Screening kleiner Moleküle und Toxizitätstests an Zebrafischlarven im Frühstadium

Sammeln Sie zunächst drei Tage nach der Befruchtung Zebrafischembryonen im Frühstadium in einer Petrischale. Mit einer 1000-Mikroliter-Mikropipette, die auf ein Volumen von 100 Mikrolitern eingestellt ist, übertragen Sie einen gesund aussehenden geschlüpften Embryo in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Pipettieren Sie nun die erforderliche Menge der Testchemikalie in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte.

Stellen Sie dann das Gesamtvolumen mit E3-Medium auf 2,4 Milliliter ein. Bereiten Sie die Fahrzeugsteuerung entsprechend dem Lösungsmittel vor, das zum Auflösen der Stammprüfchemikalie verwendet wird. Entfernen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette alle vorhandenen E3-Lösungen aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte.

Verwenden Sie eine Achtkanal-Mikropipette, um sie durch 100 Mikroliter des vorbereiteten Prüfmediums für jede Konzentration zu ersetzen. Es ist darauf zu achten, dass insgesamt 24 Larven pro Konzentration getestet werden. Verwenden Sie nach 24 Stunden ein Stereolichtmikroskop, um eine morphologische Bewertung durchzuführen.

Bewerten Sie die Morphologie mit einer binären Methode, wobei nicht vorhanden auf eine normale Morphologie und vorhanden auf eine morphologische Anomalie hinweist. Wenn das Ritzen abgeschlossen ist, entfernen Sie 50 Mikroliter des Mediums aus jeder Vertiefung. Ersetzen Sie es durch 50 Mikroliter frisch zubereitetes Prüfmedium.

Entfernen und erfassen Sie alle toten Larven und inkubieren Sie die Larven bei 28,5 Grad Celsius mit einem 14-stündigen Licht- und 10-stündigen Dunkelzyklus. Zebrafische zeigten fünf Tage nach der Befruchtung nach zweitägiger Medikamentenexposition unterschiedliche Phänotypen. Nicht betroffene Zebrafische wurden normal beobachtet, während bei einigen Fischen ein leichtes Perikardödem auftrat.

Bei anderen wurde ein schweres Perikardödem, begleitet von Dotterblutungen und Dotterausdehnung, festgestellt. Eine verzögerte Entwicklung mit reduzierter Pigmentierung, Schwimmblase und Gesamtlänge wurde ebenfalls beobachtet. Weitere Phänotypen waren Zebrafische mit geschwollenem Eigelb und geknickter Schwanzflosse, fehlender Schwanzflosse und gekrümmter Chord.

In schweren Fällen kam es zu einer Verkürzung und zum Tod mit Nekrose.