El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

Resumen

En este protocolo, la expresión de genes en la levadura ( Saccharomyces cerevisiae) Se cambia después de la exposición al estrés oxidativo inducido por la adición de peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂), Un agente oxidante.

Resumen

En este protocolo, la expresión de genes en la levadura (Saccharomyces cerevisiae) se cambia después de la exposición al estrés oxidativo inducido por la adición de peróxido de hidrógeno (H ₂ O _2), un agente oxidante. En el experimento, la levadura se cultiva durante 48 horas en caldo YPD 1/2X que contiene glucosa 3X. La cultura se divide en un grupo control y el tratamiento. La cultura del experimento se trata con 0,5 mM H ₂ O ₂ en solución salina tamponada Hanks (HBSS) durante 1 hora. La cultura de control se trata con HBSS solamente. El ARN total se extrae de las dos culturas y se convierte en un producto marcado con biotina cRNA a través de un proceso de múltiples pasos. El producto final de síntesis es llevado de vuelta al Fondo para el núcleo UVM microarrays y se hibridan con la levadura GeneChips Affymetrix. Los datos resultantes expresión génica se cargan en el software de análisis de datos de bioinformática.

Protocolo

1. Aislamiento de ARN total de Saccharomyces cerevisiae Con lisis enzimática

1. Prepare una zona de trabajo libre de RNasa con RNasa ZAP (Ambion).
2. Prepare el reactivo de trabajo fresco liticasa mediante la adición de 1 ml de agua libre de RNasa directamente al vial liticasa para hacer una solución de trabajo final de 10 U / ul. Vortex bien e invertir varias veces para asegurar una mezcla completa. Este 10 unidades / l solución es estable durante 12 horas.
3. Prepare frescos DNasa solución que usar el kit Qiagen DNasa y almacenar en el hielo.
4. Etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml con su información de identificación. La transferencia de 1,5 ml de cultivo de levadura adecuado en el tubo.
5. Centrifugar el tubo a 5000 xg (aproximadamente 3 / 4 de alta velocidad) durante 2 minutos a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante (sin molestar a pellet) con una micropipeta y descartar el sobrenadante.**** Repita el paso 4 si el tamaño del pellet es demasiado pequeño o si está indicado por el instructor .****
6. Añadir agua DEPC 1000 l para el pellet, vortex y centrifugar a 5000 xg durante 2 minutos. Eliminar el sobrenadante. Eliminar la mayor cantidad de líquido posible de la pastilla de levadura.
7. Añade lo siguiente al de la levadura de pellets y agitar para mezclar.
   
