Farmacología del Comportamiento en el condicionamiento clásico de la respuesta de Extensión probóscide en abejas de la miel ( Apis mellifera)

Resumen

Se demuestra cómo implementar un método de farmacología del comportamiento en un paradigma de condicionamiento apetitivo olfativo de las abejas (Apis mellifera) mediante la aplicación sistémica de fármacos. Este método permite la investigación de los mecanismos de aprendizaje subyacente y formación de la memoria de una manera sencilla y fiable.

Resumen

Las abejas melíferas (Apis mellifera) son bien conocidos por sus habilidades de comunicación y orientación y por su impresionante capacidad de aprendizaje ^1,2. Debido a que la supervivencia de una colonia de abejas depende de la explotación de fuentes de alimento, las abejas picadoras aprender y memorizar los sitios variable de flores, así como su rentabilidad. Forrajera abejas pueden ser entrenados fácilmente en un ambiente natural donde se alimentan en un sitio de alimentación y aprender las señales relacionadas, tales como el olor o color. Aprendizaje asociativo apetito también puede ser estudiada bajo condiciones controladas en el laboratorio por el condicionamiento de la respuesta de extensión probóscide (PER) de forma individual aprovechar las abejas ^3,4. Este paradigma de aprendizaje permite el estudio de los mecanismos neuronales y moleculares que subyacen en el aprendizaje y la formación de la memoria de una manera sencilla y muy fiable ^05.12. Un enfoque de la farmacología conductual se utiliza para estudiar los mecanismos moleculares. Los medicamentos son inyectados sistémicamente para interferir con la función de moléculas específicas durante o después del aprendizaje y la formación de la memoria ^13-16.

Aquí se demuestra cómo entrenar a las abejas aprovechada en el acondicionamiento de PER y la forma de aplicar los medicamentos sistémica por inyección en el músculo de vuelo de las abejas.

Protocolo

1. Las abejas la captura de la colmena

1. Un día antes de que el experimento comienza, entre 2 y 4 de la tarde, dejando a las abejas de la colmena se encuentran atrapados. Para ello, una luz UV permeable pirámide de plexiglás (altura = 30 cm, el ápice de 3,5 x 3, 5 cm, base 18 x 18 cm), que se puede cerrar en el vértice y la base, se mantiene en un 20 - 30 cm de distancia frente a la entrada de la colmena con la base abierta y el ápice cerrado para que las abejas de la colmena dejando entrar a la base de la pirámide. La base se cierra y las abejas capturadas se haya traído al laboratorio para su posterior manejo.

2. La transferencia de las abejas de la Pirámide en viales de vidrio

1. En el laboratorio, la pirámide se coloca en su base. Las paredes de la pirámide son oscuras (por ejemplo, con una toalla), pero el vértice se deja sin cubrir. Debido a su fototaxis positivo, las abejas dejan la pirámide a través de la punta cuando se abre. Uno por uno, las abejas se transfieren de la pirámide en viales de vidrio mediante la celebración de los viales en el ápice abierto. Un vial es utilizada por las abejas. Por lo tanto, el vértice se cierra cuando una abeja entra en el vial.

3. Las abejas en el aprovechamiento de los tubos

1. Las abejas son inmovilizados por el enfriamiento en los viales de vidrio en el hielo de 2,5 a 3,5 min. Es recomendable ver la abeja y retírela del hielo tan pronto como se detiene el movimiento.
2. Una sola abeja inmovilizado se aprovecha en un pequeño tubo de plástico con cinta adhesiva, de tal forma que es capaz de mover su probóscide libremente, pero no su cabeza, el tórax o piernas. Es importante que el cuello no está comprimido.
3. Cada abeja fija en un tubo de plástico se coloca en un pozo numerados en una rejilla para un mejor manejo e identificación. Después de haber sido eliminado para la recuperación de la memoria acondicionado o el tubo siempre se devuelve a la perforación misma.

