie den Stapel nach Perizyten und Blutgefäßen von Interesse. Wählen Sie Interessante Regionen aus, die Perizyten enthalten, und speichern Sie die Positionen, um diese Stellen in zukünftigen Bildgebungssitzungen wieder zu lokalisieren. Um ein Perizyt-Calcium-Ereignis zu sammeln und zu verschieben, erhöhen Sie die Erfassungs-Framerate auf mehr als 10 Frames pro Sekunde.
Legen Sie die Imaging-Dauer auf 60 Sekunden fest und aktualisieren Sie den Speicherpfad mit einem eindeutigen Dateinamen. Zoomen Sie optisch auf das Gefäß, um die geringere Auflösung zu berücksichtigen und einen genaueren Blick auf das Perizyten zu erhalten. Erwerben Sie die T-Serie.
Um den Blutgefäßdurchmesser und die Geschwindigkeit der roten Blutkörperchen zu messen, wählen Sie einen Zeilenscan, um einen eindimensionalen Scan mit dem Mikroskop zu starten. Stellen Sie zunächst die Dauer des Scans in Millisekunden ein. Zeichnen Sie dann eine Linie, die das Gefäß von Interesse halbiert und sich parallel entlang des Gefäßes bewegt.
Dies erzeugt einen Kymographen des Gefäßdurchmessers auf der linken Seite und Streifen der roten Blutkörperchen, die sich durch das Gefäß auf der rechten Seite bewegen. Eine vollständige Liste der in diesem Protokoll verwendeten Programme und Pakete finden Sie in der Materialtabelle. Wählen Sie zunächst von Hand interessante Regionen in der Bildverarbeitungssoftware aus.
Laden Sie die Datei der T-Serie, nehmen Sie den Durchschnitt des Stapels und erstellen Sie ein farbiges Bild. Wählen Sie das Polygonwerkzeug und umreißen Sie die sichtbaren perizytären Perizytenstrukturen wie Soma und Prozesse. Geben Sie jeder Region von Interesse einen eindeutigen Namen und speichern Sie sie als Zip-Ordner, der später in die Programmiersoftware geladen werden kann.
Öffnen Sie die Programmiersoftware und stellen Sie sicher, dass sich die Ordner für die Bildverarbeitungspakete im Pfad befinden. Importieren Sie die Calcium-T-Serie in die Programmiersoftware und definieren Sie, was sich auf jedem Kanal befindet. In diesem Fall ist es ein zelluläres Signal auf Kanal eins und Blutplasma auf Kanal zwei.
Plotten Sie die Daten als Film innerhalb der Programmiersoftware, um die Visualisierung zu erleichtern. Um grüne Fluoreszenz aus Fluorescein-Dextran zu entfernen, das in den roten RCaMP-Kanal durchblutet, vermischen Sie die Kanäle im Bildverarbeitungspaket. Wählen Sie zunächst eine Region aus, die nur Fluorophor 1 enthält, in diesem Fall RCaMP.
Zweitens wählen Sie eine Region, die nur Fluorophor 2, Fluorescein im Plasma enthält. Wählen Sie schließlich einen Hintergrundbereich aus, der keinen der beiden Fluorophore enthält. Dadurch wird eine spektrale Beitragsmatrix generiert, die auf jedes Pixel in jedem Kanal angewendet wird.
Es verbessert signifikant die Lokalisierung des RCaMP-Signals, was die Erkennung von Kalziumereignissen in diesen Strukturen verbessert. Es gibt mehrere Möglichkeiten, wie die Calcium-Imaging-Daten innerhalb der Bildverarbeitungspakete analysiert werden können. Führen Sie zuerst die zelluläre Signalanalyse auf dem ungemischten Kalziumfilm durch und laden Sie die interessierenden Regionen aus dem Zip-Ordner, die zuvor von Hand aus den Perizyten ausgewählt wurden.
Legen Sie den Skalierungsfaktor auf eins fest, da die Größe der Regionen nicht geändert werden muss. Erzeugen Sie nach der Verarbeitung Plots jedes ROY und der normalisierten Calciumspuren in verschiedenen Farben. Wenn der Code die Mehrheit der Calciumereignisse in den einzelnen Spuren nicht erkennt, ändern Sie die integrierten Parameter im Optimierungsfeld, z. B. verringern Sie den Schwellenwert für die kurzpassgefilterten Daten auf das Dreifache der Standardabweichung der Baseline-Periode, d. h. der ersten 30 Frames der T-Serie.
