XHP wurde von National Institute of Health (NIH) Zuschüsse aus National Institute on Aging (NIHK01AG024496) und The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530) unterstützt.

1. Lösungs-und Medien-Vorbereitung <ol><li> Gelatin Beschichtungslösung: 0,1% (w / v) Gelatine in ddH 2 O, autoklaviert und bei 4 ° C. </li><li> Matrigel Beschichtungslösungen. Stammlösung: langsam auftauen Matrigel (10 ml) bei 4 ° C über Nacht, 10 ml eiskaltem DMEM oder DMEM/F12, gut mischen und aliquoten 1 ml / Rohr unter sterilisiert Gewebekultur Kapuze, lagern bei -20 ° C. Working-Lösung: langsam auftauen 1 ml Matrigel Aliquot bei 4 ° C für 1-2 Stunden, Transfer zum 14 ml gekühltes DMEM oder DMEM/F12 und gut mischen unter sterilisiert Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung. </li><li> Menschliche Laminin Beschichtungslösung: Verdünnen Sie 1 ml menschlichen Laminin-Lösung (0,5 mg / ml in Tris Buffered NaCl, Lagerung bei -80 ° C, langsam auftauen bei 4 ° C für 1-2 Stunden) mit eiskaltem DMEM oder DMEM/F12 zu 12,5 ml Arbeitslösung (40 ug / ml) unter sterilisiert Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung. </li><li> Wachstumsfaktor Stammlösungen (500-1000X): Man löst growth factor bei 10 ug/ Ml in sterilisierte Puffer (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% Glycerin, 1XPBS) und speichern als 50-100 &amp;mgr; l / Röhrchen aliquotiert bei -80 ° C. </li><li> HESC Medien: DMEM/F12 oder KO-DMEM (80%), KO Serumersatz (20%), L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM), MEM nicht essentielle Aminosäuren (MNAA, 1X) und β-Mercaptoethanol (100 uM), filtriert und bei 4 ° C mit 20 ng / ml bFGF vor der Verwendung ergänzt. Oder ersetzen Sie &quot;KO-Serum-Ersatz&quot; mit definierten Komponenten: DMEM/F12 oder KO-DMEM (100%), L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM), MNAA (1X), MEM essentiellen Aminosäuren (MEAA , 1X) und β-Mercaptoethanol (100 uM), filtriert und bei 4 ° C, mit bFGF (20 ng / ml) ergänzt, Humaninsulin (20 ug / ml), Ascorbinsäure (50 ug / ml), die menschliche Aktivin A (50 ng / ml), Humanalbumin / Albumax (10 mg / ml), und menschliches Transferrin (8 pg / ml) vor der Verwendung. </li><li> HESC kardialen Differenzierung Medien: DMEM/F12 (90%), definiert FBS (10%) und L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM). </li><li> Medien mit Nicotinamid (NAM): add NUhr bis HESC Medien oder HESC kardialen Differenzierung Medien Endkonzentration von 10 mM, gefiltert, lagern bei 4 ° C und innerhalb von 2 Wochen der Vorbereitung. </li></ol> 2. Plattenbeschichtung <ol><li> Coat-Platten mit Gelatine: 2,5 ml / well der Gelatine-Lösung bis 6-Well-Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator. </li><li> Coat-Platten mit Laminin: chill Gelatine beschichteten Platten und entfernen Gelatine, 2,5 ml / well Matrigel oder menschliche Laminin-Beschichtung funktionierende Lösung zu vorgekühlte verkleistert 6-Well-Platten und Inkubation bei 4 ° C über Nacht. </li></ol> 3. Passagieren und Seeding Undifferenzierte hESCs unter definierten Bedingungen <ol><li> Lassen hESC Kolonien wachsen auf 5-7 Tage alt, und nehmen Sie hESC Kultur Platte Präpariermikroskop (pre-warm Sezieren der Bühne bis 37 ° C) unter Sezieren sterilisiert Kapuze. </li><li> Wählen Sie hESC Kolonien aufgeteilt werden. Morphologisch sind diese Kolonien&gt; 75% undifferenzierte hES (smalle Kompakt-Zellen), in der Regel leicht opak (nicht weißen aufgehäuften Zellen nicht klar differenzierten Zellen) mit definierten Rand unter dem Binokular. Vorsichtig einen Überblick über die ausgewählten Kolonien und entfernen differenzierten Fibroblasten-Schicht rund um die Kolonie und alle differenzierten Teile (falls vorhanden) der Kolonie mit der Schärfe des P2 sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. </li><li> Entfernen Sie die alten Medien mit schwimmenden freistehende differenzierten Zellen durch Absaugen. Waschen mit hESC Medien (ohne bFGF) einmal. 