Protocole pour l'élevage des moustiques (A. gambiae)

Résumé

Cette vidéo illustre les techniques générales utilisées pour l'arrière Anopheles gambiae dans le laboratoire. Les méthodes pour prendre soin de moustiques de laboratoire sont démontrées par tous les stades du cycle de vie de l'organisme à partir de larves en pupes au sang maternel adultes.

Résumé

Ce protocole décrit l'élevage de moustiques dans l'insectarium. Les chambres insectarium sont maintenus à 28 ° C et ~ 80% d'humidité, avec un HR 12. cycle jour / nuit. Pour cette procédure, vous aurez besoin de cages de moustiques, 10% d'une solution de saccharose stérile, des serviettes en papier, bécher, papier-filtre Whatman, les mangeoires de verre, le sang humain et le sérum bain d'eau, parafilm, eau distillée, nettoyer des bacs en plastique, de la nourriture contre les moustiques (décrit ci-dessous), déduction faite de couvrir les plateaux, vide, et une chambre de collecte pour recueillir moustiques adultes.

Protocole

Alimentaires des moustiques:

1. Alimentation A: la nourriture des poissons à la terre (Aquaricare). Une petite pincée doit être ajouté.
2. Alimentation B: mise à la terre la nourriture CAT (Purina). Une petite pincée doit être ajouté.
3. Alimentation C: aliments pour chats (Purina). Deux comprimés doit être ajouté.

Sang:

Sang animal ou humain peut être utilisé pour les moustiques à l'arrière. Le sang frais est recueilli avec une seringue et mettre dans un tube stérile de 15 ml contenant 1 ml de Falcon DPC (anticoagulant) pour chaque 10 ml de sang, puis mélangés doucement et centrifugé à température ambiante à 2000 rpm pendant 5 min. Le surnageant est écarté, en prenant soin d'enlever la couche leuco qui comprend d'autres cellules sanguines (par exemple WBC). Le culot de RBC est ensuite suspendu dans un volume égal de milieu RPMI par pipetage, et encore lavé dans ce trois moyennes fois. Après le lavage final, les globules rouges granulés sont remis en suspension dans un volume égal de milieu RPMI et conservés à 4 ° C (peut être conservé pendant 8-10 jours). Juste avant l'alimentation, la RBC (dans RPMI) est centrifugé (2000 rpm pendant 5 min) pour obtenir un culot en bas des cellules, et la RBC emballé est remis en suspension dans le sérum (O + sérum humain) afin d'obtenir un hématocrite de 40%. Le sang doit être conservé à 37 ° C toujours à l'alimentation.

JOUR 1:

1. Les 3-5 jours moustiques adultes âgés féminins sont nourris de sang pour pondre leurs œufs.
2. Pour nourrir le sang, une méthode de membrane artificielle alimentation (parafilm) est utilisé comme suit:
   
   
   1. Les globules rouges (voir ci-dessus pour la préparation du sang) sont mélangés avec du sérum inactivé par la chaleur pour obtenir un hématocrite ~ 40% (emballé RBC 40% et 60% de sérum). Ceci est ajouté à l'alimentation en verre.
   2. Le chargeur est relié à une chaude enveloppe d'eau (37 ° C), et placée sur la cage pour permettre l'accès des moustiques à la surface membranaire.
   3. Les moustiques sont autorisés à nourrir pour ~ 30 minutes.

JOUR 3:

1. Les femelles pondent des œufs deux jours après ils se nourrissent de sang. Un petit papier filtre enveloppé dans une forme conique est placé dans un petit bécher contenant de l'eau distillée, en s'assurant que le papier filtre est humide. Le bécher est gardé à l'intérieur de la cage durant la nuit pour les moustiques de pondre des œufs.

JOUR 4:

1. Le papier filtre contenant les œufs des moustiques est placé dans un bac en plastique avec environ 300 ml d'eau distillée. Une pincée de nourriture A est ajoutée à la barre et les oeufs sont autorisés à éclore au cours de larves les prochains jours.

JOURS 5 - 8:

1. Larves en croissance sont nourris chaque jour avec deux comprimés de nourriture C, et surveillés pour la densité et la population. Le huitième jour (5 jours larves âgées), la population des larves est dilué de 1 Bac à ~ 10 plateaux, avec une pincée de nourriture A et deux comprimés de C des aliments dans chaque bac. (~ 30 minutes)

JOURS 9 - 12:

1. Les larves sont nourries chaque jour avec de la nourriture C. Sur le 12ème jour (9 jours larves âgées), l'eau est changée avec de l'eau fraîche, et la nourriture est ajoutée (une pincée de nourriture B et deux comprimés de nourriture C). Les nymphes commence à se développer à ce stade. Les plateaux sont couverts de filets pour éviter de sortir des adultes. (~ 80 à 10 mn)

JOUR 13 - 15:

Les nymphes sont autorisés à émerger aux adultes pour les 2 prochains - 3 jours. La nourriture est donnée tous les jours pour les larves / nymphes par enlevant soigneusement le net pour éviter l'échappement des adultes.

JOUR 16:

1. Les adultes sont recueillis dans une cage à travers un aspirateur relié à vide. La cage se compose d'un petit flacon de 100 ml avec une mèche de coton qui a été trempé avec du saccharose à 10% (autoclave) et une doublure serviette en papier sur le fond pour absorber les déversements potentiels de sucre qui peut se produire pendant la manipulation cage. (~ 30-40 minutes)

JOUR 17 - 21:

1. Les adultes (mâles et femelles) sont ensuite conservés dans la salle insectarium pour les 4-5 jours, nourri de 10% de saccharose avant qu'ils ne soient à nouveau du sang nourris pour commencer le cycle suivant. Les moustiques mêmes peuvent être utilisées pour pondre plus d'une fois.
2. Les moustiques qui ne sont pas nécessaires pour des expériences ou de l'élevage peuvent être tués en plaçant la cage dans un congélateur. Les plateaux utilisés et les cages doivent être nettoyés et séchés avant qu'ils puissent être utilisés à nouveau.

REMARQUE: Il peut y avoir quelques variations dans la méthode d'élevage des moustiques et des laboratoires différents peuvent avoir différentes techniques.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Food A		Aquaricare		Grounded fish food. A small pinch needs to be added.
Food B		Purina		Grounded cat food. A small pinch needs to be added.
Food C		Purina		Cat food. Two tablets needs to be added
RBC				prepared red blood cells: 40% hematocrit in human serum
RPMI	Medium
CPD				anticoagulant
serum				O+ human serum
Mosquito feeder
parafilm
Anopheles gambiae				mosquitos
10% sucrose				mosquito food
insectary