Diese Arbeit wurde vom NIH R01 GM56244 zu ANI, die Gelder durch den American Recovery and Reinvestment Act of 2009 ausgezeichnet umfasst, und durch den NIH R01 GM87130 zu Jarp

1. Isolierung von Embryonen Hinweis: Sämtliche Geschäfte mit Mäusen sollten in Übereinstimmung mit den entsprechenden Tierpflege und Nutzungsrichtlinien und Protokolle durchgeführt werden <ol><li> Überprüfen Sie das Vorhandensein eines passenden Stecker in die Buchse Maus am Morgen nach der Paarung und Trennung der begatteten Weibchen aus dem Deckrüden, indem man sie in einem anderen Käfig. Noon der Tag, an dem Gegenstecker beobachtet wird, gilt als Embryonaltag 0,5 (E0.5) der Entwicklung. </li><li> An E8.5 (oder die gewünschte Stufe, falls abweichend), Opfer der Maus mit einem genehmigten Protokoll. </li><li> Wet den Bauch des Tieres eingeschläfert mit 70% Ethanol und öffnen Sie die Bauchhöhle. Die Implantation Seiten auf das Vorhandensein von Embryonen sind als &quot;Perlen auf einer Schnur&quot; Anordnung entlang der Länge der einzelnen Uterushorn (Abbildung 1A) gesehen. Mit einer Schere, entfernen Sie beide Uterushörner, schneiden Sie jeden Implantationsstelle einzeln zu trennen (Abbildung 1B) und legen Sie sie in eine 100 mm Petrischale mit Raumtemperatur (RT) Dissektion (DMEM, 10% fötalem Rinderserum, 20 mM HEPES pH 7,4 , 60 pg / ml Penicillin, 2 mM Streptomycin). </li><li> Mit einer Pinzette entfernen jedem Embryo und dem umgebenden Membranen aus dem Uterus-Gewebe (Abbildung 1C) und legen Sie sie in frische Dissektion Medium. </li><li> Isolieren einzelner Embryonen unter einem Binokular mit einer Pinzette. In diesem Stadium in der Entwicklung werden die Embryonen durch die parietalen Dottersack, die Kontakte der deciduum Gewebe, das viszerale Dottersack und Amnion. Umgeben Das Amnion ist eine transparente Membran, die in direktem Kontakt mit dem Embryo. Die viszerale Dottersack liegt zwischen dem Amnion und der parietalen Dottersack und ist leicht in E8.5-E9.5 Embryonen durch die Anwesenheit von prominenten Blutgefäße, die den Embryo ernähren zu unterscheiden. Nehmen Sie jedes Embryo aus den umliegenden Membranen und Transfer individuell in eine neue Platte mit Dissektion Medien, um überschüssiges Blut zu entfernen. Die Entwicklungsphase kann vom Embryo zum Embryo und zwischen den Würfen variieren; Vertreter E8.5 Embryonen und ein Vertreter E9.5 Embryonen sind in Abbildung 1D gezeigt. </li><li> Übertragen Sie jede Embryo zu einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 200 ul der Dissektion Medien (beschrieben in Schritt 4 oben). </li></ol> 2. Homogenisierung der isolierten Embryo <ol><li> Fügen Sie 20 Einheiten Collagenase Typ II in einem Volumen von 200 ul (verdünnt in 1X Dubbecco die Phosphate Buffered Saline; DPBS) zu jedem Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Schütteln Sie Proben in einem 37 ° C Schüttler bei 100 rpm für 20 min. </li><li> Resuspendieren und durch Pipettieren zu Klumpen von Zellen zu zerstören. </li><li> Übernehmen Sie die Zellsuspension auf der Oberseite des sterilen Zellsieb (40 um Maschenweite) über ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gegeben. </li><li> Unmittelbar gelten 600 ul der Raumtemperatur 1X DPBS am oberen Rand der Zelle Sieb, um die Trennung zu vervollständigen. Entsorgen Sie das Sieb. </li><li> Centrifuge Proben bei 4 ° C bei 4000 xg für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet in 1 ml RT 1X DPBS. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei 4000 xg für 1 min bei RT. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet in 200 ul RT Dissektion Medien. </li><li> Zählen Sie die embryonalen Zellen. Es ist ein durchschnittliches 3-5 x 10 6 cells/E8.5 Embryo. </li></ol> 3. Cross-Link Chromatin <ol><li> Add 5,6 ul 37% Formaldehyd, die 200 ul Proben für eine Endkonzentration von 1% Formaldehyd. </li><li> Inkubieren Proben für 10 min bei RT. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei 4 ° C bei 4000 xg für 3 min. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der Zellen mit kaltem 1X DPBS mit 80 ul / ml Protease-Inhibitor-Cocktail (PIC). </li><li> Centrifuge Proben bei 4 ° C bei 4000 xg für 3 min. </li><li> Überstand verwerfen. In diesem Schritt können die Proben bei -80 ° C eingefroren werden Die gefrorenen, vernetzten Proben sind über mehrere Monate stabil. </li></ol> 4. Beschallung <ol><li> Zellpellet in 100 ul RT SDS Lysepuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,1), 10 mM EDTA und 1% SDS mit frisch hinzu PIC bei 1 ul ul PIC/800 Gesamtvolumens). Wenn resuspendiert, fügen Sie eine zusätzliche 100 ul RT SDS Lysepuffer Resuspension zu fördern. Gut mischen durch Pipettieren und Inversion. </li><li> Inkubieren Sie die Zellsuspension auf Eis für 10 min. </li><li> Ultraschallbad lysierten Zellen zu scheren DNA zwischen 200 und 500 Basenpaaren mit einem Diagenode Bioruptor ™ UCD200 (5 min x 8 Mal: ​​Einstellung der Amplitude von 30 sec on/30 sec off auf hohe (320 Watt) Leistung). Die Proben sollten durch eine Eisbrei umgeben sein. Lassen Sie die Proben auf über 4 ° C warm oder zu frieren. Es gibt viele Arten von sonicators zur Verfügung. Beschallung Bedingungen sollten für jeden Sonicator optimiert werden, um in das Scheren des vernetzten DNA auf einer Länge von ca. 500 bp ergeben. </li><li> Centrifuge beschallt Proben bei 4 ° C bei 14000 xg für 10 min. </li><li> Transfer der Überstand in ein