Análisis eucariotas perfil Polyribosome

Resumen

En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.

Resumen

La síntesis de proteínas es un proceso complejo celular que está regulada en muchos niveles. Por ejemplo, la traducción global puede ser inhibido en la fase de iniciación o de la fase de alargamiento por una variedad de estreses celulares, tales como aminoácidos hambre o la retirada del factor de crecimiento. Por otra parte, la traducción de ARNm individuales pueden ser reguladas por la localización del ARNm o la presencia de micro ARN afines. Los estudios sobre la síntesis de proteínas a menudo utilizan el análisis polyribosome para arrojar luz sobre los mecanismos de regulación de la traducción o defectos en la síntesis de proteínas. En este ensayo, el ARNm / ribosoma complejos están aislados de las células eucariotas. Un gradiente de densidad de sacarosa separa ARNm unido a los ribosomas múltiple conocido como polirribosomas de ARNm unido a un ribosoma único o monosome. El fraccionamiento de los gradientes permite el aislamiento y la cuantificación de las diferentes poblaciones ribosomal y sus asociados ARNm o proteínas. Las diferencias en la proporción de polirribosomas a monosomes en unas condiciones determinadas puede ser indicativo de los defectos de iniciación de la traducción sea o elongación / terminación. El examen de los ARNm presentes en las fracciones polyribosome puede revelar si la cohorte de ARNm individuales se traducen los cambios en las condiciones experimentales. Además, el montaje de los ribosomas se puede controlar mediante el análisis de los picos de la subunidad ribosomal pequeñas y grandes que también se separan por el gradiente. En este video, se presenta un método para la preparación de extractos crudos de células de levadura ribosomal, la separación del extracto por gradiente de sacarosa y la interpretación de los resultados. Este procedimiento es fácilmente adaptable a las células de mamíferos.

Protocolo

1. Preparación de los gradientes de sacarosa 7-47%

1. Prepare gradientes de sacarosa un día antes de su uso para permitir que los gradientes de convertirse en permanente. Hacer estéril el 7% y un 47% las soluciones de sacarosa que contiene 50 mM NH ₄ Cl, 50 mM Tris-acetato de pH 7,0 y 12 mm de MgCl ₂ y se almacenan a 4 ° C ^1.
2. Para 6 gradientes mezcla del 7% y el 47% de sacarosa soluciones madre para 48 ml de cada una de las siguientes concentraciones de sacarosa. Añadir DTT (1M acciones) a cada solución de sacarosa a una concentración final de 1mM.
   

   La concentración final	7% de sacarosa	47% de sacarosa
   7%	48 mL	0
   17%	36 ml	12 ml
   27%	24 ml	24 ml
   37%	12 ml	36 ml
   47%	0	48 mL

3. Con el fin de verter los gradientes, adjunte una pipeta Pasteur a una jeringa de 20 ml de sujeción y cierre con Parafilm o usar una aguja larga. 7 ml de sacarosa al 7% a la parte inferior de 1 x 3.5 "tubo de ultracentrífuga polyallomer. A continuación 7 ml de solución de sacarosa al 17% en la solución de un 7% mediante la colocación de la punta de la pipeta Pasteur cerca del fondo del tubo y la pipeta no mayor a 0.3 mL / seg. Repita con 7 ml cada una de 27%, 37% y 47% soluciones de sacarosa. Usted debe observar las líneas claras entre las capas, lo que indica que un mínimo de mezcla se ha producido. tienda gradientes a 4 ° C durante la noche junto con los discos, botellas de y los tubos que se utilizarán para recoger muestras.

2. Preparación del extracto de levadura

1. Crecen 125 ml de cultivo de levadura a una OD ₆₀₀ de 0,8 a 1,0. Añadir cicloheximida a la cultura a una concentración final de 100 mg / ml y continuar agitación a 30 ° C durante 15 min.
2. Mientras tanto, preparar un tampón de lisis que contiene 80 mg / ml de cicloheximida, 200 heparina mg / ml, 0,2% DEPC, y 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 30 mM MgCl _2. Mantenga todo en hielo a partir de ahora.
3. Vierta la cultura en una botella de 250 ml de centrífuga y se llenan de hielo. Centrifugar a 8000 xg (7.250 rpm en un rotor de SLA-1500) durante 5 min a 4 ° C. Lavar el sedimento una vez con 10 ml de solución amortiguadora de lisis fría y la transferencia de tubos de 15 ml de polipropileno. Centrifugar a 5900 xg (~ 6000 rpm en un rotor de SLA-600TC) durante 3 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado en 0,5 ml de tampón de lisis, traslado al tubo de 1,5 ml y añadir 0,5 ml de cuentas refrigerados, horno de vidrio lavado con ácido. Vórtice de las células durante cuatro intervalos de 30 segundos, enfriar el tubo en hielo durante 30 segundos entre cada intervalo. Añadir otro 0,5 ml de solución amortiguadora de lisis en el tubo de 1,5 ml. Centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga (14.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf 5417R) por 10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Retire 10 l de un tubo separado para determinar la DO ₂₆₀ / DO ₂₈₀ ratio (véase el paso 3.1). Extractos de almacenar a -80 ° C.