8. Se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
9. Haga girar suavemente el tubo cada 10 minutos para generar esferoplastos. Esferoplastos se deben manejar con cuidado. Examine la levadura bajo el microscopio para observar spheroplasting completa. Al examinar la levadura en el portaobjetos, añadir una pequeña cantidad de SDS 0,1% a causa de que la levadura se hinchan y forman esferas perfectas (incluso para las células en ciernes). Esto indica que las paredes celulares se han digerido.
10. Añadir 350 l b-RLT búfer en el tubo y agitar Vigorosamente Durante 1 minuto. Asegúrese de que el tubo está bien tapado por la celebración de la tapa cerrada mientras agitación. Este procedimiento se lisan los esferoplastos.
11. Añadir 250 l de etanol al 100% en el tubo y agitar brevemente. Puede formarse un precipitado después de la adición de etanol, pero esto no afectará la recolección de ARN.
Recolección de la ARN: Etiqueta un spin columna RNeasy con su identificación informationand transferir cuidadosamente toda la solución del paso 10 a la columna de centrifugación utilizando una micropipeta. Tenga cuidado de no tocar la membrana de sílica con la punta de la pipeta. Cerrar el tubo y centrifugar durante 15 segundos a máxima velocidad. El ARN en la muestra se adhieren a la membrana de sílica de la columna de giro.
12. Eliminar la columna de giro del tubo de recolección. Pipeta el paso a través del líquido (líquido en el tubo de recogida) de nuevo en la columna de centrifugación y centrifugar de nuevo. Deseche el tubo de recogida (con el flujo a través de líquidos) y coloque la columna en un nuevo spin 2 ml tubo de recolección.
13. Añadir 350 l RW1 buffer a la columna de giro. Esta solución se utiliza para lavar el ARN y eliminar las sales y restos celulares disuelto. Cerrar el tubo y centrifugar durante 15 segundos a máxima velocidad.
La digestión del ADN: Eliminar la columna de giro de la centrífuga, abra la tapa del tubo y añadir 80 l de DNasa solución que a la mitad de la membrana spin columna. Este paso va a digerir cualquier ADNg en la muestra. Cierre la tapa de la columna y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos.
14. Transferencia de la columna de giro de un nuevo tubo de recogida de 2 ml.
Limpieza y lavado de ARN: Añadir 350 l RW1 búfer en la columna de centrifugación y centrifugar a toda velocidad durante 15 segundos.
15. Descartar el tubo colector y coloque la columna de giro en un nuevo tubo de recogida de 2 ml.
16. Añadir 500 buffer RPE l en la columna de giro para lavar el ARN en la membrana de sílica. Cerrar el tubo y centrifugar durante 15 segundos a máxima velocidad.
17. Descartar el tubo colector y coloque la columna de giro en un nuevo tubo de recogida de 2 ml.
18. Lave la membrana de sílica de nuevo por la adición de otro buffer RPE 500 l en la columna de giro. Cerrar el tubo y centrifugar durante 15 segundos a máxima velocidad.
19. Colocar la columna de giro en un nuevo tubo de recogida de 2 ml y centrifugar en una microcentrífuga a máxima velocidad durante 1 minuto para asegurar que cualquier líquido residual se elimina de la membrana de sílica.
Recuperación de la ARN: Transferencia de la columna RNeasy spin a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 ml que se ha marcado con su información de la muestra. Tenga en cuenta que la tapa del tubo de nuevo se dejó abierta para los siguientes pasos.
20. Cuidadosamente con pipeta 30 ul agua libre de RNasa Directamente en el centro De la membrana de sílica. No toque la membrana de sílica con la punta de la pipeta (ver diagrama). Mira de cerca a medida que realice este paso. Use ambas manos para guiar a la pipeta. Asegúrese de que el agua se distribuye uniformemente en la membrana.
21. Incubar la columna de centrifugación a temperatura ambiente durante 1 minuto. Centrifugar a toda velocidad durante 30 segundos.
22. Transferir cuidadosamente la l 30, que se recupera en el tubo de 1.7 ml de nuevo en el centro de la membrana de sílica de la columna de giro que en el paso 22. Colocar la columna de nuevo en el mismo tubo de recogida de 1,7 ml y se incuba durante 1 minuto a temperatura ambiente. Centrifugar durante 1 minuto a máxima velocidad. Esta doble elución asegura que la máxima cantidad de ARN se recupera de la membrana.
23. Etiqueta dos nuevos 1,7 ml tubos de microcentrífuga con su información de identificación y la transferencia de toda la muestra de ARN se recuperó a uno de estos tubos.
24. Transferencia de 4 l de esta muestra para el otro tubo etiquetado. Esta muestra será transportado de regreso a la UVM para la cuantificación y evaluación de Nanodrop ARN cualitativa (Esto es para validar el análisis de ARN cuantitativo y cualitativo realizado en el lugar en el instituto participante).
25. Coloque todas las muestras en hielo.
RNA Cuantificación: Uso de la BioPhotometer Eppendorf, medir la absorbencia de la muestra de ARN en el espectrofotómetro a una dilución de 1 a 50 (+ 49μl 1μl muestra H ₂ O).
26. Evaluar la calidad del ARN utilizando el E-Gel (Invitrogen), 1,2% prefabricado en gel de agarosa para electroforesis.
ARN Análisis Cualitativo: La instalación del equipo de electroforesis E-gel. Pre-ejecutar el gel durante 2 minutos de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Después de la pre-ejecución, retire el peine del gel y añadir 14 l de agua a cada pocillo seguido de 1μl de cada muestra a cada pocillo. Mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo. Use una escalera de ADN de tamaño apropiado en un bien para la comparación de tamaño más adelante (Ladder BioLine fácil que el tamaño estándar o Novagen PCR marcador). Registro que muestra en cada carril. Dejar correr el gel durante 20 minutos.
27. Tome una foto del gel.