Um die Signale zu erkennen und zu klassifizieren, wird die normalisierte Calciumspur lang- und bandpassgefiltert, was hilft, die Daten für die Amplitude und mit Schätzungen zu glätten, aber auch zu bestimmen, ob Signale einzelne Peaks, Multi-Peaks oder Plateaus sind. Geben Sie die Daten als CSV-Datei zur weiteren statistischen Analyse aus. Führen Sie die zelluläre Signalanalyse ein zweites Mal auf dem ungemischten Kalziumfilm durch und wählen Sie die automatisierte Identifizierung der Region von Interesse basierend auf der Aktivität und Änderung der Fluoreszenz in drei Dimensionen, X, Y und Zeit.
Zeichnen Sie die Prozessergebnisse auf, um die identifizierten Interessenbereiche in verschiedenen Farben anzuzeigen. Wenn der Algorithmus keine ROYs erkennt, die im Film für das Auge deutlich sichtbar sind, ändern Sie die integrierten Parameter, z. B. erhöhen Sie den Gauß-Filter, der die Daten rechtzeitig glättet, und verringern Sie den Schwellenwert für das Auffinden von ROYs auf das Dreifache der Standardabweichung der Baseline. Plotten Sie die ROYs als Film zur weiteren Visualisierung.
Geben Sie die Daten als CSV-Datei zur weiteren statistischen Analyse aus. Importieren Sie die Zeilenscan-Kymograph-Datendatei in die Programmiersoftware und definieren Sie, was sich auf jedem Kanal befindet. Führen Sie die Durchmesseranalysefunktion für den Zeilenscan aus, der ein Feld öffnet, um den Bereich auszuwählen, der dem Durchmesser im Kymographen entspricht.
Zeichnen Sie eine Box außerhalb der Grenzen der Kymographen-Fluoreszenz, die dem Gefäßdurchmesser entspricht. Verarbeiten Sie diese Datenklasse, um die volle Breite bei halben Maxima für den Behälterdurchmesser zu messen und ein Diagramm zu generieren. Führen Sie als Nächstes die Geschwindigkeitsrate bei der Transformationsanalyse aus und zeichnen Sie ein Kästchen innerhalb des Randes der Kymographen-Fluoreszenz.
Verarbeiten Sie diese Datenklasse, um die Geschwindigkeit, den Fluss und die lineare Dichte der roten Blutkörperchen zu berechnen. Geben Sie die Blutflussergebnisse als CSV-Datei zur weiteren Analyse aus. Die manuelle Auswahl zellulärer Strukturen ermöglicht die Erkennung von Kalziumfluktuationen innerhalb dieser Regionen, einschließlich verschiedener Arten von Signalspitzen, wie Einzelpeaks und Multispitzen, nachdem die normalisierten Kalziumspuren Tiefpass und Bandpass gefiltert wurden.
Darüber hinaus werden interessante Bereiche identifiziert, indem aktive Pixel gruppiert werden, bei denen sich die Intensität der Fluoreszenz im Laufe der Zeit mithilfe von Bildverarbeitungsalgorithmen ändert. Dies kann auf jedes dynamische Mobilfunksignal angewendet werden, indem die Zeit,der Schwellenwert und die räumlichen Parameter angepasst werden, um die erwartete Größe und Form des Signals zu erfassen. Wenn Sie den Schwellenwert für die Signalidentifikation verringern, werden mehr Regionen von Interesse gefunden.
Klare, hämodynamische Kymographen werden analysiert, um durchmesser und rote Blutkörperchengeschwindigkeit in Blutgefäßen in der Nähe von umhüllenden Perizyten zu messen. Der Durchmesser wird aus der vollen Breite bei halbem Maximum der Leuchtstoffröhren berechnet. Die Geschwindigkeit der roten Blutkörperchen wird aus den Streifen aus nicht markierten roten Blutkörperchen angenähert, wobei der Winkel in eine Radontransformation eingegeben wird, um die Geschwindigkeit zu berechnen.
Kymographen von schlechter Qualität, bei denen eine fluoreszierende Sättigung, ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis oder eine Bewegung des Bildgebungsfeldes vorliegt, erzeugen unzuverlässige Diagramme mit Fehlerpunkten, die als rote Kreuze gekennzeichnet sind und bei denen keine Daten bestimmt werden können. Die Qualität der erfassten Daten ist entscheidend für ein gutes Ergebnis und das Befolgen der in diesem Protokoll beschriebenen Schritte gewährleistet gute Ergebnisse. In diesem Video skizzieren wir das Verfahren zur kombinierten Kalziumbildgebung von Perizyten im Gehirn und Blutflussmessungen durch Zwei-Photonen-Mikroskopie.
Diese Techniken sind nützlich, um Fragen zur Physiologie und Lokalisation von Wandzellen innerhalb des Gefäßnetzwerks des Gehirns zu beantworten, aber sie können angepasst werden, um Kalziumtransienten in jedem Zelltyp im Gehirn oder einem anderen Organsystem zu untersuchen.
