Протокол Mosquito воспитание (А. gambiae)

Резюме

Это видео демонстрирует общие методы используются для задних Anopheles gambiae в лаборатории. Методы по уходу за лаборатории комаров демонстрируются на всех этапах жизненного цикла организма от личинки до куколки с питающимися кровью взрослых.

Аннотация

Этот протокол описывает комаров воспитания в insectary. Insectary номера поддерживается на уровне 28 ° С и ~ 80% влажности, с 12 час. дневной / ночной цикл. Для этой процедуры вам понадобится комаров клетки, 10% стерильный раствор сахарозы, бумажные полотенца, стакан, ватман фильтровальной бумаги, стекла машин, человеческой крови и сыворотки, водяная баня, парафильмом, дистиллированная вода, чистые пластиковые лотки, москитные пищи (описанных ниже), москитные сетки для покрытия лотков, вакуум, и сборной камеры для сбора взрослых.

протокол

Mosquito пищи:

1. Продовольственная: заземленной рыб (Aquaricare). Небольшой щепоткой должна быть добавлена.
2. Продовольственная B: заземленной Корм ​​для кошек (Purina). Небольшой щепоткой должна быть добавлена.
3. Продовольственная C: корм для кошек (Purina). Две таблетки нужно добавить.

Кровь:

Животные или крови человека может быть использован для заднего комаров. Свежая кровь собирается с помощью шприца и положить в стерильные 15 мл Сокол пробирку, содержащую 1 мл КПИ (антикоагулянт) на каждые 10 мл крови, затем смешивают мягко и центрифугировали при комнатной температуре при 2000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Супернатант отбрасывается, заботясь, чтобы удалить слой кровяного сгустка, который содержит другие клетки крови (например, WBC). РБК гранулы затем приостановлено в равном объеме средней RPMI с помощью пипетки, а в дальнейшем мыть в этой среде в три раза. После последней промывки, гранулированный эритроцитов ресуспендируют в равном объеме средней RPMI и хранили при 4 ° С (может храниться в течение 8-10 дней). Непосредственно перед кормлением, РБК (в RPMI) центрифугируют (2000 оборотов в минуту в течение 5 мин) для осаждения вниз клетки и упакованные РБК ресуспендировали в сыворотке крови (O + сыворотки крови человека), чтобы получить 40% гематокрита. Кровь должна храниться при температуре 37 ° C всегда для кормления.

ДЕНЬ 1:

1. 3-5 день старого взрослой самки комаров питаются кровью, чтобы отложить яйца.
2. Для питания кровью искусственные мембраны (парафильмом) кормление метод используется следующим образом:
   
   
   1. Красные кровяные клетки (см. выше препаратов крови) смешиваются с тепло инактивированной сыворотки, чтобы получить ~ 40% гематокрита (в упаковке РБК 40% и 60% сыворотки). Это добавляется в стекло подачи.
   2. Питатель соединен с теплой водой рубашку (37 ° С), и размещен на клетку, чтобы позволить доступ комаров к поверхности мембраны.
   3. Комары могут кормить в течение ~ 30 минут.

ДЕНЬ 3:

1. Самки откладывают яйца два дня после того как они питаются кровью. Небольшой бумажный фильтр, завернутые в конической формы помещается в небольшой стакан с дистиллированной водой, убедившись, что фильтровальная бумага становится влажной. Стакан хранится внутри клетки на ночь для комаров, чтобы отложить яйца.

4 день:

1. Фильтр документ, содержащий комара яйца помещают в пластиковый лоток с ~ 300 мл дистиллированной воды. Щепотку пищу добавляется в лоток и яйца разрешается люк, чтобы личинки в течение ближайших дней.

ДНИ 5 - 8:

1. Растущие личинки питаются каждый день две таблетки пищевых C и контролируется на предмет плотности и численности населения. На восьмой день (5 дневных личинок), личинки населения разбавляется от 1 лоток до ~ 10 лотков, с щепоткой пищевой и две таблетки пищевых C в каждом лотке. (~ 30 мин)

ДНИ 9 - 12:

1. Личинки питаются каждый день во время еды С. На 12-й день (9 дневных личинок), замене воды с пресной водой и продовольствием добавляется (щепотку пищевой B и две таблетки пищевых С). Куколки начинает развиваться на данном этапе. Лотки покрыты сетями, чтобы избежать побега взрослых. (~ 8-10 мин)

ДЕНЬ 13 - 15:

Куколки разрешено появляться на взрослых в течение следующих 2 - 3 дня. Продовольственная дается каждый день, чтобы личинки / куколки, тщательно удаляя сети, чтобы избежать побега взрослых.

ДЕНЬ 16:

1. Взрослых собираются в клетку через аспиратор подключен к вакуум. Клетка состоит из небольшого 100 мл флакон с хлопковый фитиль, который пропитывается 10% сахарозы (автоклавного) и подкладкой бумажное полотенце на дно, чтобы впитать любого потенциального разлива сахара, которые могут возникнуть во время обработки клетки. (~ 30-40 мин)

ДЕНЬ 17 - 21:

1. Взрослые (мужчины и женщины), которые затем хранятся в insectary комнате в течение 4-5 дней, кормили на 10% сахарозы, прежде чем они снова кровь поступает начать следующий цикл. Же комары могут быть использованы, чтобы отложить яйца несколько раз.
2. Комаров, которые не нужны для экспериментов или воспитания могут быть убиты, разместив клетку в морозильную камеру. Использоваться лотки и клетки должны быть очищены и сушат, прежде чем они могут быть использованы снова.

ПРИМЕЧАНИЕ: Там могут быть некоторые изменения в метод воспитания комаров и разных лабораториях могут быть разные методы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Food A		Aquaricare		Grounded fish food. A small pinch needs to be added.
Food B		Purina		Grounded cat food. A small pinch needs to be added.
Food C		Purina		Cat food. Two tablets needs to be added
RBC				prepared red blood cells: 40% hematocrit in human serum
RPMI	Medium
CPD				anticoagulant
serum				O+ human serum
Mosquito feeder
parafilm
Anopheles gambiae				mosquitos
10% sucrose				mosquito food
insectary