Electroeluting фрагментов ДНК

Резюме

Эта процедура позволяет очистки фрагментов ДНК с высоким выходом.

Аннотация

Очищенные фрагменты ДНК, которые используются для различных целей в области молекулярной биологии, и они могут быть получены несколько процедур. Большинство из них нуждаются в предыдущие электрофореза фрагментов ДНК для того, чтобы отдельные группы интересов. Затем эта полоса вырезали из геля агарозы или акриламида и очищают, используя либо: обязательные и элюирования из стекла или кварца частиц, ДЭАЭ-целлюлозы мембран, "раздавить и замочить метод", электроэлюцией или очень часто дорогие коммерческие комплекты очистки. Таким образом, выбор метода будет зависеть главным образом от того, что имеется в лаборатории. Электроэлюцией процедура позволяет очистить очень чистой ДНК, которые будут использоваться в большом числе приложений (секвенирование, радиоактивной метки, ферментативные ограничение, ферментативной модификации, клонирование и т.д.). Эта процедура состоит в размещении ДНК группа содержащих агарозы или акриламида срезы в образце скважин electroeluter, то, применяя текущей сделает фрагмент ДНК, чтобы оставить агарозы и таким образом оказаться в ловушке подушке соль, подлежащих возмещению позднее осаждением этанолом.

протокол

1. Для того чтобы выбрать фрагменты ДНК, представляющие интерес для быть очищены, они должны быть решены в агарозном или гели акриламида гель окрашивали бромидом этидия с помощью электрофореза использованием 0.5X буфера TBE (Трис борат, ЭДТА) на 120 вольт в течение 1 часа. Для этого, ~ 700 нг плазмидной pProEx-GdMre11S (6000-б.п.), ранее переваривают NdeI и HindIII был использован для выпуска 900-б.п. фрагмент (560 нг плазмидной и 84 нг фрагмент).
2. Бак electroeluter (рис. 1) должны быть заполнены 0.5X КЭ равномерно распределенных в каждую сторону середины плато, заботясь о допускайте попадания ее на середину плато.
3. Выбранного диапазона (или полос) вырезается из геля, и помещен в камеру с образцом как можно ближе к V канала (один ломтик на лунку). Запуск буфера должны быть добавлены к каждой камере, просто достаточно, чтобы покрыть геля.
4. Каждый канал V использованы должен быть промыт пипетки Пастера, чтобы устранить любые пузырьки воздуха в ловушке.
5. Затем 100 мкл 10 М NH ₄ ацетат (для удобства представления небольшого количества бромфенолового синего добавляют ровно столько, чтобы цвет ее) мягко добавил внутри канала V.
6. Крышка должна быть закрыта осторожно, чтобы предотвратить любые ресуспендирования высокой подушке соль.
7. Электроэлюцией начинается при 100 вольт в течение 25 минут.
8. Когда electrolution завершен, 400 ул удаляются из V-канал, и помещен в микроцентрифужную трубки должны быть осаждали 2 объемов холодного этанола и гликогена (рекомендуется для улучшения восстановления ДНК) при 4 ° С в течение 1 часа или на ночь.
9. Центрифуга в течение 20 минут, удалите супернатант и промыть 70% этанолом.
10. Сухая труба и количественно ДНК в ОП 260 нм.
11. Восстановление получены составила 75% (63 нг восстановленные при 84 нг были размещены на V-канала).

Рисунок 1. Electroeluter диаграмме. Анод катода указаны на каждой стороне бака, ДНК, содержащейся в геле нарезанный (показано, как черный квадрат), будут мигрировать к катоду из-за его отрицательный заряд. Тогда это будет в ловушке соль подушке (представленных в виде перевернутой буквы черный треугольник), расположенный в V-канала.

Обсуждение

Продолжительность перспективе будет сильно зависеть от размера фрагментов, как правило, для осколков до 20 кб 50 минут до 1 часа достаточно, а для небольших фрагментов ультрафиолета мониторинг каждые 10 минут требуется для предотвращения фрагмент, чтобы пройти Подушка соль и, следовательно, к анодной камере буфера уменьшения восстановления. Важно, чтобы убедиться, что при установке блока питания на 100 вольт, то ток по крайней мере, 10 MAMP. ДНК группы можно контролировать с помощью УФ-лампы стороны и определить, когда это отказывается от геля. Подушка соли может быть также выполнена с 3 ацетат М Na.

Эта процедура позволяет очистки ДНК или РНК фрагменты разных размеров с хорошим восстановления (~ 80%), которые будут меченые, переваривается ферментами рестрикции, обработаны путем изменения ферменты и т.д.

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
NdeI		New England Biolabs	R0111L
HindIII		New England Biolabs	R0104L
NH4 acetate		JTBaker	0596
agarose		Invitrogen	15510-027
Biophotometer		Eppendorf	6131 000 020
Electroeluter		IBI	UEA CAT 46000