Die CAR-T-Zelltherapie hat bei der Behandlung bestimmter pathologischer Krebsarten beispiellose Erfolge erzielt. In dieser Studie haben wir einen nicht-viralen, langintegrierenden Ansatz zur Erzeugung transienter CAR-T-Zellen eingeführt und gezielte Verfahren zur Beurteilung der Funktion von CAR-T-Zellen bereitgestellt. Unsere Forschung zielt darauf ab, sichere und wirksame CAR-T-Zellen auf kosteneffizientere Weise zu erzeugen.
CAR-T-Zellen werden typischerweise durch virale Transduktion erzeugt. Retroviren und Antiviren sind die häufigsten viralen Vektoren für die Übertragung von CAR-Genen. Die Herstellung viraler Vektoren ist komplex und kostspielig, und die virale Transduktion induziert eine zufällige und dauerhafte CAR-kodierende DNA-Integration in das T-Zell-Genom, was zu Sicherheitsbedenken führen kann.
Unser Protokoll bietet einen nicht-viralen Ansatz zur Erzeugung von CAR-T-Zellen, die CAR nur transitiv exprimieren. Bei dieser Methode wird mRNA für die CAR-Expression verwendet und die mRNA durch Elektroporation in T-Zellen gebracht. Dadurch ist das T-Zell-Genom nicht in das T-Zell-Genom integriert, und die Herstellungsverfahren sind einfacher und kostengünstiger.
Zu Beginn linearisieren Sie die CAR-Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BGL2 und führen ein Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-DNA-Extraktionsverfahren durch. Überprüfen Sie nach der Aufreinigung der linearisierten DNA die Größe und Integrität des Templates mit Agarose-Gelelektrophorese. Für die In-vitro-Transkription mischen Sie die Reaktionskomponenten und inkubieren das Reaktionsgemisch mindestens zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Nach der Transkription fügen Sie der Reaktion zwei Mikroliter Ribonuklease III, DNase I hinzu. Vorsichtig mischen und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die Template-DNA abzubauen. Reinigen Sie die transkribierte CAR-MRNA mit einem RNA-Cleanup-Kit und verdünnen Sie sie in nukleasefreiem Wasser.
Messen Sie die mRNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer, bevor Sie sie bei minus 80 Grad Celsius lagern. Tauen Sie die in vitro transkribierte und gereinigte car-mRNA-Probe auf Eis auf. Suspendieren Sie eins mal 10 hoch der Potenz von sechs kryokonservierten mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes in einem Milliliter CAR-T-Medium.
Um die T-Zellen zu aktivieren, fügen Sie die gleiche Anzahl vorgewaschener humaner T-Aktivator-CD3/CD28-Kügelchen hinzu. Kultivieren und expandieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid für mehrere Tage. Geben Sie einen Milliliter CAR T Medium pro Vertiefung in zwei Vertiefungen einer 12-Well-Platte und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius zur Äquilibrierung.
Übertragen Sie nun fünf mal 10 hoch sechs T-Zellen in ein steriles Röhrchen. Um die CD3/CD28-Kügelchen zu entfernen, stellen Sie das Röhrchen auf einen Magnetständer und pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig in ein neues Röhrchen. Das Röhrchen wird bei 300 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Zellpellet in einem Milliliter sterilem PBS resuspendiert. Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikrolitern Neonpuffer T. Mischen Sie fünf Mikrogramm CAR MNA, verdünnt im Neonpuffer T, und 100 Mikroliter Zellen in einem Gesamtvolumen von 125 Mikrolitern. Geben Sie 25 Mikroliter Neonpuffer T zu den restlichen 100 Mikrolitern Zellen, der als Negativkontrolle dient.
Stellen Sie das Neon-Elektroporationssystem auf 1.800 Volt, 10 Millisekunden und einen einzelnen Impuls ein. Verwenden Sie die Neon-Pipette, um das CAR-mRNA-Gemisch der T-Zellen in eine Neon-Spitze mit 100 Mikrolitern zu aspirieren und die Zellen zu elektropolieren. Übertragen Sie die elektroporierten Zellen sofort in das äquilibrierte Kulturmedium in der 12-Well-Platte und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator, um die Zellen bis zur Gebrauchsbereitschaft zu expandieren.
