Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur Verwendung des Minigens E1A2 zur Bewertung globaler mRNA-Spleißänderungen bereitzustellen. Dies ist ein schnelles, kostengünstiges und einfaches Werkzeug zur Beurteilung der Funktion des Zielproteins bei der alternativen Spleißregulation, ohne dass spezielle Regime oder Laborbedingungen erforderlich sind. Beginnen Sie mit der Kultivierung von HEK 293-Zellen mit stabiler Expression des interessierenden Gens.
Teilen Sie die Zellen mit 0,25% Trypsin EDTA, dann platten Sie 300.000 Zellen pro Vertiefung in Sechs-Well-Platten und inkubieren Sie sie für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Überprüfen Sie nach 24 Stunden den Zusammenfluss und transfizieren Sie HEK 293 stabile Zellen nur, wenn 70 bis 80% konfluent sind. Entfernen Sie vorsichtig das Zellkulturmedium mit einer Pipette, fügen Sie dann zwei Milliliter vollständiges DMEM-Medium ohne Antibiotika hinzu und legen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
Bereiten Sie ein Röhrchen mit dem Transfektionspuffer vor, fügen Sie dann zwei Mikrogramm pMTE1A-DNA, Wirbel und zwei Mikroliter Transfektionsreagenz hinzu. Erneut Wirbel und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und fügen Sie die Transfektionsmischung vorsichtig tropfenweise hinzu.
Sechs Stunden nach der Transfektion wird Tetracyclin zu den stabilen HEK 293-Zellen für die Nek4-Expressionsinduktion hinzugefügt. Überprüfen Sie 24 Stunden nach der Transfektion die Zellmorphologie und Transfektionseffizienz mit einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie eine Pipette, um das Zellkulturmedium zu entfernen, und fügen Sie dann Zellkulturmedium mit den Chemotherapeutika hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. Um RNA zu sammeln, verwerfen Sie das Zellkulturmedium und fügen Sie 0,5 bis 1 Milliliter RNA-Extraktionsreagenz direkt in den Brunnen hinzu. Wenn Brunnen sehr konfluent sind, verwenden Sie einen Milliliter RNA-Extraktionsreagenz, um die RNA-Qualität zu verbessern.
Homogenisieren Sie die Zellen mit einer Pipette und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen über. Fahren Sie sofort mit der RNA-Extraktion fort oder lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius. Die Proben in einem Abzug auftauen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Fügen Sie 0,1 bis 0,2 Milliliter Chloroform hinzu und rühren Sie kräftig, dann drei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie für 15 Minuten bei 12.000 mal G und vier Grad Celsius, sammeln Sie dann die obere wässrige Phase und übertragen Sie sie in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr. Sammeln Sie etwa 60% des Gesamtvolumens, aber sammeln Sie nicht die DNA oder die organische Phase.
Fügen Sie 0,25 bis 0,5 Milliliter Isopropanol hinzu und rühren Sie die Probe viermal durch Inversion. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann bei 12.000 mal G 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Waschen Sie das RNA-Pellet zweimal mit Ethanol und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 7.500 mal G und entsorgen Sie es dann.
Entfernen Sie überschüssiges Ethanol, indem Sie das Röhrchen auf einem Papiertuch umkehren, und lassen Sie das Rohr dann in einem Abzug offen, um das Pellet fünf bis 10 Minuten lang teilweise zu trocknen. Suspendieren Sie das RNA-Pellet in 15 Mikrolitern DEPC-behandeltem Wasser. Quantifizieren Sie die Gesamt-RNA und verifizieren Sie die RNA-Qualität, indem Sie die Absorption bei 230, 260 und 280 Nanometern messen.
Um die Gesamt-RNA-Qualität zu überprüfen, führen Sie 30 Minuten lang ein 1% Agarose-Gel aus, das mit 1,2% einer 2,5% igen Natriumhypochloritlösung vorbehandelt wurde. Führen Sie die cDNA-Synthese mit ein bis zwei Mikrogramm Gesamt-RNA durch. Kombinieren Sie RNA, einen Mikroliter Oligo d-T, einen Mikroliter DNTP und nukleasefreies Wasser zu 12 Mikrolitern.
Inkubieren Sie die Reaktion im Thermo Cycler fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Entfernen Sie Proben aus dem Thermo Cycler und fügen Sie vier Mikroliter Reverse Transkriptase-Puffer, zwei Mikroliter DTT und ein Mikroliter Ribonuklease-Inhibitor hinzu. Bei 37 Grad Celsius zwei Minuten lang inkubieren.