4. Las abejas de alimentación

1. En la primera noche (04.06 horas), después de ser capturado, las abejas se alimentan hasta la saciedad con una solución de sacarosa (0,88 M, el azúcar blanco refinado hogar disuelto en el agua del grifo). Para alimentar a una abeja, su PER se produce al tocar sus antenas con una solución de sacarosa y el animal se le permite consumir una gota (4 l) de solución de sacarosa. Las abejas se alimentan una tras otra varias veces hasta que ya no muestran un PER rápido y fiable cuando las antenas se tocan con una solución de sacarosa.
2. En todas las noches posteriores (4-6 horas) de las abejas se alimentan experimento, uno tras otro cuatro veces con una gota de solución de sacarosa (4 l, 0,88 M, azúcar blanco refinado resuelto en el agua del grifo). Es importante que la solución de sacarosa no se unta en las antenas de las abejas o la trompa durante la alimentación y que los tubos no están contaminadas con solución de sacarosa. Las abejas no deben ser alimentados en o cerca del lugar acondicionado para excluir la posibilidad de asociar un contexto de formación con el estímulo de la sacarosa.

5. Apicultura aprovechó la noche

1. Las abejas se mantienen durante la noche en un recipiente de plástico a temperatura ambiente. El agua del grifo se introduce en el recipiente (aproximadamente 0,5-1 cm de alto). Los bastidores con las abejas aprovechada se colocan en el recipiente por encima de la línea de flotación con placas de ELISA como una plataforma. Finalmente, el recipiente está cubierto con cartón.

6. Acondicionamiento olfativo

En la primera mañana (10 am) del experimento de condicionamiento olfativo se lleva a cabo. El estímulo condicionado (EC) es un olor, el estímulo no condicionado (EE.UU.) es una solución de sacarosa.

1. 4 l de los olores (por ejemplo, el aceite de clavo) se pipeta en un papel filtro redondo (1,3 cm de diámetro) que se inserta en una jeringa de 20 ml. El olor es una pipeta bajo una campana y puntas con filtro se utilizan para evitar la contaminación de la pipeta.
2. El bastidor con las abejas aprovechado se encuentra cerca del lugar acondicionado 30 minutos antes del procedimiento de acondicionamiento se inicia, pero a una distancia al lugar en el frente de un tubo de escape, donde las abejas individuales están condicionados.
3. Acondicionamiento consiste en tres pares de olores (el estímulo condicionado, CS) y la solución de sacarosa (el estímulo incondicionado, EE.UU., 1,25 M) con un intervalo entre ensayos (ITI) de 10 min. Una señal acústica entregado al investigador a través de un reproductor de audio garantiza la sincronización exacta de inicio del estímulo, el estímulo de desplazamiento, la duración del estímulo y de colocación. Un ensayo de adquisición se inicia con la colocación de 10 segundos del animal frente a un tubo de escape. Poco antes del final de la 10 segundos de la jeringa que contiene el olor es 3 cm en la parte delantera de la abeja dirigida a las antenas de las abejas. Posteriormente, el olor se presenta durante 5 segundos, al empujar a 20 ml de aire a través de la jeringa. Después de los primeros 3 segundos los flagelos distal de ambas antenas se tocan con una solución de sacarosa-humedecido palillo de dientes y los animales se les permite lamer el palillo moistend durante 4 segundos. 13 segundos después de que el CS termina la estimulación, las abejas se toman fuera del contexto de la formación y la vuelve a colocar en el estante. En total, un ensayo de formación dura 28 segundos.
   Es importante que ni las antenas de las abejas, ni trompa están cubiertos con sacarosa después del acondicionamiento. Por lo tanto, hay que asegurarse de que el palillo de dientes es sólo humedecido con solución de sacarosa y que no se forman gotas de sacarosa solución en el palillo de dientes.
4. Después del acondicionamiento los bastidores se colocan de nuevo en el bol.
5. Comportamiento de los animales durante el experimento, es decir, la aparición del PER durante la colocación y el CS y la presentación de EE.UU., es monitoreado y observado por el experimentador.

7. Retención de la memoria

1. Pruebas de retención se puede realizar en cualquier intervalo (min a día). El estante de las abejas se coloca cerca del lugar acondicionado 30 minutos antes de la prueba de memoria comienza.
2. Una prueba de la memoria consta de 5 segundos presentación CS sin presentación en EE.UU.. La prueba dará comienzo con la colocación de 10 segundos de los animales frente a los gases de escape. Posteriormente, el olor se presenta durante 5 segundos como se describió anteriormente. El comportamiento de los animales, es decir, la aparición del PER durante la colocación y la presentación CS es anotado durante el experimento.
3. Al final del experimento, la respuesta de extensión trompa vuelve a tocar provocada por las antenas con una solución de sacarosa para asegurarse de que el animal todavía es capaz de extender su probóscide.