3. Preparación de extractos de células de mamíferos

1. Para células adherentes, crecer en un plato de 100 mm hasta la confluencia ~ 70%. Usted necesitará un plato de 100 mm por cada 11 ml de gradiente (rendimiento típico es de ~ 20 OD ₂₆₀ unidades). Escala de la cantidad lineal para los tamaños de gradiente de mayor o menor. De las células no adherentes, de aproximadamente 1 x 10 ⁷ células son necesarias por gradiente de 11 ml.
2. Antes de la lisis, añadir cicloheximida a 100 mg / ml. Se incuba a 37 ° C durante 15 min. Transferencia de las placas de hielo y lavar las células dos veces en PBS enfriado con hielo. Todos los pasos de futuro debe llevarse a cabo a 0-4 º C.
3. Eliminar todos los rastros de PBS por aspiración (que las placas de drenaje en una cama inclinada de hielo) y añadir una solución amortiguadora de lisis ml, raspar y la transferencia de pre-enfriado tubo de 1,5 ml. Componentes de tampón de lisis tendrá que ser optimizado para el tipo de célula y las condiciones de crecimiento. Un buffer de partida sería de 20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 15 mM MgCl _2, 200 mM KCl, 1% Triton X-100 (v / v), 100 mg / ml de cicloheximida, 2 mM DTT, y 1 mg / ml de heparina. Las variables clave son las concentraciones de magnesio y cloruro de potasio, así como la inclusión o exclusión de los detergentes no iónicos para mejorar la extracción de polisomas obligado citoesqueleto o de la membrana. Lisis de las células, pasando al 27 de aguja de la jeringa de calibre o dos veces por golpes 10.5 de la homogeneización Dounce con el Tipo B maja. La jeringa o un homogeneizador debe ser pre-enfriado antes de su uso.
4. Giran a 14.000 xg durante 5 minutos en microcentrífuga refrigerada. Transferencia de lisado fresco al gradiente de sacarosa (para células de mamíferos esto se hace en tampón de lisis que carecen de Triton X-100 y la heparina, pero de lo contrario como se describe en 1.2 y 1.3) o congelar flash en nitrógeno líquido para su uso posterior.

4. Centrifugación de gradientes

1. Descongele los lisados ​​polyribosome en el hielo. Determinar la concentración de ácido nucleico en el lisado mediante la adición de la muestra de 10 l reservados a 1 ml de agua y la lectura de la DO ₂₆₀ / DO ₂₈₀ relación con un espectrofotómetro. Rendimiento típico de un cultivo de levadura de cerveza cultivada como se describe es de 50 unidades de DO.
2. Con una pipeta con la punta colocada contra la pared del tubo cerca de la superficie de la pendiente, suave capa de 25 OD ₂₆₀ unidades del lisado en la parte superior de la pendiente. Para un gradiente de 35 ml 500 l de lisado se carga típicamente. Tampón de lisis se puede utilizar para asegurar que todos los gradientes están cargados con un volumen igual. Una cantidad menor de material de mejor rendimiento de resolución. Con unas pinzas, cuidadosamente baje los gradientes en los cubos de un rotor basculante.
3. Centrifugar los gradientes a 100.000 xg (23.000 rpm en un rotor Surespin 630) por 4 horas a 4 ° C. Este protocolo puede ser adaptado para los gradientes de menor volumen.