frisches Eppendorf-Röhrchen auf Eis vorgekühlt. </li><li> Teilen Sie die beschallte Probe in maximal 5 Portionen. Wir haben empirisch festgestellt, dass eine E8.5 Embryonen in 5 Aliquots aufgeteilt werden kann. Kleinere oder größere Probenmengen kann entsprechend skaliert werden. Bei diesem Schritt kann die Probe bei -80 ° C gelagert werden bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Reserve ein Aliquot für die Verwendung als Eingang und bei -20 ° C bis Schritt 6, wenn das Cross-Links aufgelöst werden. Verdünnen Sie die anderen Aliquots 10-fach in ChIP-Verdünnungspuffer (16,7 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1,2 mM EDTA, 1,1% Triton X-100, 167 mM NaCl und 0,01% SDS) mit frisch hinzu PIC bei 1 μl/800 ul Puffer. </li></ol> 5. Pre-Clearing-und Immunpräzipitation <ol><li> Pre-clear die verdünnte Überstand mit 75 ul Lachs-Sperma DNA / Protein A oder G Agarose-50% Gülle bei 4 ° C, mit der Rotation für 1 Stunde. Verwenden Sie entweder Protein A oder Protein G Kügelchen durch den Antikörper für die Chip verwendet werden bestimmt sein sollte. Zum Beispiel sind Protein-A-Perlen für Kaninchen-Antikörper empfohlen, während Protein G Kügelchen für Ziegen-Antikörper oder Maus IgG 1-Antikörper empfohlen. Nähere Informationen finden Sie unter den Empfehlungen der Raupe Herstellers. </li><li> Zentrifuge bei 4 ° C bei 2500 xg für 1 min. </li><li> Übertragen Sie den Überstand auf eine neue, vorgekühlte Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Add-Antikörper (4 pg / Probe), die bereits geklärten Aliquot und inkubieren Nacht bei 4 ° C mit Rotation. </li></ol> 6. Das Waschen des Chromatin-Protein-Bead-Komplex <ol><li> Add 60 ul Salmon Sperm DNA / Protein A oder G-Agarose Suspension in jedes Fläschchen und inkubieren Sie bei 4 ° C mit Rotation für 1 Stunde. Verwenden Sie die gleiche Art Wulst für Pre-Clearing im obigen Schritt 3 verwendet. </li><li> Zentrifuge bei 4 ° C bei 1000 xg für 1 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen. Halten Sie die DNA-Protein-Bead-Komplex auf dem Eis. </li><li> Resuspendieren und waschen das Pellet wie unten mit Waschpuffer 1, 2 gerichtet, 3 und 4. Wash-Puffer 1-3 gekühlt bis 4 ° C und Waschen mit dieser Puffer bei 4 durchgeführt werden sollte ° C. Waschpuffer 4 sollte bei Raumtemperatur und wäscht mit diesem Puffer werden sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Jeder waschen für 5 Minuten mit einer Rotation bei der entsprechenden Temperatur. Nach jedem Waschen, Zentrifuge bei 4 ° C (Raumtemperatur Waschpuffer 4 Waschgänge) bei 1000 xg für 1 min, dann vorsichtig absaugen oder entfernen Sie den Überstand. </li></ol> Puffer 1: Low Salz Waschpuffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl und 0,1% SDS), 1 ml x 2 Wäschen. Buffer 2: High Salz Waschpuffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 500 mM NaCl und 0,1% SDS), 1 ml x 2 Wäschen. Buffer 3: LiCl Salz Waschpuffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630, 0,25 M LiCl und 1% Desoxycholsäure (Natriumsalz)), 1 ml x 1 zu waschen. Buffer 4: TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 Wäschen. 7. Die Elution der Chromatin-Antikörper-Komplex <ol><li> Resuspendieren gewaschen Chromatin-Protein-Bead-Komplex in 250 ul frisch zubereiteten Elutionspuffer (1% SDS, 0,1 M NaHCO 3). Kräftig Wirbel der Probe für 5 Sekunden, dann bei RT für 15 min mit Rotation inkubiert. </li><li> Zentrifuge bei 2500 xg für 1 min bei RT und übertragen Sie die Eluat in ein neues Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1 und 2 und die Eluate miteinander kombinieren in der gleichen Eppendorf-Röhrchen. Die Eluate sollte bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Nach Abschluss dieser Schritt kann die Eluate bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung gespeichert werden. </li></ol> 8. Reverse-Cross-Link und Recover DNA <ol><li> Fügen Sie 20 ul 5 M NaCl für 500 ul Eluat (40 ul / ml für die Eingabe-Steuerung). </li><li> Erhitzen Sie die Eluate bei 65 ° C im Wasserbad für 4 h bis über Nacht. </li><li> 10 &amp;mgr; l jeder Probe (einschließlich der Eingabe-Steuerung) kann auf einem 2% Agarosegel neben Größenmarkern Spanning 0,1 bis 1 kbp der DNA-Fragmentgröße Prüfung ausgeführt wird. Die DNA wird als ein Abstrich erscheinen und nicht eine scharfe Bande. Der Rest der Proben bei 65 belassen werden ° C, während das Gel läuft. </li><li> Wiederherstellen der DNA aus jeder Probe mit Hilfe eines QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Add 600 ul Puffer QG (im Lieferumfang des Kits) zur DNA-Adsorption mit der Silica-Membran in einer QIAquick Spin-Säule und 200 ul Isopropanol in einem 500 ul Probe zu optimieren. Beachten Sie, dass QG Puffer ein pH-Indikator ermöglicht eine einfache Bestimmung des pH-Wertes der Probe enthält. Wenn die Farbe der Probe von gelb bis violett (pH&gt; 7,5) nach dem Mischen, fügen Sie 10 ul 3 M NaAcetate (pH 5,2) auf die Probe und mischen. Dies reduziert den pH-Wert der Mischung auf DNA-Bindung an die Perlen in der Spalte zu maximieren. </li><li> Vor dem Beladen der Säule, prüfen Sie die Mischung, um festzustellen, ob eine SDS Niederschlag vorhanden ist. Wenn SDS Niederschläge aufgetreten ist, sollte die Probe in einem erwärmt werden42 ° C Wasserbad, bis der Niederschlag verschwindet. </li><li> Legen Sie 700 ul der Mischung in die QIAquick Spin-Säule (lila Säule im Kit) und Zentrifuge bei RT bei 14000 xg für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch aus der Säule, bevor Sie fortfahren und wiederholen Sie diesen Schritt mit dem Rest der Probe. </li><li> Add 500 ul QG Puffer auf die Säule zu waschen. Zentrifuge bei RT bei 14000 xg für 2 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch aus der Säule, bevor Sie fortfahren. </li><li> Die Säule wird mit 700 ul PE Waschpuffer (im Lieferumfang des Kits), auf die Ethanol wurde hinzugefügt, wie vom Hersteller angewiesen. Zentrifuge bei RT bei 14000 xg für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch aus der Säule, bevor Sie fortfahren. </li><li> Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt vollständig zu entfernen den Rest der PE-Puffer von der Säule. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und das Sammelrohr. </li><li> Eluieren DNA aus der Säule in ein frisches Eppendorf-Röhrchen durch Zugabe von 60 ul EB-Puffer (Elutionspuffer im Kit mitgeliefert). </li><li> Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 14000 xg für 1 min. Die eluierte DNA kann bei -20 ° C bis zur Erkennung gespeichert werden. A 260 Lesungen des gewonnenen Materials in der Regel weisen Konzentrationen von 90-120 ng / ul, für eine vollständige Erholung von ~ 6-7 ug pro Aliquot. Allerdings ist das A 260/280 Ratio dieser Proben in der Regel&gt; 1,8, was darauf hindeutet, dass RNA in der Probe vorhanden ist. So ist die genaue Menge der verwerteten DNA kann niedriger sein. </li></ol> 9. Die Analyse der DNA Recovered <ol><li> SDS kann mit der Aktivität der Taq-Polymerase PCR stören. SDS sollte vollständig, bevor PCR entfernt werden. Inkubieren Sie die DNA auf Eis zu fällen restliche SDS und Zentrifuge bei 4 ° C bei 14000 xg für 1 min. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Eppendorf tube.This Schritt wird dringend empfohlen. </li><li> Die DNA-Eluate kann entweder durch konventionelle PCR oder durch quantitative real-time PCR (Q-PCR) mit Primern spezifisch für jede zu analysierende Sequenz erkannt werden. 10.05 ul von Gesamt-DNA-Eluat kann für eine PCR oder Q-PCR-Reaktion verwendet werden. PCR mit dem Eingang Steuerung kann mit einer 5-10 fachen Verdünnung der DNA verglichen mit der Menge der anderen Proben durchgeführt werden. PCR-und Q-PCR-Bedingungen variieren, erfordert jedoch die begrenzte Menge an Ausgangsmaterial zusätzliche PCR-Zyklen. Für die konventionelle PCR-Nachweis, empfehlen wir, beginnend mit 40 Zyklen und Anpassung wie nötig. </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse Wir haben dieses Protokoll verwendet, um ChIP von beiden E8.5 und E9.5 Embryonen (Abbildung 2) durchzuführen. Die Ergebnisse zeigen, dass Myogenin auf dem Myogenin Promotor in E8.5 und E9.5 Embryonen ist. ChIP gereinigt DNAs wurden durch konventionelle PCR (Abbildung 2A) und durch quantitative real-time PCR (Abbildung 2B) analysiert. Im Gegensatz dazu gab es keine Anzeichen von Myogenin Bindung an die Myogenin Promotor in den Dottersack, wo Myogenin nicht exprimiert wird. Die Interferon-γ (IFN &amp;ggr;)-Promotor, die Sequenzen passend zum Myogenin Bindungsstelle enthält, wurde als negative Ablaufsteuerung eingesetzt. Wie erwartet, war Myogenin nicht auf die IFNy Promotor in jeder der Gewebeproben getestet gebunden. , Die die Vorläufer der Skelettmuskulatur sind; In E8.5 und 9,5 Embryonen ist Myogenin speziell in den Somiten (6,10 Abb. 3) ausgedrückt. So die Ergebnisse zeigen, dass Myogenin die Myogenin Promotor in der Somiten bei E8.5 und E9.5 gebunden ist. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. E8.5 Embryonen Dissektion. (A) Isolierte Uterushorn (oben; höherer Vergrößerung im unteren Bereich, gezeigt). (B) Uterushorn mit einer Schere schneiden auch auf individuellen Nidationsstellen mit einzelnen Embryonen zu trennen. (C) Embryonen ragt aus uterine Gewebe während der Präparation. Pfeile markieren Embryonen noch von extra-embryonalen Gewebe bedeckt. (D) Zwei E8.5 Embryonen aus dem gleichen Wurf. Der Embryo auf der linken Seite hat nicht den Prozess der Umwandlung begonnen. Der Embryo auf der rechten Seite wird derzeit dreht. Ganz rechts - Vertreter E9.5 Embryonen. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. ChIP-Assay demonstriert Myogenin Bindung an die Myogenin Promotor in E8.5 und E9.5 Embryonen. (Top) Konventionelle PCR-Analyse von 5 ul der DNA von Chip-Experimente mit einem Myogenin Antikörper oder unspezifische IgG wurde mit Primern, die einen Teil der Myogenin Förderer von -79 bis +69 relativ zum Start der Transkription verstärken durchgeführt gereinigt, dass enthält eine Myogenin Bindungsstelle bei -12 oder Primer, dass ein Teil der IFNy Promotor, der eine Sequenz passend zum Myogenin Bindungsstelle befindet ~ 1075 bp stromaufwärts von der Transkriptions-Startstelle enthält verstärken entfernt. Die IFNy Primersequenzen verwendet wurden 5&#39;-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3 &#39;und 5&#39;-TGA GGA GGC TGG AGG AGG CC-3&#39;. (Bottom) Quantitative Real-time PCR-Analyse der gleichen Proben in (A) verwendet. DieStandardabweichung - Daten werden als% des Eingangs + / aufgetragen. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Myogenin ist speziell in den Somiten von E8.5 und E9.5 Embryonen geäußert. Whole mount in situ Hybridisierung von Myogenin zeigt spezifische mRNA-Expression in den Somiten. Größe bar in E8.5 Bild - 200 um. Größe bar in E9.5 Bild - 500 um.