8. Inyección sistémica

El punto en el tiempo de inyección sistémica depende del diseño experimental.

1. Un pequeño agujero se hace en la cutícula de la parte posterior del escudo al lado de la fisura scutal por encima de los ¹⁷ músculos de vuelo mediante el uso de una aguja hipodérmica desechable (21 G).
2. El uso de un tubo capilar de vidrio, una solución de l se inyecta a través del agujero en la cutícula en el músculo de vuelo. Experimentadores capacitados son capaces de inyectar una abeja cada 30 segundos, lo que permite una sincronización precisa de la inyección y el acondicionamiento.

9. Las abejas alimentación durante el experimento

1. En la tarde (4-6 pm), después del acondicionamiento, las abejas se alimentan uno tras otro cuatro veces con una gota de solución de sacarosa (4 l, 0,88 M, el azúcar blanca refinada disuelta en el agua del grifo). Es importante que la solución de sacarosa no se unta en las antenas de las abejas o la trompa durante la alimentación y que los tubos no están contaminadas con solución de sacarosa. Las abejas no deben ser alimentados en o cerca del lugar acondicionado para excluir la posibilidad de asociar un contexto de formación con el estímulo de la sacarosa.

10. Recopilación y análisis de datos

1. La aparición de la respuesta de extensión probóscide durante el experimento se controla. Una abeja se obtuvo resultados positivos si se extiende su trompa entre la aparición de la CS y la presentación de los EE.UU. (en formación) o durante la presentación del CS (durante la fase de prueba), cruzando una línea virtual entre las mandíbulas abiertas.
2. Para ser incluido en el análisis de los animales debe cumplir dos criterios: deben sobrevivir al experimento, y deben mostrar la respuesta incondicionada extensión probóscide (PER) a la solución de sacarosa al final del experimento. El porcentaje de las abejas que muestra el PER durante la adquisición y retención de pruebas se ha trazado para cada presentación CS.

11. Los resultados representativos:

Dos experimentos se presentan aquí.

En el primer experimento nos fijamos en el impacto de la inyección sistémica de tampón fosfato salino (PBS, en mM: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10,1 Na ₂ HPO _4, 1,8 KH ₂ PO _4, pH 7, 2) en el aprendizaje y largo plazo la formación de recuerdos. Tres grupos de abejas fueron entrenados con tres pares de CS-Estados Unidos, con un intervalo entre ensayos de 10 minutos: un grupo no tratado, un grupo que fue inyectado con una l PBS 30 minutos antes del entrenamiento, y un grupo de simulación de inyección de tratados de la misma forma que el grupo PBS-inyectado, pero sin inyectar PBS. 24 horas después de entrenamiento de la memoria se ha probado con una presentación de CS en los tres grupos. El porcentaje de animales con la respuesta condicionada durante el acondicionamiento se incrementa significativamente en los tres ensayos de entrenamiento (Fig. 1, ANOVA para medidas repetidas en el factor tiempo F ₂₃₇₈ = 340,456, p <0,05). No hay diferencia en PER se pudo observar entre los tres grupos durante el condicionamiento (ANOVA para medidas repetidas en el factor de los grupos F2, 189 = 1,299, p> 0,05). Esto es válido para una prueba de retención de 24 horas (F2, 187 = 0,752, p> 0,05) al comparar los animales no tratados con PBS-animales inyectados con la simulada inyectado.

En el segundo experimento se demuestra la inhibición de la retención de la memoria de tres y cuatro días después del entrenamiento, cuando el inhibidor de la síntesis de proteínas anisomicina (10 mM) se inyectados sistémicamente 30 minutos después de tres parejas EC-EI. Comparación de un grupo de anisomicina-inyectados con un grupo de PBS-inyectado revela una diferencia significativa entre los grupos durante la t de retenciónest (Fig. 2, ANOVA para medidas repetidas en el factor grupo de F1, 94 = 8,86, p <0,05). Una diferencia importante se observa en la prueba de memoria en los días 3 y 4. Esto se asemeja a los resultados de Wüstenberg et al. ^18, que también condicionó las abejas, con tres pares de CS-Estados Unidos, aunque con un protocolo diferente.