2. Síntesis de cDNA primera

1. Etiquetar un tubo de PCR 0,5 ml con su información de identificación. De la concentración de ARN determina a partir del experimento anterior, calcular el volumen de la muestra para obtener 3,0 ug. La transferencia de esta cantidad en el tubo. Agregar suficiente agua libre de RNasa para llevar el volumen a 11,0 ul.
2. Añadir 1,0 l oligo T7 (dT) ₂₄ Reactivo en el tubo. Asegúrese de prestar especial atención a la punta de la pipeta de volumen durante este paso para asegurarse de que todos los reactivos fue transferido. Vórtice del tubo y centrifugar a toda velocidad por 5 segundos. Colocar el tubo en un termociclador ajustado a 70 ° C durante 10 minutos.
3. Mientras que el 70 ° C de incubación está en curso, preparar la mezcla de hebra maestro por primera vez en un nuevo tubo. Asegúrese de añadir los siguientes reactivos EN ORDEN, Vortex y centrifugar a toda velocidad por 5 segundos y colocar el tubo en hielo.
   

SGbuffer	10 l
Lyticasesolution (10u/μl)	30 l

Utilice una micropipeta P2 para medir el volumen de 2 l, o menos.
28. Después de la incubación de 70 ° C en el paso 2 se ha completado, agregue 8 l de la mezcla de hebra primer maestro en el paso 3 en el tubo y se incuba en un termociclador a 42 ° C durante 60 minutos. Cuando la incubación primera síntesis de la hebra termine, coloque el tubo en hielo. Durante la incubación, preparar la mezcla de hebra segundo maestro.

3. Síntesis de cDNA segundo

1. Realice las siguientes segunda mezcla principal cadena en un nuevo tubo. Mantenga en hielo. Vortex y centrifugar todos los reactivos antes de usar. Añadir los reactivos en el orden indicado.
   

Primer capítulo mezcla maestra:
FirstStrandBuffer5X	4 l
0.1MDTT	2 l
10mMdNTP	1 l
SuperscriptII	1 l

Ecoli Ecoli DNA polimerasa I (10U/ul) Ecoli RNasa H (2U/ul)
29. Vortex del tubo y centrifugar durante 5 segundos a toda velocidad.
30. Cuando el 42 ° C de incubación se termina, la transferencia de todos los 130 l de la mezcla de hebra segundo maestro en el tubo de muestra que contiene el ARN y los reactivos primer capítulo. Vortex y centrifugar durante 5 segundos a temperatura ambiente. Incubar el tubo durante 2 horas a 16 ° C en un termociclador.
31. Al final de la incubación de 2 horas y mientras que la muestra sigue siendo a los 16 ° C, añadir los reactivos 2μl T4 ADN polimerasa para el tubo. Agitar brevemente y centrifugar el tubo y se incuba a 16 ° C durante no más de 5 minutos adicionales. Incubación más largo de 5 minutos puede reducir la calidad del cDNA debido a la actividad 5'exonuclease 3'to de la polimerasa T4.
32. Al final de la incubación de 5 minutos, añadir 10 l de EDTA 0,5 M para detener la reacción de la polimerasa de ADN T4. Guarde el tubo a -20 ° C.