Fügen Sie einen Mikroliter thermostabile Reverse Transkriptase hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 50 Minuten. Inaktivieren Sie das Enzym bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten. Führen Sie die PCR wie im Textmanuskript beschrieben durch, laden Sie dann 20 bis 25 Mikroliter des PCR-Produkts auf ein 3%iges Agarosegel, das Nukleinsäurefleck enthält, und führen Sie es etwa eine Stunde lang mit 100 Volt aus.
Fotografieren Sie das Gel, vermeiden Sie eine Bandsättigung und quantifizieren Sie die Bänder mit einer Bildverarbeitungssoftware. Die Bänder bei 631, 493 und 156 Basenpaaren entsprechen den Isoformen 13S, 12S und 9S. Öffnen Sie im Menü Datei der Software die Bilddatei und konvertieren Sie sie in Graustufen.
Passen Sie Helligkeit und Kontrast an und entfernen Sie bei Bedarf Ausreißerrauschen. Zeichnen Sie mit dem Rechteckauswahlwerkzeug ein Rechteck um die erste Spur, und wählen Sie es mit den Befehlen Analysieren, Gele und Erste Spur auswählen oder mithilfe der Tastenkombination aus. Klicken und halten Sie mit der Maus in der Mitte des Rechtecks auf der ersten Spur und ziehen Sie es auf die nächste Spur.
Gehen Sie zu Analysieren, Gele und Wählen Sie Nächste Spur aus. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle verbleibenden Fahrspuren. Nachdem alle Lanes hervorgehoben und nummeriert wurden, wechseln Sie zu Analyze, Gels und Plot Lanes, um ein Profildiagramm für jede Lane zu zeichnen.
Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug für gerade Linien, um eine Linie über die Basis jedes Peaks zu zeichnen, die jedem Band entspricht, wobei das Hintergrundrauschen weggelassen wird. Nachdem alle Spitzen von jeder Spur gesperrt wurden, wählen Sie das Zauberstabwerkzeug und klicken Sie in jede Spitze. Messungen sollten im Ergebnisfenster für jeden hervorgehobenen Peak angezeigt werden.
Betrachten Sie nur die 13S-, 12S- und 9S-Peaks, die den Basenpaarbändern 631, 493 und 156 entsprechen. Kopieren Sie Intensitätsdaten für einen Tabellenkalkulationseditor, summieren Sie die Intensität aus allen drei Bändern für jede Stichprobe, und berechnen Sie dann den Prozentsatz für jede Isoform relativ zur Gesamtsumme. Zeichnen Sie die Prozentsätze jeder Isoform oder die Unterschiede im Prozentsatz relativ zu den unbehandelten Proben auf.
Ein Plasmid, das das Minigen aus E1A enthielt, wurde verwendet, um die Wirkung auf das alternative Spleißen zu beobachten, indem der Anteil an mRNA aus jeder produzierten Isoform bewertet wurde. Die basale Expression von E1A-Isoformen-Varianten hing von der Zelllinie und dem Zeitpunkt der E1A-Expression ab. Die stabile HeK 293-Zelllinie oder HEK 293-Rekombinase-haltige Stelle zeigte eine höhere Expression von 13S im Vergleich zu HeLa-Zellen, zeigte jedoch nach 48 Stunden E1A-Expression ähnliche Konzentrationen von 13S- und 12S-Isoformen.
Zellen, die Cisplatin ausgesetzt waren, zeigten eine Verschiebung in der Selektion von fünf Primzahlen von S-S-Spleißen, die die 12S-Expression begünstigten. Dieser Effekt wurde in HEK 293 beobachtet, das den leeren Flag-Vektor stabil ausdrückte, sowie die Isoform eines von Nek4. Veränderungen im alternativen Spleißen nach der Paclitaxel-Behandlung waren sehr diskret, aber die Richtungen der Veränderungen waren in Flag- und Nek4-exprimierenden Zellen entgegengesetzt.
Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, nicht transfizierte und nicht-reverse Transkriptase-Kontrollen zu verwenden, um Fehlinterpretationen mit endogener E1A-Expression zu vermeiden, hauptsächlich bei der Verwendung von HEK 293-Zellen. Nach Erhalt positiver Ergebnisse kann das alternative Spleißen bestimmter Gene im Zusammenhang mit dem chemotherapeutischen Ansprechen bewertet werden. Wenn ein Effekt beobachtet wird, kann dieses einfache Protokoll diese Studien für konsistentere Wege lenken, bei denen das Protein eine Rolle bei der Regulierung des alternativen Spleißens spielt, zum Beispiel bei der Chemotherapie.