5. La recopilación de datos y las fracciones

1. Aproximadamente 30 minutos antes de la finalización de la separación de 4 horas coloque la aguja de la perforación del tubo Modelo 184. Coloque el lápiz a la línea de modelo Isco UA-5 Absorbancia / Monitor de fluorescencia. Encienda el monitor de absorción para permitir que una línea de base estable para ser alcanzado antes de analizar las muestras. Electrónicos para la adquisición del perfil de polisomas se puede obtener fácilmente por colocar un dispositivo de DI-148U de adquisición de datos (DATAQ Instruments) para el registro gráfico. Perfiles se puede recoger en tiempo real y se guarda para su posterior anotación usando el software que acompaña WinDaq.
2. Llene la bomba de jeringa con 50 ml de Fluorinert utilizando el flujo inverso, de fraguado rápido. Asegúrese de que no hay burbujas de aire. Conecte la manguera de la jeringa en el tubo de perforación y brevemente a su vez en el flujo de Fluorinert a 3 ml / min en dirección hacia adelante para despejar el tubo de burbujas de aire.
3. Coloque un vaso de residuos o una serie de tubos de recogida de las fracciones, si debajo de la manguera en el extremo de la celda de flujo para recoger la muestra corriendo.
4. Retire con cuidado los tubos de centrifugación polyallomer que contiene el gradiente de sacarosa del rotor de la centrífuga y colocarlos en hielo (pre-forma de los pozos en el hielo con un tubo de vacío para evitar gradientes inquietante).
5. Para el análisis de extractos celulares, se coloca el tubo de gradiente en la perforación del tubo. Conecte la parte superior del tubo a la toma y seguro. Levante la etapa final para el tubo de centrífuga de modo que la aguja perfora el fondo del tubo. Una vez que la aguja ha sobresalido a través de la parte inferior del tubo de centrífuga, iniciar el flujo de Fluorinert en la dirección de avance en 6mL/min.
6. Una vez que el Fluorinert ha comenzado a fluir en el tubo, vigilar el movimiento de la aguja en el monitor de la absorbancia en línea. Una vez que la aguja comienza a moverse, a su vez en el movimiento gráfico a un ajuste de velocidad de 60. El monitor medirá el diámetro exterior ₂₅₄ a partir del material libre seguido por la detección de la subunidad ribosómica 40S y continuando a través de complejos polyribosome. Si usted está recogiendo fracciones de ARN o el análisis de proteínas, por lo general 0,2 min se toman fracciones (1 ml). Para el análisis de ARN, las fracciones se deben recoger directamente en tubos con Trizol (Invitrogen), fenol o K SDS / proteinasa, dependiendo del método preferido de extracción.
7. Cuando el extremo del perfil polyribosome se ha alcanzado, a su vez el flujo de Fluorinert al tubo de centrífuga y detener el movimiento de la tabla de absorbancia / monitor de fluorescencia.
8. Retraer el Fluorinert desde el tubo de centrífuga con la jeringa de inicio del flujo en la dirección contraria a gran velocidad teniendo cuidado de no extraer la sacarosa de la sonda en la jeringa. Desenroscar el tubo de centrífuga de la perforación del tubo, bajar la aguja, y retirar el tubo.
9. Repita los pasos 5.5 a 5.8 por cada gradiente de sacarosa.
10. Cuando todos los gradientes de sacarosa se han analizado, retraer el Fluorinert de la manguera en la jeringa. Retire cada parte del fraccionador (perforación del tubo y la celda de flujo), incluyendo la manguera de residuos situado en la parte superior y enjuague bien con agua.

6. Resultados representante

Figura 1. Rastro Representante de extracto de ribosoma preparada con la cepa de levadura BY4741 (una estera his3 Δ Δ 0 1 leu2 met15 Δ 0 ura3 Δ 0) en presencia de cicloheximida. El extracto fue fraccionado ribosomal utilizando un gradiente de sacarosa 7 47% y se analizaron mediante un aparato de bomba de jeringa conectada a un detector de UV. Picos que contienen polirribosomas y 80S, 60S y 40S ribosomas se indican.

Discusión

La información obtenida a partir del perfil polyribosome puede proporcionar información valiosa sobre el estado de traslación de la célula. Además, el estado de la asamblea de las subunidades ribosómicas se puede determinar ^2. Por ejemplo, la presencia de halfmers y 80 años y mayores picos con un hombro ligeramente a la derecha en el perfil indica una subunidad 40S unido a la espera de unirse subunidad 60S. Realizar el experimento en la ausencia de cicloheximida o inhibidores añadidos otros de elongación permite el análisis de la tasa de escurrimiento, que indica si la elongación se altera ^3. Las mismas fracciones son una rica fuente de reactivos para la determinación posterior de la asociación de un ARNm o proteína ribosomal con las subpoblaciones por transferencia de Northern o Western de las fracciones. El número total de mRNAs asociados con los ribosomas activos puede ser determinada a través de un asociado de microarrays ⁴ o profundo análisis de secuenciación ^5. Las asociaciones de proteínas también puede ser estabilizada por la adición apropiada de un entrecruzamiento reactivo ^6.

Polyribosome análisis de las células de la pena mencionar también como un protocolo distinto en términos de las aparentes dificultades en el establecimiento de las condiciones necesarias para obtener polisomas estable. Los sistemas de amortiguación en la literatura son muy variables ^{70 a 10,} por lo tanto no puede ser un requisito para la optimización del tipo de células específicas de la solución amortiguadora de lisis, o también es posible que el sistema de amortiguación no es tan importante como la atención de interesados ​​en trabajar con lisados ​​frescos se mantienen a temperaturas bajas. A nuestro entender una evaluación sistemática de los parámetros que afectan la formación de polisomas mamíferos no se ha informado.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
polyallomer ultracentrifuge tube	Beckman Coulter Inc.	326823	1 x 3.5 in. (25x89mm)
Fluorinert	Sigma-Aldrich	F9755
Cycloheximde	Sigma-Aldrich	C-7698
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
BY4741	Open Biosystems	YSC1048	Other strains work equally well