Эукариотические Polyribosome Анализ профиля

Резюме

В этой статье описывается протокол для извлечения переводе рибосом из эукариотических клеток. После извлечения, рибосомы разделены на monosomes и полирибосом сахарозы фракционирования градиент чтобы позволить различным рибосомных популяций для анализа. Таким образом, этот метод является золотым стандартом для изучения регуляции трансляции.

Аннотация

Синтез белка представляет собой сложную клеточный процесс, который регулируется на многих уровнях. Например, глобальное перевод может быть запрещена на этапе инициирования или удлинение фазы на различных клеточных стрессы, такие как аминокислоты голода кислоты или снятие фактора роста. Кроме того, перевод отдельных мРНК может регулироваться путем локализации мРНК или наличия родственных микроРНК. Исследования синтеза белка часто используют polyribosome анализ, чтобы пролить свет на механизмы регуляции перевод или дефектов в синтезе белка. В данном анализе мРНК / рибосомы комплексов изолированы от эукариотических клеток. Градиент плотности сахарозы отделяет мРНК связан с несколькими рибосомами известный как полирибосом от мРНК привязаны к одному или monosome рибосомы. Фракционирование градиентов позволяет изоляции и количественной оценки различных рибосомных населения и связанных с ними мРНК или белка. Различия в отношении к полирибосом monosomes при определенных условиях может указывать на дефекты в любой инициации трансляции или удлинение / прекращения. Рассмотрение мРНК присутствуют в polyribosome фракции могут определить, есть ли когорты индивидуальных мРНК переводится с изменениями условий эксперимента. Кроме того, рибосомы сборки можно контролировать с помощью анализа малый и большой рибосомной субъединицы пики, которые также разделены градиента. В этом видео мы представляем метод для подготовки сырой рибосомных выдержки из дрожжевых клеток, отделение экстракта градиенте сахарозы и интерпретации результатов. Эта процедура могут быть легко приспособлены к клеткам млекопитающих.

протокол

1. Подготовка 7-47% сахарозы градиенты

1. Подготовка сахарозы градиенты за один день до использования, чтобы градиенты, чтобы стать непрерывным. Сделать стерильный 7% и 47% сахарозы растворов, содержащих 50 мМ NH ₄ Cl, 50 мМ Трис-ацетат 7,0 рН и 12 мм MgCl ₂ и хранить при температуре 4 ° C ^1.
2. За 6 градиенты смесь 7% и 47% растворы сахарозы акции, чтобы сделать 48 мл каждого из следующих концентрациях сахарозы. Добавить DTT (1M акций) для каждого раствора сахарозы в конечной концентрации 1 мМ.
   

   Конечная концентрация	7% сахарозы	47% сахарозы
   7%	48 мл	0
   17%	36 мл	12 мл
   27%	24 мл	24 мл
   37%	12 мл	36 мл
   47%	0	48 мл

3. Для того, чтобы залить градиентами, приложите пипетки Пастера в 20 мл шприца, обеспечивая и герметизации с парафильмом или использовать длинную иглу. Добавить 7 мл 7% сахарозы в нижней части 1 х 3,5 "трубки ультрацентрифуге polyallomer. Затем добавьте 7 мл 17% раствора сахарозы под 7%-ный раствор, помещая кончик пипетки Пастера возле нижней части трубки и пипетки не быстрее, чем на 0,3 мл / сек. Повторите с 7 мл каждый из 27%, 37% и 47% растворы сахарозы. Вы должны наблюдать четких разграничений между слоями, что указывает на минимальное смешение произошло. Магазин градиентов при 4 ° С в течение ночи вместе с роторами, бутылки и трубы, которые будут использоваться для сбора образцов.

2. Подготовка дрожжевой экстракт

1. Рост 125 мл дрожжевой культуры OD ₆₀₀ из 0,8-1,0. Добавить циклогексимид к культуре до конечной концентрации 100 мкг / мл и сотрясают при температуре 30 ° С в течение 15 мин.
2. Между тем, подготовка лизис буфера, содержащего 80 мкг / мл циклогексимид, 200 мкг / мл гепарина, 0,2% DEPC и 10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 0,1 М NaCl, 30 мм MgCl _2. Держите все на льду, с этого момента.
3. Налейте культуры в 250 мл бутылки центрифуги и залить лед. Центрифуга в 8000 мкг (7250 оборотов в минуту в SLA-1500 ротора) в течение 5 мин при 4 ° C. Вымойте гранул раз с 10 мл ледяной буфера для лизиса и передачи до 15 мл трубы полипропилен. Центрифуга на 5900 мкг (~ 6000 оборотов в минуту в SLA-600TC ротора) в течение 3 мин при 4 ° C. Ресуспендируют гранулы в 0,5 мл лизирующего буфера, трансфер до 1,5 мл трубки и добавить 0,5 мл охлажденной, запеченные кислотой мыть стеклянные бусы. Vortex клетки в течение четырех каждые 30 сек, охлаждение трубки на льду в течение 30 секунд между каждым интервалом. Добавить еще 0,5 мл лизис буфера в 1,5 мл трубки. Центрифуга с максимальной скоростью в микроцентрифужных (14000 оборотов в минуту в микроцентрифужных Eppendorf 5417R) в течение 10 мин при 4 ° C. Передача супернатант в новую трубку микроцентрифужных 1,5 мл. Удалить 10 мкл в отдельную трубку, чтобы определить диаметр ₂₆₀ / ₂₈₀ OD отношение (см. шаг 3.1 ниже). Магазин экстрактов при температуре -80 ° C.

