Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu beschreiben, wie die Menge und die Verteilung der Eisenablagerung im Gehirn eines AD-Mausmodells bestimmt werden kann. In diesem Protokoll verwenden wir acht Monate alte 5xFAD-transgene Mäuse als AD-Mausmodell und vergleichen sie mit gleichaltrigen Wildtyp-Mäusen. Wir enthalten Details zu den Verfahren zur Vorbereitung des chemischen Reagenzes, zum Schneiden des Gehirns, zur Durchführung der Perls/DAB-Färbung und zur Analyse der resultierenden Bilder.
Betäuben Sie die Maus richtig und überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie und Analgesie. Lege das Herz frei und schneide dann den rechten Vorhof auf. Injizieren Sie nacheinander 20 Milliliter PBS und 4 % PFA aus dem linken Ventrikel.
Beachten Sie, dass Fixationszittern beobachtet werden sollte. Enthaupte die Maus und entferne ihr Gehirn. Fixieren Sie dann das Gehirn für 12 bis 24 Stunden in 4%PFA.
Tauchen Sie das Gehirn 12 bis 24 Stunden lang in 15% und 30% Saccharose ein. Schneiden Sie das Gehirn sagittal von der Mitte ab und verwenden Sie eine der beiden Hälften zum Schneiden. Montieren Sie das Gehirn auf dem Knopf, legen Sie einen Alufolienring um das Gehirn und fügen Sie OCT hinzu, um das Gehirn einzubetten.
Stellen Sie die Dicke der Abschnitte und die Temperatur des Kryostaten ein. Dann schneide das Gehirn auf. Wenn die Abschnitte gefaltet sind, verwenden Sie weiche Bürsten, um die Abschnitte zu entfalten.
Sammeln Sie jeden Abschnitt auf den Folien mit PBS und entfernen Sie dann die Blasen auf dem Abschnitt. Wählen Sie einen Objektträger mit intaktem Hirngewebe aus und legen Sie ihn in eine mit PBS gefüllte Färbebox aus Kunststoff. Stellen Sie die Box fünf Minuten lang auf einen Rotationsschüttler, der auf eine langsame Geschwindigkeit eingestellt ist, um die restliche OCT-Masse gründlich abzuspülen.
Bereiten Sie 20 Milliliter 2%Kaliumferrocyanid und das gleiche Volumen 2%Salzsäure vor. Mischen Sie sie dann in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Befestigen Sie den Objektträger mit einer Pinzette im Röhrchen und inkubieren Sie die Mischung in einem vorgewärmten Wasserbad bei 60 Grad Celsius für 30 Minuten.
Waschen Sie den Objektträger mit PBS und wischen Sie überschüssige Flüssigkeit mit Seidenpapier ab. Legen Sie den Objektträger flach auf den Labortisch und tragen Sie mit einer Pipette sogar DAB-Lösung auf das Gewebe auf. 10 Minuten inkubieren, um die Perls-Färbung zu verbessern.
Entfernen Sie die überschüssige DAB-Lösung und spülen Sie das Taschentuch aus, indem Sie es dreimal mit PBS waschen. Dehydrieren Sie den Schnitt nacheinander in abgestuften Alkohollösungen und Xylol für jeweils drei Minuten. Decken Sie die Abschnitte mit einem neutralen Gummi und einem Deckglas ab.
Lassen Sie sie dann in einem Abzug trocknen. Schalten Sie das Mikroskop ein. Passen Sie die Helligkeit der Lichtquelle an.
Fokussieren Sie sich auf den Gehirnbereich unter einem Objektiv mit 4-facher Vergrößerung. Bewegen Sie den Mikroskoptisch, um sich auf die Bereiche mit hohen Perls/DAB-Färbesignalen zu konzentrieren, insbesondere auf den Hippocampus und die Großhirnrinde. und Bilder aufnehmen.
Öffnen Sie das Objektivbild mit 10-facher Vergrößerung, und konvertieren Sie dann das Bildformat in 8-Bit-Graustufen. Die Grauwerte des Bildes wurden in OD-Werte umgewandelt, und dann wurde die Schwellenwertfunktion verwendet, um die Perls/DAB-Färbepositiven Bereiche abzudecken. Wählen Sie die folgenden Setup-Optionen aus, und wählen Sie vor allem auf Schwellenwert begrenzen, um Hintergrundgeräusche auszuschließen.
Wählen Sie abschließend Messungen aus, um Ergebnisse für die statistische Analyse zu erhalten. Um die Verteilung und Akkumulation von Eisen in einem AD-Mausmodell zu untersuchen, führten wir eine Perls/DAB-Färbung von sagittalen Hirnschnitten durch. Hohe Perls/DAB-Signale wurden im Hippocampus und im Kortex beobachtet, insbesondere im Subiculum des Hippocampus von 5xFAD-Mäusen, während die Gehirne von zwei Monate und acht Monaten alten Wildtyp-Mäusen ein schwächeres Signal zeigten.
Unter 40 plus Vergrößerung erscheint das Signal in 5xFAD-Mäusen in A-beta-Plaque-ähnlichen Strukturen, was mit früheren Studien übereinstimmt. Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit von Perls/DAB-Standing als histochemische Technik zur Eisendetektion. Wir zeigen auch zwei Fälle von fehlgeschlagener Färbung.
In diesen Fällen führt eine übermäßige Abdeckung oder unangemessene Dehydrierung. Die Perls/DAB-Färbung bietet ein stärkeres Signal und einen besseren Hintergrundkontrast als herkömmliche Perls-Färbungen, wodurch die Eisendetektion empfindlicher und genauer wird. Darüber hinaus weist es das EisenEisen in locker gebundenen Proteinkomplexen nach.
Eisen, das wie im Hämoglobin stark gebunden ist, reagiert nicht. Dadurch werden unerwünschte Signale, die durch Eisen in den roten Blutkörperchen und Hämoglobin verursacht werden, erheblich reduziert. Insgesamt eignet sich die Perls/DAB-Färbung für Tierversuche und pathologische Untersuchungen, die eine mediale Spezifität und Sensitivität erfordern.
Es bietet Forschern eine Methode, um die Eisenakkumulation auf Kosten von weniger Zeit und Kosten zu visualisieren und zu quantifizieren.