3 ml / well frisches hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF. </li><li> Schneiden Sie die undifferenzierte hES-Kolonien in kleine Stücke, und lösen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. </li><li> Pool der Medien, die losgelöst Kolonie Stücke zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte einmal mit 1 ml / well hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und Pool zusammen. </li><li> Saugen Sie das Matrigel oder menschliche Laminin-Lösung von dem beschichteten frischen Platten. Aliquot 4 ml / well hESC-haltigen Medien Kolonie Stücke zu einer 6-Well-Platte. Gently Transfer der Platte Inkubator ohne Schütteln und lassen Kolonie Stücke Samen über Nacht, ohne zu stören in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. </li></ol> 4. Cardiac Induktion von hESCs unter definierten Kultur-System mit Nicotinamid <ol><li> Am Tag 3 nach der Aussaat, die Abschaffung der meisten alten Medien aus jedem Well der Platte und lassen genug Medien zu ermöglichen hESC Kolonien unter Wasser (niemals zulassen hESCs austrocknen) werden. Ersetzen mit 4 ml / well frisches hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und 10 mM Nicotinamid (NAM). </li><li> Ersetzen Sie die alten Medien mit frischen hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und 10 mM NAM jeden zweiten Tag, und lassen Sie Herz-induzierten embryonalen Stammzellen Kolonien wachsen zu Tag 8-10. Nach Belichtung mit NAM, werden alle Zellen innerhalb der Kolonie zu unterziehen Morphologie Änderungen an großen differenzierten Zellen, die auch weiterhin vermehren wird. Die Kolonien werden in Größe und von Tag 8-10 zu erhöhen, eind-Zellen beginnen, häufen sich in einigen Gebieten der Kolonien. </li></ol> 5. Continuing Cardiac Differenzierung in Suspensionskultur <ol><li> Nehmen hESC Kultur Platte Präpariermikroskop (pre-warm Sezieren der Bühne bis 37 ° C) unter Sezieren sterilisiert Kapuze. Vorsichtig einen Überblick über die Kolonien und entfernen Fibroblasten-Schicht rund um die Kolonie (differenzierte Zellen aus der Kolonie eingewandert) mit dem Rand des P2 sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. </li><li> Entfernen Sie die alten Medien mit schwimmenden freistehende Fibroblasten-Zellen durch Absaugen. Waschen mit hESC Medien (ohne bFGF) einmal. 3 ml / well frisches hESC Medien (ohne bFGF). </li><li> Schneiden Sie das Herz-induzierten embryonalen Stammzellen Kolonien in kleine Stücke, und lösen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. </li><li> Pool der Medien, die losgelöst Kolonie Stücke zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte einmal mit 1 ml / well hESC Medien (ohne bFGF) und Pool zusammen. </li><li> Aliquot 4 ml / well serumfreiem hESC Medien mit Kolonie Stücke zu einer 6-well ultraniedrigen Befestigungsplatte und inkubieren bei 37 ° C befeuchteten Inkubator, damit schwimmende zellulären Clustern (Kardioblasten) für 4-5 Tage zu bilden. </li></ol> 6. Beating Cardiomyocyte Phänotyp Reifung in Adhesive Kultur <ol><li> Pool der Medien mit schwimmenden Kardioblasten zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifugation bei 1400 rpm für 5 min. Saugen Sie die alten Medien so viel wie du kannst, und fügen Sie die gleiche Menge frischen hESC kardialen Differenzierung Medien mit 10 mM NAM. </li><li> Pipette auf und ab zu schweben Kardioblasten und aliquoten 4 ml / well bis 6-Well-Platten mischen. Übertragen Sie die Platten auf eine 37 ° C befeuchteten Inkubator, damit Kardioblasten zu befestigen Nacht. </li><li> Ersetzen hESC kardialen Differenzierung Medien mit 10 mM NAM jeden zweiten Tag. </li><li> Am Tag 8, mit menschlichen embryonalen Stammzellen Herz-Differenzierung Medien ohne NAM ersetzen und weiterhin HESC kardialen Differenzierung media e ersetzensehr anderen Tag. Beating Kardiomyozyten beginnen, in ca. 1-2 Wochen kontinuierlicher Kultivierung nach Abzug der NAM erscheinen und der Erhöhung der Zahl mit der Zeit und konnte starke und rhythmische Kontraktionen länger als 3 Monate behalten. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Nicotinamid (NAM) wiedergegeben wird ausreichen, um hESCs in den definierten Kultur-System zum Übergang erhalten von Pluripotenz ausschließlich auf eine cardiomesodermal Phänotyp (Abb. 2B) zu induzieren. Bei der Belichtung von undifferenzierten hES zu NAM, werden alle Zellen innerhalb der Kolonie zu unterziehen Morphologie Änderungen an großen differenzierten Zellen, die nach unten regulieren die Expression von Oct-4 und beginnen, die Herz-spezifische Transkriptionsfaktor (CSX) Nkx2.5 und α-express actinin, im Einklang mit einer cardiomesoderm Phänotyp (Abb. 2B). Diese differenzierten Zellen weiter zu vermehren und die Kolonien an Größe zunehmen. Erhöhte Intensität des Nkx2.5 wirdin der Regel in den Gebieten der Kolonien, in denen Zellen beginnen zu häufen (Abb. 2B) beobachtet werden. Nach abgelöst, wird die NAM-behandelten hESCs schwimmenden zellulären Clustern (Kardioblasten) in einer Suspensionskultur Form der kardialen Differenzierung fortzusetzen. Nach erlaubt die Kardioblasten zu befestigen und die weitere Zusammenarbeit mit NAM für 1 Woche zu behandeln, wird gegen Kardiomyozyten beginnen, in ca. 1-2 Wochen kontinuierlicher Kultivierung nach Abzug der NAM erscheinen mit einer drastischen Steigerung der Effizienz als die spontane multi-lineage Differenzierung gegenüber hESCs ohne Behandlung über den gleichen Zeitraum (Abb. 2C). Zellen innerhalb des Kardiomyozyten schlagen Cluster Express Marker Merkmal Kardiomyozyten, einschließlich Nkx2.5 und α-Actinin (Abb. 2C). Die Kontraktionen des schlagenden Kardiomyozyten wurden durch elektrische Profile bestätigt, stark zu sein, rhythmische, gut koordinierte und gut mitgerissen, mit regelmäßigen Impulsen erinnert an die p-QRS-T-Komplexe von Körperoberfläche Elektroden in klinischen Elektrokardiogramme gesehen (Abb. 2C, siehe auch Video). Die Kardiomyozyten könnte behalten ihre starke Kontraktilität über 3 Monate. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" /> Abbildung 1. Insgesamt Systeme der konventionelle Ansatz im Vergleich zu kleinmolekularen-Induktion Ansatz zur Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu spezialisierten funktionalen Zellen. (A) Eine schematische Darstellung der konventionelle Ansatz mit multi-lineage Neigung der menschlichen pluripotenten Stammzellen durch spontane Keimblatt Differenzierung. (B) Eine schematische Darstellung gut kontrollierten effiziente Induktion von menschlichen pluripotenten Stammzellen ausschließlich zu einem bestimmten klinisch relevanten Linie durch eine einfache Bereitstellung von kleinen Molekülen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" /> Abbildung 2. Nicotinamide induziert kardiale Linienspezifikation direkten der Pluripotenz unter definierten Bedingungen und die Progression in Richtung schlagen Kardiomyozyten. (A) Schematische Darstellung des Protokolls Zeit Linie gerichtet kardialen Differenzierung von hES. (B) Bei der Belichtung von undifferenzierten hES zu Nicotinamid (NAM) unter den definierten Kultur, großer differenzierte Oct-4 (rot)-negativen Zellen innerhalb der Kolonie begann zu entstehen, wie zum Spott behandelt (DMSO) hESCs als Kontrollgruppe verglichen. NAM-induzierte Oct-4-negativen Zellen begannen sich zu äußern Nkx2.5 (grün) und α-Actinin (rot), im Einklang mit frühen kardialen Differenzierung. Schrittweise erhöhte Intensität der Nkx2.5 war in der Regel in