Diese zeitsparende Methode reduziert die Variabilität zwischen den Runden immunhistochemischer Verfahren in neurowissenschaftlichen Studien, um die Visualisierung von Anatomie und lokalen Proteinen und Geweben zu optimieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es die Zeit reduziert, die für die Kryosektion und die Aufnahme von Hirngewebe erforderlich ist, indem mehrere Gehirne zu einem einzigen gefrorenen Block kombiniert werden. Während diese Technik für koronare Abschnitte von Nagetiergehirnen optimiert ist, kann sie an sagittale oder transversale Abschnitte oder verschiedene Arten von Geweben wie Muskel oder Leber angepasst werden.
Nach erfolgreicher transkardialer Perfusion, post-fix die Gehirne von den Tieren in einer 25 Milliliter Durchstechflasche von 4%Paraformaldehyd in PBS für 24 Stunden. Danach verwenden Sie stumpf gekippte Zangen, um das Gehirn aus dem Paraformaldehyd zu entfernen. Übertragen Sie das Gehirn in eine Durchstechflasche mit ca. 20 Millilitern 30%Saccharoselösung in TBS.
Halten Sie das Gehirn und die Lösung, bis sie auf den Boden der Durchstechflasche sinken. Als nächstes legen Sie einen 500 Milliliter Glasbecher auf ein Trockeneisbett in einen Eiskübel. Dann 300 bis 400 Milliliter Isopentan in den Becher gießen.
Bewahren Sie das Isopentan zwischen negativen 45 und negativen 50 Grad Celsius. Füllen Sie auf der Bankplatte eine Einweg-Einbettform etwa halb voll mit optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Verbindung. Verwenden Sie eine Nadel, um Luftblasen aus der Form zu entfernen.
Verwenden Sie die stumpf gekippten Zangen, um das erste Gehirn aus der Saccharoselösung zu entfernen. Verwenden Sie dann eine neue Rasierklinge, um das Kleinhirn und die Olfaktor-Lampen zu entfernen, bevor Sie die Hemisphären trennen. Geben Sie als Nächstes dem Gehirn ein numerisches Benennungssystem.
Verwenden Sie stumpfe Zange, nehmen Sie das Gehirn in Position zwei platziert werden, und orientieren Sie es mit der Seite zuerst nach oben geschnitten werden. Senken Sie das Gehirn in das OCT und verwenden Sie die Pinzette, um ihre Position anzupassen, bis sie unabhängig steht. Eine wichtige Änderung dieser Technik ist der Leerraum in Position eins.
Dieser Raum ist so vorgesehen, dass die Megahirnausrichtung leicht identifiziert werden kann und somit das mit jedem Gehirn verbundene Tier identifiziert werden kann. Nachdem alle Gehirne in der Form positioniert wurden, fügen Sie genügend OCT, um die Oberseiten des Gehirns zu decken, dann verwenden Sie eine Nadel, um alle Luftblasen zu entfernen. Halten Sie die Ecke der Form mit Zangen, um sicherzustellen, dass die Zange nicht teilweise in das OCT eingetaucht wird.
Dann senken Sie die Form in das Isopentan, so dass das untere Drittel der Form untergetaucht ist. Nach 30 Sekunden die gesamte Form in das Isopentan senken und aus der Zange lösen. Nach drei Minuten verwenden Sie die Zange, um die Form aus dem Isopentan zu entfernen.
Die Form und ihren Inhalt sofort in Aluminiumfolie wickeln und entsprechend beschriften. Übertragen Sie das Megabrain für mindestens 24 Stunden in einen negativen 20 Grad Celsius Gefrierschrank. Stellen Sie zunächst die Temperatur des Kryostatschranks auf negative 19 Grad Celsius ein.
Entfernen Sie das Megabrain aus dem Gefrierschrank und legen Sie es in den Kryostat. Dann legen Sie ein Futter und zwei dünne gekippte Pinsel in den Kryostat. Danach beschriften Sie die Dias mit der Megabrain-Identifikationsnummer und der Dianummer und legen sie auf den Diawärmer.
Als nächstes, auspacken Sie das Megabrain und verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Ecken der Form zu schneiden. Geben Sie eine dünne Oct-Schicht auf das Futter. Dann legen Sie das Megabrain schnell auf das Futter.
Nachdem das OCT vollständig eingefroren ist, eine zwei Millimeter schichtoct um die Seiten des Megahirns auftragen und die Seiten auf das Futter herunterlaufen lassen. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um überschüssiges OCT von den Seiten und der Unterseite des Futters zu entfernen. Positionieren Sie zunächst das mit dem Megabrain montierte Futter auf dem Futterkopf des Kryostats.
Stellen Sie dann den Kryostat auf die gewünschte Dicke ein. Trimmen Sie das OCT und das Gewebe nach Bedarf, um die gewünschte Hirnregion für die Gewebesammlung zu erreichen. Dann senken Sie die Anti-Roll-Platte, bis sie auf der Bühne ruht und drehen Sie den Kryostatgriff, um einen einzigen Abschnitt zu nehmen.
Heben Sie langsam die Anti-Roll-Platte ab, wobei Sie darauf achten, dass der Gewebeabschnitt nicht berührt wird. Verwenden Sie die Pinsel vorsichtig, um den Gewebeabschnitt zu entrollen, bis er flach liegt. Halten Sie bei Bedarf das OCT mit den Pinseln flach, um das Rollen zu verhindern.
Entfernen Sie dann die Folie aus dem Schiebewärmer und bewegen Sie die Folienbeschriftung über den Megabrain-Abschnitt und lassen Sie sie an der Folie kleben. Wenden Sie schnell einen Tropfen PBS auf den Gewebeabschnitt an. Mit einem fein gekippten Pinsel in PBS getaucht, bürsten Sie alle Blasen im Gewebebereich und entfalten Sie das Gewebe, so dass es flach auf der Folie liegt.
Schließlich legen Sie die Rutsche auf die Rutsche wärmer, um für 45 Minuten trocknen und speichern Sie die Rutsche bei negativen 80 Grad Celsius. In diesem Protokoll wurde Hirngewebe von neun Tieren gleichzeitig vorbereitet und kryosectioniert. Nach dem Kryosektionen kann die H&E-Färbung durchgeführt werden, um die Kryoschutzqualität zu bewerten.
Repräsentative Ergebnisse des ionisierten Kalziumbindungsadaptermoleküls einoder Iba1 Färbung von Mikroglia zeigen konsistente Färbung zwischen jedem Studienhirn auf einem einzigen Megahirn. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, ständig die Temperatur zu überwachen, während das Megabrain einfriert, um Risse oder Auftauen zu verhindern und dann das Gewebe wieder einzufrieren, was zu einer abnormalen Gewebeintegrität führt. Es wird nicht empfohlen, verschiedene Behandlungsgruppen in separaten Megahirnen zu trennen, da dies Varianz zwischen Gruppen während der Färbung erzeugen und Voreingenommenheit und Subjektivität während der Bildgebung und Analyse reduzieren kann.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von PBE und das Arbeiten in einer Kapuze sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
