Protocolo para la cría de los mosquitos (A. gambiae)

Resumen

Este video muestra las técnicas generales utilizadas para criar Anopheles gambiae en el laboratorio. Los métodos para el cuidado de los mosquitos de laboratorio se ha demostrado en todas las etapas del ciclo de vida del organismo a partir de larvas a pupas a los adultos se alimentan de sangre.

Resumen

Este protocolo describe la cría de mosquitos en el insectario. Las habitaciones se mantienen insectario a 28 ° C y ~ 80% de humedad, con un 12 horas. ciclo día / noche. Para este procedimiento, tendrá las jaulas de los mosquitos, el 10% de sacarosa solución estéril, toallas de papel, vaso de precipitados, papel de filtro Whatman, alimentadores de vidrio, la sangre humana y baño de suero, agua, parafina, agua destilada, limpia bandejas de plástico, alimentos mosquito (que se describe abajo), neto para cubrir las bandejas, de vacío, y una cámara de recogida para recoger los adultos del mosquito.

Protocolo

Mosquito de alimentos:

1. Una comida: la comida de pescado a tierra (Aquaricare). Una pizca hay que añadir.
2. Alimentos B: tierra de alimentos CAT (Purina). Una pizca hay que añadir.
3. Alimentos C: comida para gatos (Purina). Dos tablas hay que añadir.

Sangre:

Animal o la sangre humana puede ser usado para los mosquitos trasero. Se recoge sangre fresca con una jeringa y poner en un tubo estéril de 15 ml que contiene 1 ml de Falcon CPD (anticoagulante) por cada 10 ml de sangre, luego se mezcla suavemente y se centrifuga a temperatura ambiente a 2000 rpm durante 5 min. Se desecha el sobrenadante, teniendo cuidado de quitar la costra que comprende las demás células sanguíneas (por ejemplo, WBC). El pellet de glóbulos rojos se suspende en un volumen igual de medio RPMI con pipeta, y además lavar en este medio en tres ocasiones. Después del lavado final, los glóbulos rojos pellets se resuspendieron en un volumen igual de medio RPMI y se almacenan a 4 ° C (se puede mantener durante 8-10 días). Justo antes de la alimentación, los glóbulos rojos (en RPMI) se centrifuga (2000 rpm durante 5 minutos) para precipitar a las células y los glóbulos rojos envasados ​​se vuelve a suspender en el suero (O + suero humano) para obtener un hematocrito del 40%. La sangre debe mantenerse a 37 ° C en cualquier momento de la alimentación.

DIA 1:

1. El 3-5 días de edad los mosquitos hembras adultas se alimentan de la sangre para poner sus huevos.
2. Para la alimentación de la sangre, una membrana artificial (parafina) método de alimentación se utiliza de la siguiente manera:
   
   
   1. Los glóbulos rojos (ver arriba para la preparación de la sangre) se mezclan con suero inactivado por calor para obtener un hematocrito ~ 40% (RBC 40% y 60% de suero). Esto se agrega a la alimentación de vidrio.
   2. El alimentador está conectado a una chaqueta de agua tibia (37 ° C), y se colocan en la jaula para permitir el acceso de los mosquitos a la superficie de la membrana.
   3. Los mosquitos se les permite la alimentación de aproximadamente 30 minutos.

DIA 3:

1. Las hembras ponen los huevos de dos días después de que se alimentan de sangre. Un pequeño papel de filtro envuelto en una forma cónica se coloca en un pequeño vaso con agua destilada, asegurándose de que el papel de filtro se humedece. El vaso se mantiene dentro de la jaula durante la noche para que los mosquitos ponen sus huevos.

DIA 4:

1. El papel de filtro que contiene los huevos del mosquito se coloca en una bandeja de plástico con alrededor de 300 ml de agua destilada. Una pizca de alimentos se añadirá a la bandeja de los huevos y se les permite a las larvas eclosionan en los próximos días.

DIAS 5-8:

1. Las larvas se alimentan de crecimiento todos los días con dos tablas de alimentos C, y supervisado por la densidad y la población. En el octavo día (5 días las larvas de edad), la población de larvas se diluye en una bandeja de ~ 10 bandejas, con una pizca de alimento A y C dos comprimidos de alimentos en cada bandeja. (~ 30 minutos)

Los días 9 - 12:

1. Las larvas se alimentan cada día con la comida C. El día 12 (9 larvas días de edad), el agua se cambia con el agua dulce y los alimentos se añade (una pizca de alimento B y dos tablas de alimentos C). Las pupas se empieza a desarrollar en esta etapa. Las bandejas están cubiertos con redes para evitar el escape de los adultos. (~ 80-10 minutos)

DÍA 13 - 15:

Las crisálidas se les permite salir a los adultos para los próximos 2 a 3 días. Los alimentos se da todos los días a las larvas / pupas con cuidado la eliminación de la red para evitar que escapen de los adultos.

DIA 16:

1. Los adultos se reúnen en una jaula a través de un aspirador conectado al vacío. La jaula consiste en una botella pequeña ml 100 con una mecha de algodón que se empapa con el 10% de sacarosa (autoclave) y un forro de toalla de papel en la parte inferior para absorber cualquier derrame potencial de azúcar que pueden ocurrir durante la manipulación de la jaula. (~ 30-40 minutos)

Día 17 - 21:

1. Los adultos (hombres y mujeres) se les mantiene en la sala de insectario durante 4-5 días, alimentadas con sacarosa al 10% antes de que sean de nuevo la sangre alimenta al comenzar el siguiente ciclo. Los mosquitos pueden utilizar los mismos para poner los huevos más de una vez.
2. Los mosquitos que no son necesarios para los experimentos de cría o puede ser muerto por la colocación de la jaula en un congelador. Las bandejas utilizadas y las jaulas deben limpiarse y secarse antes de que puedan ser utilizados de nuevo.

NOTA: No puede haber algunas variaciones en el método de cría de mosquitos y laboratorios diferentes pueden tener diferentes técnicas.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Food A		Aquaricare		Grounded fish food. A small pinch needs to be added.
Food B		Purina		Grounded cat food. A small pinch needs to be added.
Food C		Purina		Cat food. Two tablets needs to be added
RBC				prepared red blood cells: 40% hematocrit in human serum
RPMI	Medium
CPD				anticoagulant
serum				O+ human serum
Mosquito feeder
parafilm
Anopheles gambiae				mosquitos
10% sucrose				mosquito food
insectary