Electroeluting fragmentos de ADN

Resumen

Este procedimiento permite la purificación de fragmentos de ADN con alto rendimiento.

Resumen

Purificada fragmentos de ADN se utilizan para diferentes propósitos en la biología molecular y pueden ser preparados por varios procedimientos. La mayoría de ellos requieren una electroforesis previa de los fragmentos de ADN a fin de separar la banda de interés. Entonces, esta banda se extirpa a cabo a partir de un gel de agarosa o de acrilamida y se purifica mediante el uso de cualquiera: unión y la elución de las partículas de vidrio o sílice, las membranas de DEAE-celulosa, "aplastar y absorber el método", electroelución o muy a menudo costosos kits de purificación de comerciales. Por lo tanto, la selección de un método dependerá principalmente de lo que está disponible en el laboratorio. El procedimiento electroelución permite purificar el ADN muy limpio para ser utilizado en un gran número de aplicaciones (secuenciación, radiomarcado, la restricción enzimática, modificación enzimática, etc clonación). Este procedimiento consiste en la colocación de la banda de ADN que contienen rodajas de agarosa o de acrilamida en los pozos de la muestra de la electroeluter, vigente en ese momento la aplicación hará que el fragmento de ADN para salir de la agarosa y por lo tanto quedar atrapado en una sal de colchón para ser recuperada más tarde por la precipitación con etanol.

Protocolo

1. Para la selección de fragmentos de ADN de interés para ser purificados, estos deben ser resueltos en geles de agarosa o acrilamida gel teñido con bromuro de etidio por electroforesis en buffer TBE 0.5X (Tris borato, EDTA) a 120 voltios durante 1 hora. Para ello, unos 700 ng de plásmido pProEx-GdMre11S (6000-pb) previamente digerido con NdeI y HindIII fue utilizada para liberar un fragmento de 900 pb (560 ng de plásmido y 84 ng del fragmento).
2. El tanque de electroeluter (Figura 1) debe ser llenado con TBE 0.5X distribuye por igual en cada lado de la meseta a mediados cuidando de no derramar en la meseta intermedia.
3. La banda seleccionada (o bandas) es cortada del gel, y se coloca en la cámara de muestras lo más cerca posible al canal V (una rebanada por pozo). Funcionamiento de amortiguación se debe agregar a cada grupo; lo suficiente para cubrir la porción de gel.
4. Cada canal V utilizados deben ser eliminados con una pipeta Pasteur para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada.
5. De 100 ul de 10 M NH ₄ acetato (para facilitar la visualización de una pequeña cantidad de azul de bromofenol se añade, justo lo suficiente para que el color) se añadió con suavidad dentro del canal V.
6. La tapa deberá estar cerrada con cuidado para evitar la resuspensión del colchón de sal.
7. Electroelución se inicia a 100 voltios durante 25 minutos.
8. Cuando se haya completado electrolution, 400 ul se retiran de V-canal, y se coloca en un tubo de microcentrífuga que se precipitó con 2 volúmenes de etanol frío y el glucógeno (recomendado para mejorar la recuperación de ADN) a 4 ° C durante 1 hora o toda la noche.
9. Centrifugar durante 20 minutos, retirar el sobrenadante y lavar con etanol al 70%.
10. Tubo seco y cuantificar el ADN a OD 260 nm.
11. La recuperación obtenida fue del 75% (63 ng recuperado 84 ng cuando fueron colocados en la V-canal).

Figura 1. Diagrama Electroeluter. Anod un cátodo se indican en cada lado del tanque, el ADN contenido en gel en rodajas (ilustrado como un cuadrado negro) migrarán hacia el cátodo, debido a su carga negativa. Entonces será atrapado en el cojín de la sal (representado como un triángulo negro invertido), ubicado en la V-canal.

Discusión

La duración de la ejecución dependerá en gran medida del tamaño de los fragmentos, por lo general de los fragmentos de hasta 20 kb 50 minutos a 1 hora es suficiente, mientras que para los pequeños fragmentos de luz UV monitoreo cada 10 minutos se requiere para evitar que el fragmento que pasar por el sal colchón y por lo tanto a la cámara de amortiguación anódica disminuye la recuperación. Es importante asegurarse de que cuando se establece el suministro de energía a 100 voltios, hay una mAmp actual por lo menos de 10. La banda de ADN se puede controlar mediante el uso de una lámpara UV-mano y detectar cuando este abandona el corte de gel. La sal de colchón también se puede hacer con 3 M de acetato de sodio.

Este procedimiento permite la purificación de ADN o ARN fragmentos de diferentes tamaños con una buena recuperación (80%) para ser radiomarcados, digeridos por las enzimas de restricción, procesados ​​por enzimas modificando, etc

Materiales

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
NdeI		New England Biolabs	R0111L
HindIII		New England Biolabs	R0104L
NH4 acetate		JTBaker	0596
agarose		Invitrogen	15510-027
Biophotometer		Eppendorf	6131 000 020
Electroeluter		IBI	UEA CAT 46000