3. Подготовка выписки из клеток млекопитающих

1. Для прилипшие клетки, растут в 100 мм блюдо до ~ 70% слияния. Вам понадобится один 100 мм блюдо за 11 мл градиент (типичный выход ~ 20 OD ₂₆₀ единиц). Шкала количество линейно для большего или меньшего размера градиента. Для не прилипшие клетки, примерно 1 х 10 ^{7 клеток} необходимы в 11 мл градиента.
2. До лизис, добавьте циклогексимид до 100 мкг / мл. Инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин. Передача пластины льда и промыть клетки дважды в ледяной PBS. Все последующие шаги должны выполняться при 0-4 ° C.
3. Удалите все следы PBS стремлением (пусть пластин утечке угловой кровати льда) и добавьте 1 мл лизирующего буфера, лом и передачи предварительно 1,5 мл охлажденной трубки. Лизис компонентов буфера должны быть оптимизированы для типа клеток и условий роста. Хорошая отправная буфера составит 20 мМ HEPES-KOH, рН 7,4, 15 мМ MgCl _2, 200 мМ KCl, 1% Тритон Х-100 (об. / об), 100 мкг / мл циклогексимид, 2 мМ DTT, и 1 мг / мл гепарина. Ключевых переменных концентраций магния и хлористого калия, а также включение или исключение неионогенные моющие средства для улучшения извлечения цитоскелета или мембраносвязанных полисом. Lyse клетки, проходя через иглу шприца 27 калибр в два раза или на 5-10 ударов Dounce гомогенизации использованием типа B пестиком. Шприца или гомогенизатор должны быть предварительно охлажденной до использования.
4. Спиновые при 14000 мкг в течение 5 мин в охлажденном микроцентрифужных. Передача свежего лизата в градиенте сахарозы (для клеток млекопитающих это сделано в буфере для лизиса не хватает Тритон Х-100 и гепарина, но в остальном, как описано в 1.2 и 1.3) или флэш-заморозить в жидком азоте для последующего использования.

4. Центрифугирование градиентов

1. Оттепель polyribosome лизатов на льду. Определение концентрации нуклеиновых кислот в лизат, добавив защищены 10 мкл образца к 1 мл воды и чтение OD ₂₆₀ / OD ₂₈₀ соотношении с спектрофотометр. Типичный выход из дрожжевая культура выращивается, как описано в 50 единиц ОП.
2. Использование пипетки с наконечником помещается на стенку трубки вблизи поверхности градиента, мягко слой 25 OD ₂₆₀ единиц лизат поверх градиента. Для 35 мл градиент 500 мкл лизата, как правило, загружены. Лизис буфер может быть использован для обеспечения всех градиентов загружаются с равным объемом. Нижняя количество материала доходность лучшего разрешения. Использование щипцов, осторожно опустите градиенты в ведра размахивая ведром ротора.
3. Центрифуга градиенты на 100 000 мкг (23 000 оборотов в минуту в Surespin 630 ротора) в течение 4 часов при температуре 4 ° C. Этот протокол может быть адаптирован для небольших градиентов объема.