4. Precipitar el cDNA

1. Centrífuga un bloqueo de la Fase tubo de gel a toda velocidad durante un minuto para asegurar que el gel está en el fondo del tubo. NO VORTEX TUBOS DE BLOQUEO DE FASE.
2. Añadir 162 l de la La capa inferior Desde el pH de 8,0 Tris buffer de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (PCI) para el contenido de la segunda cadena de ADNc tubo de reacción de síntesis y agitar durante 5 segundos para mezclar el contenido (el volumen total de la etapa de síntesis de cDNA a partir del experimento anterior es de 162 ul. El paso PCI requiere volúmenes iguales de las mezclas acuosas y orgánicas).
3. Transferir toda la mezcla cDNA-PCI en el tubo de gel de fase de bloqueo utilizando una micropipeta. NO VORTEX El bloqueo del tubo de gel de fase.
4. Se centrifuga a máxima velocidad durante 2 minutos.
5. Etiqueta de un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Use una micropipeta para transferir la capa superior del tubo de gel de fase de bloqueo en el tubo de 1,7 ml de nueva etiqueta. Trata de recoger la mayor cantidad de la capa como sea posible.
6. Añade lo siguiente al del tubo de 1.7 ml microcentrífuga y agitar.
   

Segundo capítulo mezcla maestra
El agua DEPC	91 ul
Buffer 5X segunda línea	30 ul
DNTPs (10 mM)	3 ul
1 ul
4 ul
1 ul

DNA ligase (10U/ul)
33. Colocar el tubo en la centrífuga con la bisagra del tubo hacia afuera y centrifugar a toda velocidad durante 20 minutos a temperatura ambiente.
34. Retire con cuidado el tubo de la centrífuga con cuidado de no perturbar el cDNA pellet. La pastilla debe ser de color rosa y aproximadamente del tamaño de un grano de sal y en el lado de la sonda debajo de la bisagra. Coloque sobre hielo e inmediatamente proceder al siguiente paso.

5. Limpieza del ADNc Pellet

1. Usando una micropipeta P1000, retire con cuidado todo el sobrenadante del tubo. Tenga cuidado de no perturbar el sedimento. Recuerde que el pellet es su ejemplo!
2. Añadir 500μl etanol frío al 80% (almacenado en -20 ^° Congelador C) en el tubo. Suavemente tapar el tubo e invertirlo lentamente varias veces. Observe a su bolita muy de cerca. Si la pastilla se desprende, se coloca el tubo de vuelta en la rejilla y deje que el sedimento se depositan en el fondo. Alternativamente, es posible que el tubo de centrífuga a toda velocidad durante 15 segundos para conseguir la pastilla de regreso a la parte inferior del tubo.
3. Usando una micropipeta P1000, retire con cuidado el etanol teniendo mucho cuidado de no perturbar el sedimento. Punta del tubo para permitir la extracción de tanto líquido como sea posible.
4. Repita los pasos 2 y 3 con una nueva parte alícuota de 80% de etanol.
5. Por último, eliminar todo el etanol es posible mediante una micropipeta P1000. Centrifugar el tubo a toda velocidad por 5 segundos y utilizando una micropipeta P20, retire la microlitros últimos de etanol. El objetivo es eliminar el etanol tanto como sea posible sin perturbar el precipitado.
6. Coloque el tubo abierto en un estante o una caja de secado durante 10-20 minutos para evaporar el etanol restante. El precipitado seco se pierde con facilidad una vez que esté seco. Ten cuidado al manejar el tubo suavemente. Cuando termine, cierre la tapa. Visualizar el precipitado seco para confirmar que está presente en el tubo.
7. Resuspender el precipitado en 22 l de agua libre de RNasa y coloque el tubo en hielo.

6. InVitroTranscription (IVT)

1. El ENZO BioArray kit contiene todos los reactivos necesarios para preparar cRNA biotina marcada a partir de cDNA.
   A mixfor maestro de toda la clase se preparó como instructor follows.The preparará esta mezcla o designar a alguien de la clase. Esto debe hacerse en un área libre de RNasa.
   