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J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+homooligomerization+contributes+to+the+dependence+of+myogenin+on+E2A+products+for+efficient+DNA+binding.">Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding.</a> Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).</li><li>Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+induces+the+myocyte-specific+enhancer+binding+factor+MEF-2+independently+of+other+muscle-specific+gene+products.">Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products.</a> Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).</li><li>Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four+human+muscle+regulatory+helix-loop-helix+proteins+Myf3-Myf6+exhibit+similar+hetero-dimerization+and+DNA+binding+properties.">The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).</li><li>Serna, d. e. l. a., L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+targets+chromatin+remodeling+complexes+to+the+myogenin+locus+prior+to+forming+a+stable+DNA-bound+complex.">MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex.</a> Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).</li><li>Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+initial+blueprint+for+myogenic+differentiation.">An initial blueprint for myogenic differentiation.</a> Genes Dev. 19, 553-569 (2005).</li><li>Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+gene-specific+analyses+show+distinct+roles+for+Myod+and+Myog+at+a+common+set+of+promoters.">Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters.</a> EMBO J. 25, 502-511 (2006).</li><li>Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+and+the+SWI/SNF+ATPase+Brg1+maintain+myogenic+gene+expression+at+different+stages+of+skeletal+myogenesis.">Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis.</a> J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).</li><li>Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+gene+selectivity+of+the+myogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+myogenin+in+embryonic+muscle.">Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle.</a> Dev Biol. 311, 650-664 (2007).</li><li>Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor-alpha+directs+ordered,+cyclical,+and+combinatorial+recruitment+of+cofactors+on+a+natural+target+promoter.">Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter.</a> Cell. 115, 751-763 (2003).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Massachusetts Medical School IACUC gesetzt durchgeführt.