5. Сбор данных и фракций

1. Примерно за 30 мин до окончания 4 часа спина приложить иглой Модель 184 пирсингу трубки. Прикрепите перо онлайн Модель Isco UA-5 Поглощение / Флуоресцентный монитор. Включите поглощения монитора позволяют стабильной базовой которые должны быть достигнуты до анализа образцов. Электронные приобретение polysome профиль может быть легко получены путем присоединения DI-148U устройство сбора данных (DATAQ Instruments) для самописца. Профили могут быть собраны в режиме реального времени и сохранять для последующего использования аннотации сопутствующего программного обеспечения WinDaq.
2. Заполните шприц насос с 50 мл Fluorinert использованием обратного потока, быстрой настройки. Убедитесь в том, что Есть нет воздушных пузырей настоящее время. Подключить шланг от шприца в трубку пирсингу и кратко остановиться на поток Fluorinert в 3 мл / мин в прямом направлении, чтобы очистить шланг любые воздушные пузыри.
3. Место стакан отходов или ряд труб, если сбор фракций под шланг в конце проточной ячейки для сбора образцов убежал.
4. Осторожно снимите polyallomer центрифуги пробирки, содержащие сахарозу градиентом от ротора центрифуги и разместить их на лед (преформ скважин во льду с пустой трубкой чтобы не потревожить градиентов).
5. Для анализа клеточных экстрактов, место градиент трубки на трубку пирсингу. Подключите верхней части трубки к розетке и безопасно. Поднимите нижнюю ступень в центрифуге трубку так, что игла пробивает нижнюю часть трубки. Как только игла торчала через дно центрифужной пробирке, начинают поток Fluorinert в прямом направлении на 6mL/min.
6. После Fluorinert начался впадающих в трубку, контролировать движение иглы на онлайн-мониторинг абсорбции. Как только игла начинает двигаться, поворот на графике движения скорость установки 60. Монитор будет записывать OD _254, начиная с материал без последующей 40S рибосомальной субъединицей обнаружения и продолжающейся до polyribosome комплексов. Если вы собираете фракций для РНК или белка анализа, как правило, 0,2 мин фракции принимаются (1 мл). Для анализа РНК, фракции должны быть собраны непосредственно в пробирки, содержащие Trizol (Invitrogen), фенол или SDS / протеиназы К, в зависимости от предпочтительного метода добычи.
7. Когда в конце polyribosome профиля не было достигнуто, выключить поток Fluorinert на центрифуге трубки и остановить график движения поглощения / флуоресценции монитора.
8. Уберите Fluorinert из центрифуги трубки в шприц, начав поток в обратном направлении с большой скоростью убедившись, что не обратить сахарозы из трубки в шприц. Отвинтите центрифуге трубки из трубки пирсингу, нижняя игла, и снимите трубку.
9. Повторите шаги 5.5 через 5,8 для каждой градиенте сахарозы.
10. Когда все сахарозы градиенты, были проанализированы, отказаться от Fluorinert шланг обратно в шприц. Удалите каждую часть ректификационной колонны (пирсингу трубки и проточную ячейку), включая отходы шланга, расположенные в верхней и хорошо промыть водой.

6. Представитель Результаты

Рисунок 1. Представителю следов рибосомы экстракт готовят из штамма дрожжей BY4741 (матовая his3 Δ 1 leu2 Δ 0 met15 Δ 0 URA3 Δ 0) в присутствии циклогексимид. Рибосомных экстракт фракционированного использованием 7 47% сахарозы градиента и анализировали с помощью аппарата насос шприца придает УФ-детектор. Пики содержащие полирибосом и 80S, 60S и 40S рибосомы указаны.

Обсуждение

Информации, полученной от polyribosome профиля может обеспечить ценную информацию о поступательном статус клетки. Кроме того, статус сборки рибосомных субъединиц сами по себе могут быть определены ^2. Например наличие halfmers или 80S и большие пики с небольшим плечом к прямо на профиле указывает связаны 40S субъединицей 60S субъединицей ожидают присоединения. Выполнение эксперимента в отсутствие каких-либо добавил циклогексимид или другой ингибитор удлинения позволяет для анализа скорости убежал, который показывает, является ли удлинение изменяется ^3. Фракций сами являются богатым источником реагентов для последующего определения ассоциации конкретные мРНК или белка с рибосомной субпопуляций по Северной или Западной блоттинга фракций. Общий пул мРНК, связанные с активным рибосомы могут быть определены с помощью связанных микрочипов ⁴ или глубокий анализ последовательности ^5. Белка ассоциации могут также быть стабилизированы соответствующие добавления сшивающего реагента ^6.

Polyribosome анализа из клеток млекопитающих Стоит также отметить, как отдельный протокол с точки зрения очевидных трудностей в создании условий, необходимых для получения стабильных полисом. Буферные системы в литературе широко переменной ^7-10, таким образом, может быть требование для камерного типа конкретных оптимизации лизис буфера, или столь же вероятно, что буферная система не так важны, как и пристальное внимание к работе с свежие лизатов хранится при низких температурах. Насколько нам известно систематической оценки параметров, влияющих на формирование млекопитающих polysome не сообщалось.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
polyallomer ultracentrifuge tube	Beckman Coulter Inc.	326823	1 x 3.5 in. (25x89mm)
Fluorinert	Sigma-Aldrich	F9755
Cycloheximde	Sigma-Aldrich	C-7698
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
BY4741	Open Biosystems	YSC1048	Other strains work equally well