El etanol (100%)	405 ul
NH 4 OAc	80 ul
Pellet Pintura	1 ul

2 [Biotinnucleotides 10 veces] 3 [TDT 10x] 5 [20 veces la RNA polimerasa T7] NOTA:
35. Etiquetar un tubo de 0,5 ml PCR. Combine los siguientes en el tubo y la pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar. Girar en una centrífuga a toda velocidad por 5 segundos para obtener todos los reactivos a la parte inferior del tubo.
    

	Amt / muestra	# Ejemplos	Total
Reactivo 1 [tampón de reacción 10x]	4μl
4μl
4μl
Reactivo 4 [inhibidor de RNasa 10 veces]	4μl
2μl
Volumen Total	18 l

Prepare la mezcla de maestro suficiente para el número de muestras más uno. Esto asegurará que suficiente para fines de pipeteo.
36. Incubar el tubo a 37 ° C for16 horas en el termociclador. Cuando la reacción es completa, almacenar las muestras a -20 ° C

7. Limpieza de la biotina cRNA

1. Transferir la muestra cRNA todo a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Añadir 60 l de RNasa libre de agua y 350 l de amortiguación RLT y agitar durante 5 segundos.
2. Añadir 250 l de etanol 100% y agitar de nuevo.
3. Etiqueta de una columna RNeasy spin y la transferencia de la muestra cRNA todo a la columna. Tenga cuidado de no tocar la punta de la pipeta a la membrana de sílica. Cierre la tapa y centrifugar durante 15 segundos a máxima velocidad.
4. Eliminar la columna de giro del tubo de recolección. Pipeta el paso a través del líquido (líquido en el tubo de recogida) de nuevo en la columna de centrifugación y centrifugar de nuevo durante 15 segundos.
5. Colocar la columna de giro en un nuevo tubo de recolección de 2 ml y pipeta de 500 l de buffer RPE en la columna de giro. Cerrar el tubo y centrifugar durante 15 segundos a máxima velocidad. Deseche el tubo de recogida y pasar a través de líquido. Colocar la columna de giro en un nuevo tubo de recogida de 2 ml.
6. Añadir otro buffer RPE 500 l en la columna de giro.
7. Transferencia de la columna de centrifugación en un tubo de la nueva colección y llevar a cabo una columna de "secado" giro a toda velocidad por 2 minutos.
8. Etiqueta de un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 ml con su información de identificación. La transferencia de la columna de giro de este tubo.
30 l RNasa libre de agua sobre la membrana del centro de sílice RNeasy e incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto. Cerrar el tubo y centrifugar durante 1 minuto a máxima velocidad.
9. Transferir cuidadosamente la l 30, que se recupera en el tubo de 1.7 ml de nuevo en el centro de la membrana de sílica de la columna RNeasy mismo giro. Colocar la columna de nuevo en el mismo tubo de recogida de 1,7 ml y se incuba durante 1 minuto a temperatura ambiente. Centrifugar durante 1 minuto a máxima velocidad. Esta doble elución asegura que la máxima cantidad de cRNA se recupera de la membrana.
10. Transferencia de la limpieza marcado con biotina cRNA a un nuevo tubo de centrífuga de 1.7 ml y la etiqueta apropiada.
11. Determinar la concentración cRNA utilizando el mismo procedimiento como se describe anteriormente en el procedimiento de aislamiento de ARN. Se registrará la concentración y la proporción de 260/280.

8. La fragmentación de la cRNA para la preparación de destino

1. Etiquetar un tubo de PCR 0,5 ml con su información de identificación. La transferencia de 5 ug de la cantidad equivalente de cRNA en el tubo. Agregar suficiente agua libre de RNasa para obtener un volumen total de 16,0 ul, y luego añadir 4,0 l de tampón 5X fragmentación del tubo. El volumen total en el tubo debe ser de 20,0 ul.
2. Vortex y centrifugar el tubo durante 10 segundos. Incubar el tubo a 94 ° C durante 30 minutos en un termociclador. Poner en hielo después de la incubación.