Gebieten der Kolonie, wo Zellen begannen sich zu häufen beobachtet. Alle Zellen sind durch DAPI-Färbung ihrer Kerne (blau) angezeigt. (C) NAM-induzierte kardiale-committed hESCs ergab schlagen Kardiomyozyten mit einer drastischen Steigerung der Effizienz, wie sie in der zellulären Clustern bewertetter, die rhythmische Kontraktionen (siehe elektrophysiologische Profil und Videos) und immunpositive für Nkx2.5 (grün) und α-Actinin (rot) angezeigt. Phase Bilder Vertreter großer schlagen Kardiomyozyten Clustern und höhere Macht Bilder von repräsentativen Contracting Herzmuskulatur sind gezeigt (siehe auch entsprechende Videos). Die Pfeile zeigen die großen Schläge Kardiomyozyten Cluster für die elektrophysiologische Ableitung verwendet. Elektrophysiologische Profil des schlagenden Kardiomyozyten zeigt regelmäßig, mitgerissen, rhythmische Impulse erinnert an die p-QRS-T-Komplexe in der klinischen Elektrokardiogramme gesehen. Maßstabsbalken: 0,1 mm. Videos: Contracting Kardiomyozyten aus NAM-induzierte hESCs differenziert. Videos 1 und 2 zeigen repräsentative große Schläge Kardiomyozyten Cluster in etwa 1 und 3 Monate nach der Befestigung. Video 3 und 4 zeigen repräsentative öffentliche Herzmuskeln bei höherer Leistung. Video 5 zeigt eine typical kleine Schläge Kardiomyozyten Cluster spontan aus hESCs ohne NAM Behandlung als Kontrolle unterschieden. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Klicken Sie hier, um Video 1 zu sehen.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Klicken Sie hier, um Video 2 zu sehen.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Klicken Sie hier, um Video 3 zu sehen.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Klicken Sie hier, um Video 4 zu sehen.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Klicken Sie hier, um Video 5 zu sehen.</a>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären, konkurrierende Interessen. XHP ist der Gründer der Xcelthera. XHP und EYS haben geistigem Eigentum im Zusammenhang mit hESCs.

Eine der großen Herausforderungen für Entwicklungs-Studie und klinische Umsetzung wurde, wie die breite Differenzierungspotential von pluripotenten menschlichen Stammzellen zu einem gewünschten Phänotyp effizient und vorhersagbar Kanal. Obwohl diese Zellen spontan differenzieren können in vitro in Zellen aller Keimblätter, indem Sie durch ein Multi-Linie aggregierten Stufe, in hESC-derived multi-lineage Aggregate (Embryoidkörpern), nur ein sehr kleiner Teil der Zellen (&lt;2%) spontan Differenzierung in Herzmuskelzellen 13-15 (Abb. 1A). Nach Immunselektion wurden die angereicherte Populationen von Herzmuskelzellen in der Lage, als biologische Schrittmacher-Funktion, um die Funktion eines beschädigten Herzmuskels mechanisch und elektronisch Rettung nach der Injektion in das Herz von Tiermodellen 13. In Nagetiere Infarkt Modelle wurden eingepflanzt hESC-derived kardiale Nachkommen überleben können und reifen bis zu 12 Wochen, und teilweise remuscularize den verletzten Herzen und zur Verbesserung der kontraktilen Funktion 14,15. Allerdings haben die Ineffizienz bei der Erzeugung von menschlichen Herz-verpflichtet-Zellen durch multi-lineage Differenzierung von pluripotenten Zellen und das hohe Risiko der Tumorigenität nach der Transplantation weitere klinische Übersetzung behindert. Entwicklung von Strategien, die breite Differenzierungspotential von pluripotenten hES ausschließlich und vorhersagbar Kanal zu einem kardialen Phänotyp ist entscheidend für die Nutzung der Kraft der hESC Biologie im Herzen Feld. Um einheitlich Umwandlung von menschlichen pluripotenten Stammzellen zu einer bestimmten Linie zu erreichen, verwendeten wir eine definierte Kultur System in der Lage für die Versicherung der Proliferation von undifferenzierten hES, die Bedingungen für gut