Die Ernte exosomenangereichertes konditioniertes Medium aus Zellen, die in Bioreaktorkolben kultiviert werden, und Isolierung durch Saccharosekissen-Ultrazentrifugation führen zu einer exosomen Vorbereitung hoher Ausbeute mit minimalen kontaminierenden Proteinen oder nicht-exosomalen Vesikeln. Die Verwendung eines einzigen Saccharosekissens, das in Deuteriumoxid hergestellt wird, umgeht die mühsame Vorbereitung eines diskontinuierlichen Saccharosegradienten und reduziert die Menge an Saccharose, die benötigt wird, um die erforderliche Dichte zu erreichen. Die effektive In-vitro-Abgabe von SiRNA-Verkapselung in Exosomen, die in diesem Protokoll hergestellt werden, unterstreicht das Potenzial dieses Systems als RNA-Interferenztherapie der neuen Generation für Bauchspeicheldrüsenkrebs.
Zu Beginn, Kultur HEK-293 Zellen in normalen Medium, wie in der Handschrift beschrieben. Erweitern Sie die Zellen in vier T75-Flaschen und wachsen Sie, bis sie 90 % Konfluenz erreichen. Um einen Bioreaktorkolben vorzubereiten, fügen Sie 50 bis 100 Milliliter normales Medium in das mittlere Reservoir des Bioreaktorkolbens ein, um die Membran zu befeuchten.
Sammeln Sie alle HEK-293-Zellen aus den vier T75-Flaschen und setzen Sie sie in 15 Milliliter exosomen-erschöpftem Medium in einem Zentrifugenrohr wieder aus. Verwenden Sie dann eine 20-Milliliter-Spritze, die mit einer stumpfen Füllnadel verbunden ist, um diese Zellsuspension vorsichtig in das Zellfach des Bioreaktorkolbens einzutragen. Dann füllen Sie das mittlere Reservoir des Bioreaktorkolbens mit dem normalen Medium, bis zu 500 Milliliter, und bebrüten es bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 für eine Woche.
Entfernen Sie nach einer Woche Inkubation das gesamte Medium aus dem mittleren Reservoir des Bioreaktorkolbens, indem Sie ihn ausgießen. Entfernen Sie mit einer 20-Milliliter-Spritze, die mit einer stumpfen Füllnadel verbunden ist, das gesamte Medium aus dem Zellfach. Dann fügen Sie 50 bis 100 Milliliter normales Medium in das mittlere Reservoir und 15 Milliliter frisches exosomen-erschöpftes Medium mit einer 20-Milliliter-Spritze, die mit einer stumpfen Füllnadel verbunden ist, in das Zellfach ein.
Dann füllen Sie das mittlere Reservoir des Bioreaktorkolbens mit einem normalen Medium bis zu 500 Millilitern. Inkubieren bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 für eine weitere Woche. Um das gesammelte konditionierte Medium vorab zu klären, zentrieren Sie es bei 500 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Übertragen Sie den Überstand in ein neues Rohr und entsorgen Sie das Pellet. Nachdem Sie diesen Zentrifugationsschritt mit dem wiedergewonnenen Überstand wiederholt haben, den Überstand wiedererlangen und das Pellet entsorgen. Dann zentrifugieren Sie den wiedergewonnenen Überstand bei 2.000 mal g für 15 Minuten und vier Grad Celsius.
Halten Sie den Überstand, und entsorgen Sie das Pellet. Filtern Sie den Überstand einmal durch einen 22-Mikrometer-Filter, der an einer 20-Milliliter-Spritze befestigt ist, in ein frisches Zentrifugenrohr. Um eine 25%Saccharose-Lösung in Deuteriumoxid herzustellen, wiegen Sie in der Zwischenzeit 1,9 Gramm Saccharose in einem Universalrohr genau aus.
Fügen Sie dann Deuteriumoxid hinzu, bis das Gewicht 7,6 Gramm erreicht. Dann füllen Sie ein Ultrazentrifugenrohr mit 22,5 Millilitervorgereinigtem konditioniertem Medium. Legen Sie eine Glaspipette in das Rohr.
Fügen Sie drei Milliliter Saccharoselösung durch die Pipette, so dass die Lösung bildet eine separate Schicht unter dem konditionierten Medium. Das Rohr mit geschichteter konditionierter Mittel-/Saccharoselösung vorsichtig in den Eimer eines ausschwenkenden Rotors legen. Sichern Sie den Eimer in den Rotor.
Legen Sie den Rotor in die Ultrazentrifuge und drehen Sie bei 100.000 mal g bei vier Grad Celsius 1,5 Stunden. Sammeln Sie zwei Milliliter der Saccharoseschicht aus dem Rohr, jeweils einen Milliliter mit einer P1000 Pipette, deren Spitze an einer 10-Mikroliter-Spitze befestigt ist, und fügen Sie sie einer Ultrazentrifugenflasche mit 20 Millilitergefilterten PBS zum Waschen hinzu. Legen Sie das Rohr in einen Festwinkelrotor und zentrieren Sie es 1,5 Stunden lang bei 100.000 mal g bei vier Grad Celsius.