In der beschriebenen ChIP-Protokoll zeigen wir, dass die myogene Regler Myogenin mit dem Myogenin Promotor in der Skelettmuskulatur Vorläuferzellen Gewebe in einzelne E8.5 und E9.5 Embryonen verbunden ist. Frühere Studien haben ausführlich Myogenin Bindung an E-Box enthält Sequenzen aus, beginnend mit dem ersten in vitro Gel-Shift-Experimente unter Verwendung in vitro übersetzt oder bakteriell produzierten Myogenin und radioaktiv markierten DNA-Codierung der relevante Teil der Zielgen regulatorisc...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ChIP Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore</td>
<td>17-295</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17101015</td>
<td>Dilution by 1 x PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified eagle medium (DMEM) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>12100-061</td>
<td>High glucose content</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s phosphate buffered saline 1X (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Calcium chloride free, Magnesium chloride free</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Inc.</td>
<td>35-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel extraction kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QIAquick</td>
<td>28704</td>
<td>50 reaction kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin stock solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5000 &mu;g/ml concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P8340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon sperm DNA /Protein A agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>16-157</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>myogenin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
<td>sc-576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal rabbit IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>12-370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Platinum PCR Supermix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11306-016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GoTaq Q-PCR master mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>A6001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromatin immunoprecipitation assay for tissue-specific genes using early-stage mouse embryos

Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Protein zu identifizieren: Chromatin-Wechselwirkungen, die im Kontext von lebenden Zellen 1-3 auftreten. Diese Technik wurde in großem Umfang in Gewebekulturzellen ausgebeutet und in geringerem Maße, in primärem Gewebe. Die Anwendung des ChIP mit Nagetier-embryonalen Gewebe, insbesondere in den frühen Zeiten der Entwicklung ist durch die begrenzte Menge an Gewebe und die Heterogenität der Zell-und Gewebetypen des Embryos kompliziert. Hier präsentieren wir eine Methode, um ChIP durchführen mit einem dissoziierten Embryonaltag 8,5 (E8.5) Embryo. Geschert Chromatin aus einem einzigen Embryo E8.5 können unterteilt werden in bis zu fünf Portionen, die die Ermittler genügend Material ermöglicht Kontrollen und für die Untersuchung von spezifischen Protein: Chromatin-Wechselwirkungen. Wir haben diese Technik genutzt, um zu beginnen, um Protein-Dokument: Chromatin-Wechselwirkungen bei der Spezifikation von Gewebe-spezifischen Genexpression Programme. Die Heterogenität der Zelltypen im Embryo notwendig schränkt die Anwendung dieser Technik, weil das Ergebnis ist der Nachweis von Protein: Chromatin-Wechselwirkungen ohne Unterscheidung, ob die Wechselwirkungen treten in allen, eine Teilmenge von oder einem Zelltyp (s). Allerdings ist die Untersuchung von Gewebe-spezifischer Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Genexpression möglich aus zwei Gründen. Zunächst Immunpräzipitation von gewebespezifischen Faktoren nicht unbedingt isoliert Chromatin aus dem Zelltyp, wo der Faktor ausgedrückt. Zweitens sollte Immunpräzipitation von Ko-Aktivatoren und Histonen mit post-translationale Modifikationen, die mit Gen-Aktivierung assoziiert sind nur bei Genen und Genprodukten regulatorische Sequenzen in die Zelle Typ, bei dem das Gen wird gefunden werden oder wurde aktiviert. Die Technik sollte für das Studium der meisten Gewebe-spezifische Genaktivierung Veranstaltungen. Im Beispiel unten beschrieben, verwendeten wir E8.5 und E9.5 Maus-Embryonen zu Faktor Bindung an ein Skelettmuskel spezifischen Gen-Promotor zu untersuchen. Somiten, die eine Vorstufe Gewebe, aus denen die Skelettmuskeln des Rumpfes und der Gliedmaßen bilden, sind an E8.5-9.5 4,5 präsentieren. Myogenin ist ein regulierender Faktor für die Skelettmuskulatur Differenzierung 6-9 erforderlich. Die Daten zeigen, dass Myogenin mit seinen eigenen Promotor in E8.5 und E9.5 Embryonen verbunden ist. Da Myogenin ist nur in Somiten in diesem Stadium der Entwicklung 6,10 ausgedrückt, zeigen die Daten, die Myogenin Interaktionen mit ihren eigenen Promotor haben bereits in der Skelettmuskulatur Vorläuferzellen in E8.5 Embryonen aufgetreten.

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Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-tissue-specific-genes-using

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Aufrufe.  University of Massachusetts Medical School. Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.

Serie: Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Platzieren Growth Factor-Coated Perlen auf Early Stage Hühnerembryonen

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Forschung

Biologie

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

A Chromatin-Assay für Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: Erkennung von numerischen und strukturellen Veränderungen in alle 24 menschlichen Chromosomen gleichzeitig unter Verwendung eines neuartigen OctoChrome FISH-Test

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Drosophila Gewebe

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...