kontrollierte effiziente Induktion von pluripotenten hES ausschließlich zu identifizieren, um eine bestimmte klinisch relevante Linie durch einfache Bereitstellung von kleinen Molekülen (Abb. 1B). Wir fanden, dass Nicotinamid induzierten Herz-Linie Engagement direkt bei pluripotent hESCs unter definierten Kultur, die weiter fortgeschritten zu schlagen Kardiomyozyten mit hohem Wirkungsgrad (Abb. 2). Nkx2.5 ist ein evolutionär konservierter homeobox Transkriptionsfaktor für normale kardiale Entwicklung und Mutationen des Gens unerlässlich sind mit menschlichen angeborenen Herzkrankheit (KHK), der häufigsten menschlichen Geburtsfehler 16 zugeordnet. Expression von Nkx2.5 ist der früheste Marker für Herz-Vorläuferzellen in allen Wirbeltieren so weit untersucht und ist essentiell für die richtige Herz-Septierung und Bildung / Reifung der elektrischen Leitung System 16. Bei Wirbeltieren, den Beginn und das Muster der frühen Nkx2.5 Ausdruck etwa mit dem Timing und des kardialen Spezifikation in der frühen Embryogenese zusammenfallen, und Nkx2.5 Gens weiterhin durch die Entwicklung in der Herz 16 ausgedrückt werden. In unserem hESC Modell erschien NAM zur kardialen Induktion direkt aus pluripotenten hES durch die Förderung der Expression von Herz-spezifische transcri auslösenption Faktor Nkx2.5 in einem Prozess, der Spezifikation der cardiomesoderm aus der pluripotenten Epiblast in humanen embryonalen Kardiogenese könnte emulieren. Zukünftige Studien werden genetische und epigenetische Kontrolle Moleküle in menschlichen Herzens Entwicklung zeigen, als Alternativen, die den Weg für kleines Molekül-vermittelten direkten Kontrolle und Modulation der hESC pluripotent Schicksal bereiten bei der Ableitung von klinisch relevanten Linien für regenerative Therapien. Ohne NAM Behandlung wird &lt;2% hESCs spontane Differenzierung zu schlagen Kardiomyozyten 12-15 unterziehen. Mit NAM Behandlung haben wir in der Lage,&gt; 95% embryonale Herz-Vorstufen und&gt; 50% schlagen Kardiomyozyten aus hES unter define Kultur in einem Prozess, menschliche embryonale Herz Entwicklung 12 emulieren könnte aufrechterhalten zu generieren. Kürzlich haben die bekannten Herz-Schicksal bestimmen Gene verwendet worden, um Maus-Fibroblasten in der postnatalen schlagen Kardiomyozyten mit einem niedrigen Wirkungsgrad von &lt;0,5% 17, 18 transdifferenzieren &lt;/ Sup&gt;. Allerdings haben umprogrammiert Körperzellen historisch mit abnormen Genexpression und beschleunigte Seneszenz mit eingeschränkter therapeutischen Nutzen 19-21 in Verbindung gebracht. Schließlich ist das Protokoll, gründeten wir hier, um pluripotente hES aus der inneren Zellmasse (ICM) oder Epiblast des menschlichen Blastozyste 4,5 abgeleitet begrenzt, darf nicht auf andere pluripotente Zellen, einschließlich Tier-Ursprung WSR WSR aus früheren Morula abgeleitet sind (Acht-Zell)-Embryonen 22 und künstlich reprogrammierten Zellen 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 356231 </td><td> Growth Faktor reduziert </td></tr><tr><td> Menschliche Laminin </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nicotinamid </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out Serumersatz </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM nicht essentielle Aminosäure-Lösung (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Aminosäuren-Lösung (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliches Transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Human-Insulin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche Activin A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Definierte FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well ultraniedrigen Befestigungsplatte </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Platte </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