Entnahme der mit CAR-mRNA transfizierten T-Zellen für die durchflusszytometrische Analyse bereits sechs Stunden nach der Elektroporation. Mischen Sie die CAR-T-Zellen mehrmals mit einer Pipette und geben Sie mindestens einmal 10 hoch fünf Zellen in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS). Geben Sie drei Milliliter Kaltwaschpuffer in das Röhrchen und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.
Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Zellpellet in 100 Mikrolitern Waschpuffer resuspendiert. Geben Sie zwei Mikroliter fluoreszenzmarkierten Nachweisantikörper und sieben AAD-Viabilitätsfarbstoffe zu den suspendierten Zellen. Mischen Sie die Probe und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis, vermeiden Sie Lichteinwirkung, waschen Sie dann die Zellen mit drei Millilitern Kaltwaschpuffer und zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut bei 500 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Waschpuffer und analysieren Sie die Zellen sofort mit einem Durchflusszytometer. Entfernen Sie das Medium von den Tumorzellen, die das CAR-Antigen auf der Zelloberfläche exprimieren. Nach dem Waschen der Zellen mit PBS inkubieren Sie sie eine Minute lang bei 37 Grad Celsius mit einem Milliliter 0,05%iger Trypsin-EDTA-Lösung, dann bereiten Sie eine Einzelzellsuspension in dem entsprechenden Kulturmedium bei einer Dichte von ein- bis fünfmal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter her.
Geben Sie anschließend 50 Mikroliter vorgewärmtes Tumorzellkulturmedium auf die E-Platte und legen Sie es in ein Echtzeit-Zellanalyse- oder RTCA-Instrument, um die Hintergrundimpedanz zu messen, fügen Sie dann 100 Mikroliter der Tumorzellsuspension in jede Vertiefung hinzu und äquilibrieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Setzen Sie die E-Platte wieder in das RTCA-Gerät ein und überwachen Sie den Zellindex 24 Stunden lang, wobei alle fünf bis 15 Minuten Messungen durchgeführt werden. Bereiten Sie am nächsten Tag die CAR-T-Zell-Suspension vor.
Pausieren Sie die Zellindexaufzeichnung und entfernen Sie die E-Platte aus dem RTCA-Instrument. Kippen Sie die Platte leicht und entnehmen Sie vorsichtig 50 Mikroliter Kulturmedium aus jeder Vertiefung, ohne die Tumorzellen zu stören, und geben Sie dann 100 Mikroliter CAR-T-Zellen oder Kontroll-T-Zellen in jede Vertiefung. Setzen Sie das E-Kennzeichen wieder in das RTCA-Gerät ein und setzen Sie die Überwachung des Zellindex für mindestens 24 Stunden fort, wobei alle fünf bis 15 Minuten Sweeps durchgeführt werden.
Stoppen Sie die Überwachung des Zellindex und analysieren Sie das Zytotoxizitätsergebnis. Für die Analyse der Zytokinsekretion übertragen Sie den Überstand aus jeder Vertiefung in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden oder V-förmig. Die 96-Well-Platte wird fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 g zentrifugiert und die Überstände vorsichtig in eine neue 96-Well-Platte überführt.
Messen Sie abschließend die Zytokinspiegel in den Überständen mit kommerziellen ELISA-Kits. Die CAR-mRNA-Sequenz wurde durch Gelelektrophorese auf eine Größe von etwa zwei Kilobasen validiert. Über 50 % der aktivierten T-Zellen exprimierten das CAR am ersten Tag nach der Elektroporation, am zweiten Tag stieg es auf über 70 %, bevor es bis zum fünften Tag auf etwa 10 % sank.
CAR-T-Zellen zeigten eine signifikante Zytotoxizität gegen HER2-positive SK-OV-3-Tumorzellen, was sich in einer starken Verringerung der Tumorimpedanz zeigte, während Kontroll-T-Zellen eine minimale Wirkung zeigten. Hohe Konzentrationen der Interferon-Gamma-Sekretion wurden im CAR-T-Zellkulturmedium nachgewiesen, nicht jedoch in der Kontrollgruppe.