Verwenden Sie eine 10-Milliliter serologische Pipette, um den Überstand sorgfältig zu entfernen. Setzen Sie das Pellet mit 400 Mikrolitergefiltertem PBS wieder auf. Vor Beginn der Elektroporation die Elektroporationsküvette 30 Minuten lang auf Eis vorkühlen.
Mischen Sie sieben Mikrogramm Exosomen mit 33 Mikrogramm siRNA in der Mikrozentrifugenröhre. Fügen Sie Zitronensäurepuffer hinzu, um das Volumen von 150 Mikrolitern zu erreichen. Fügen Sie die Exosome-siRNA-Mischung mit einer Kunststoffpipette in die Elektroporationsküvette ein und verkappen Sie die Küvette.
Legen Sie die Küvette in die richtige Ausrichtung in den Küvettenhalter des Elektroporators und drehen Sie das Drehrad des Elektroporators um 180 Grad im Uhrzeigersinn. Wählen Sie das gewünschte Programm aus, und drücken Sie die Starttaste, um die Elektroporation zu starten. Das Display zeigt einen erfolgreichen Impuls an.
Drehen Sie dann das Rad um 180 Grad gegen den Uhrzeigersinn zurück, und entfernen Sie die Küvette. Verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um die Probe aus der Küvette in ein neues Mikrozentrifugenrohr zu entfernen. Halten Sie die Röhre vor der Weiterverarbeitung auf Eis oder im Kühlschrank auf, wenn sie nicht sofort verwendet wird.
Um die kostenlose siRNA-Entfernung zu starten, geben Sie 3,5 Milliliter gefilterten PBS zweimal durch die Spalte Größenausschlusschromatographie, um sie auszugrenzen. Lösen Sie dann 150 Mikroliter elektroporated Probe in 350 Mikroliter gefilterten PBS, und übertragen Sie es in die SEC-Säule. Sammeln Sie die erste 500-Mikroliter-Fraktion, die aus der Säule eluiert wird, in ein Mikrofugenrohr und markieren Sie sie als F0. Fügen Sie dann 500 Mikroliter gefilterter PBS zur Spalte hinzu.
Sammeln Sie den nächsten Bruch, und markieren Sie ihn als F1. Wiederholen Sie das Hinzufügen des PBS und das Sammeln von Elutionsfraktionen, bis insgesamt 10 500-Mikroliter-Fraktionen oder bis zu F9 gesammelt werden. Um schließlich Probenrückstände zu entfernen, waschen Sie die Säule mindestens zweimal mit gefiltertem PBS, und setzen Sie dann die Experimente fort, wie im Manuskript beschrieben. Morphologische Analysen mittels Transmissionselektronenmikroskopie zeigten, dass HEK-293-Exosomen kugelförmige Strukturen waren, die etwas größer als 100 Nanometer waren.
Dieses Ergebnis stimmt mit dem von der Nanopartikel-Tracking-Analyse-Messung überein, die auch die Größenverteilung der Exosomen zeigte. Darüber hinaus waren sie positiv für die exosomalen Marker CD81, CD9 und CD63. Die prozentuale Wiederherstellung von Exosomen, die mittels Größenausschlusschromatographie gereinigt wurden, und die prozentuale Wiederherstellung von siRNA wurden wie im Manuskript beschrieben berechnet.
Die nach-Reinigungs-Wiederherstellung von Exosomen betrug 75%Mit der siRNA-Standardkurve wurde die Verkapselungseffizienz von siRNA in Exosomen berechnet, um etwa 10 bis 20% qualitative Analyse der In-vitro-Aufnahme von Exosomen, die mit fluoreszierendem Atto655-siRNA belastet sind, zu sein, dass PANC-1-Zellen, die mit siRNA-verkapselten Exosomen behandelt wurden, die größte Verschiebung im Fluoreszenzsignal hatten. Dies wurde durch die Feststellung bestätigt, dass PANC-1-Zellen, die mit siRNA-verkapselten Exosomen behandelt wurden, einen höheren Prozentsatz der Population positiv für das Atto655-Signal aufwiesen als die mit unbelasteten Exosomen und siRNA-Gemisch behandelten. Die zelluläre Aufnahme von siRNA war auch bei PANC-1-Zellen, die mit siRNA-verkapselten Exosomen behandelt wurden, signifikant höher als bei der mit dem Exosomen-SiRNA-Gemisch behandelten, was bestätigt, dass die siRNA-verkapselten Exosomen von den PANC-1-Zellen internalisiert wurden und dass sie die siRNA intrazellulär effektiv liefern.
Es ist wichtig, Saccharose und Deuteriumoxid bei der Herstellung der Saccharoselösung sehr genau zu wiegen und immer eine frisch zubereitete Saccharoselösung zu verwenden, um Dichteveränderungen während der Lagerung zu vermeiden. Die konfokale Mikroskopie kann durchgeführt werden, um die Internalisierung von siRNA, die in den Exosomen eingekapselt ist, in Zellen weiter zu validieren und den intrazellulären Handel nach zellulärer Aufnahme zu untersuchen. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, den genspezifischen Knockdown von siRNA durch Exosome zu bewerten und dient als Werkzeug für die neue Zielvalidierung in der RNA-Interferenz-basierten Krebstherapie.