Bis heute hat das Fehlen eines geeigneten menschlichen Herzzellen Quelle der schweren Rückschlag bei der Regeneration des menschlichen Myokard wurden, entweder durch zellbasierte Transplantation oder durch kardiale Tissue Engineering 1-3. Kardiomyozyten werden bald nach der Geburt terminal differenzierten und verlieren ihre Fähigkeit sich zu vermehren. Es gibt keine Beweise dafür, dass Stammzellen / Vorläuferzellen aus anderen Quellen, wie zB dem Knochenmark oder Nabelschnurblut gewonnen werden können, steigen die kontraktilen Herzmuskelzellen geben nach der Transplantation in das Herz 1-3. Die Notwendigkeit, sich zu regenerieren oder zu reparieren die beschädigten Herzmuskel nicht von adulten Stammzellen-Therapie, entweder endogene oder via Zelle Lieferung 1-3 erfüllt. Die genetisch stabil humanen embryonalen Stammzellen (hES) haben unbegrenzte Expansion Fähigkeit und uneingeschränkten Formbarkeit, kredenzen eine pluripotente Reservoir für in vitro Ableitung von großen Lieferungen von menschlichen Körperzellen, die die Linie in Not eingeschränkt werdender Reparatur und Regeneration 4,5. Aufgrund der Prävalenz von Herz-Kreislauf-Erkrankungen weltweit und akuten Mangel an Spenderorganen, gibt es intensives Interesse an der Entwicklung von hES-basierte Therapien als ein alternativer Ansatz. Allerdings hat, wie die breite Differenzierungspotential von pluripotenten hES effizient und vorhersagbar Kanal zu einem gewünschten Phänotyp eine große Herausforderung sowohl für Entwicklungs-Studie und klinische Übersetzung worden. Herkömmliche Ansätze beruhen auf multi-lineage Neigung von pluripotenten Zellen durch spontane Keimblatt Differenzierung, was ineffizient und unkontrollierbare Linie-Engagement, das oft durch phänotypische Heterogenität und Instabilität, damit ein hohes Risiko für Tumorigenität 6-8 (siehe schematischer in gefolgt wird Abb.. 1A). Darüber hinaus können ausländische undefined / Tier biologische Zusatzstoffe und / oder Anleger, die typischerweise für die Isolierung, Expansion und Differenzierung von hES verwendet wurden um direkte Verwendung solcher Zell-Spezialisierungzed Transplantaten in Patienten problematisch 9-11. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben wir die Elemente einer definierten Kultur-System notwendig und hinreichend für die Erhaltung der Pluripotenz von hES Epiblast gelöst und dient als Plattform für die de novo Ableitung von klinisch-geeignet hESCs und effektiv leiten wie hESCs gleichmäßig in Richtung klinisch relevanter Linien durch kleine Moleküle 12 (siehe schematische Abb.. 1B). Nach dem Screening einer Vielzahl von kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren, fanden wir, dass solche definierten Bedingungen Nicotinamid (NAM) ausreichen, um die Spezifikation von cardiomesoderm direkt aus pluripotenten hES, die weiter nach Kardioblasten, dass die menschliche schlagen Kardiomyozyten mit hohem Wirkungsgrad erzeugt fortgeschritten induzieren (Abb. 2 dargestellt ). Wir definierten Bedingungen für die Induktion von Kardioblasten direkt aus pluripotenten hES ohne Zwischenschaltung einer multi-lineage Embryoidkörper Bühne, so dass gut kontrollierte effiziente Ableitung einesgroßen Vorrat an menschlichen Herzzellen im gesamten Spektrum der Entwicklungsstadien für die Zell-basierter Therapeutika.

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Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

efficient-derivation-human-cardiac-precursors-cardiomyocytes-from

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K Aufrufe.  San Diego Regenerative Medicine Institute. Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Serie: Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Forschung

Biologie

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...