Figura 1. Lesión de la cutícula o la inyección de PBS no altera la adquisición y retención de la memoria. Los animales fueron entrenados con tres parejas EC-EI (la adquisición). Después de 24 h, se puso a prueba la memoria (memoria de retención). Treinta minutos antes del entrenamiento, un agujero se hizo en la cutícula de los dos grupos (lesión, PBS) y uno de estos grupos se les inyectó una l PBS (PBS). Un tercer grupo fue dejado intacto (sin tratamiento). Que se presenta es el porcentaje de animales de cada grupo responde a la presentación de olor con un PER. Un ANOVA no reveló diferencias significativas entre los grupos en la fase de adquisición (F2, 189 = 1,299, p> 0,05) o en la retención de la memoria (F2, 187 = 0,752, p> 0,05).

Figura 2. La inyección de anisomicina 40 minutos después del último emparejamiento EC-EI reduce la retención de memoria de tres días y cuatro días después del entrenamiento. Los animales fueron entrenados con tres parejas EC-EI (adquisición) y se inyecta con una l mM anisomicina 10 (Aniso) o 1 l de PBS 1 h después de la prueba de entrenamiento. Se puso a prueba la memoria (memoria de retención) 24 h, 48 h, 72 y 96 h después. Que se presenta es el porcentaje de animales de cada grupo responde a la presentación de olor con un PER. La inyección de anisomicina conduce a una reducción significativa de la memoria de retención de 72 y 96 h después del entrenamiento (F1, 94 = 8.86, p <0,05) como lo revela un análisis de varianza.

Discusión

1. La captura de abejas: Para recoger las abejas libando con experiencia, las abejas están cayendo en la mañana o por la tarde, evitando el momento en que las abejas jóvenes son el ¹⁹ de vuelos de orientación. Recolectoras recopile polen o néctar. Las diferencias entre el polen y el néctar de forraje se han observado de acuerdo a su capacidad de respuesta de azúcar y su capacidad de aprendizaje ^20. Con el fin de atrapar recolectores sólo néctar, una fuente de alimento artificial llena de una solución de sacarosa se pueden instalar cerca de la colmena y los animales pueden ser recogidos allí. Recolectoras de polen de regresar a la colmena pueden ser identificados por las canastas de polen en sus patas traseras ^20.
2. La fijación y manipulación: enfriamiento extendido de las abejas en el hielo se debe evitar porque podría afectar su capacidad para aprender y sobrevivir hasta el final del experimento. Tarsos tienen que fijarse cuidadosamente dentro del tubo para evitar la estimulación accidental con una solución de sacarosa. Esto es importante, porque las abejas se ha demostrado que aprender por la estimulación del tarso con una solución de succrose ^3,21.
3. Condicionamiento olfativo: el número de ensayos de condicionamiento, el intervalo entre ensayos, y el punto de prueba de tiempo puede variar dependiendo del enfoque del estudio ^3,22.
4. Alimentación: El nivel de saciedad de las abejas se sabe que afectan a su rendimiento en el aprendizaje y la retención de la memoria ^3,23. Esto tiene que ser tenido en cuenta en la planificación de los experimentos.
5. Inyección: sacos de aire se encuentran en el tórax de abejas ^17. Estas partes vitales del sistema respiratorio son necesarios para la supervivencia. Por lo tanto se debe tener cuidado de no dañar los sacos de aire durante la inyección. La liberación de las burbujas de aire indica daños a los sacos de aire.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syringe Omnifix 20 ml	B. Braun Medical	4616200 V
White refined household sugar	Kaisers Supermarket, Berlin, Germany
Clove oil	Bombastus, Freital, Germany
Multipette plus	Eppendorf	4981 000.019
Rack for 30 bee tubes	Home made
Plastic tubes	Home made
UV light-permeable plexiglass pyramid	Home made		height = 30cm,apex 3.5 x 3.5cm,base 18x18cm
Sticky tape	Tesa, Hamburg, Germany
Capillator sticks 1-5μl	Selzer
Capillator tips 1-5μl	Selzer
Filter paper 0.16-0.2 mm thick	Macherey-Nagel	MN 616 or MN615	Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter
Disposable hypodermic needle	B. Braun Medical	4657683	0.45 mm diameter