9. La evaluación de la cRNA fragmentado y no fragmentado utilizando un gel de agarosa

1. La instalación del equipo de electroforesis E-gel usando un 1,2% prefabricado en gel de agarosa. Pre-ejecutar el gel durante 2 minutos, de acuerdo a la recomendación del fabricante
2. Añadir 14 l de agua para cada pozo de la E-gel.
3. Añadir 2μl de cada muestra a cada pocillo y pipeta de arriba y abajo para mezclar bien. Analizar tanto el cRNA fragmentado y no fragmentado de cada muestra. Lo mejor es cargar las muestras (fragmentados y no fragmentados) en los carriles vecinos. Registro de la identidad de cada muestra en cada carril.
4. Añadir 4 l de una escalera de ADN (Ladder BioLine fácil que el tamaño estándar o Novagen PCR marcador) a un carril del gel
5. Ejecutar el gel durante 20 minutos.
6. Visualiza el E-gel en un transiluminador. Tome una fotografía del gel.

10. Hibridación con la levadura 2,0 GeneChip

Resultados de la Representante:

Figura 1. Un escaneado Affymetrix GeneChip levadura de la imagen (Affymetrix GeneChip Software Operativo (SMOC))

Figura 2. Gráfico de dispersión en 2D de todas las transcripciones genéticas (~ 6.700 genes), la comparación de un control y los datos tratados por levaduras. Cada punto representa un solo gen. Genes de color de púrpura indican los genes que son expresados ​​diferencialmente mientras que los genes de color rojo no lo son. Las descripciones de los genes expresados ​​diferencialmente se etiquetan en la leyenda correspondiente y la mayoría están involucrados en el control del ciclo celular en este ejemplo. (Affymetrix GeneChip operativos Software (SMOC))

Figura 3. Este diagrama ilustra genes expresados ​​diferencialmente en una vía biológica afectada. Los genes indicados con una estrella roja indican los genes el regulado en la vía de la meiosis. (La base de datos de anotación, y Visualización Integrada Discovery (DAVID)

Figura 4. Resultados de la Representante de un gráfico de Volcán. Las muestras de control y fueron tratados en comparación con un p-valor de corte de 0,05 y un cambio de 1,5 veces la expresión cortado. Esta parcela se ha generado utilizando software Geospiza Genesifter donado amablemente a los estudiantes con fines educativos.

Mezcla de cDNA	22μl
Enzomastermix [fromabove]	18μl
TotalVolume	40μl

Discusión

Aplicaciones e importancia.

La Red Vermont Genética programa de extensión, de la Universidad de Vermont, realiza cursos de extensión a ocho colegios asociados de bachillerato en todo el estado. El objetivo de la VGN Extensión central es exponer a los estudiantes en el estado de Vermont a la tecnología de estado de la técnica científica y los recursos con experiencias prácticas. El módulo de microarrays descrito fue desarrollado en 2003 y mejorado posteriormente. Se ha ofrecido como un mini-curso o integrado en el currículo de los laboratorios existentes en las instituciones participantes.

Este proyecto, entre los núcleos de investigación universitarios y colegios universitarios, promueve la colaboración en la educación y la investigación. Microarrays de difusión en todo el estado ha mejorado plan de estudios y crear oportunidades de investigación y redes de instalaciones básicas, profesores y estudiantes.

Como profesores universitarios adoptar el programa se les anima a diseñar experimentos única siempre y cuando sean apropiados GeneChips Affymetrix y anotaciones disponibles. Toda la información para este módulo incluyendo el manual de laboratorio, referencias y presentaciones en PowerPoint están disponibles en línea (Vermont Genética Network, 2008).

Los pasos críticos:

Spheroplasting: Es importante observar spheroplasting éxito bajo el microscopio. El uso de SDS es muy beneficioso, ya que causa la inflamación que resulta en la levadura esferoides. Es importante observar que las células en ciernes forma esferoides también. Si spheroplasting parcial se observa un tratamiento prolongado con liticasa se recomienda.

Pellet de limpieza: Durante la reacción de precipitación y el paso posterior de lavado de etanol, es muy fácil perder el cDNA pellet. Extremo cuidado y una atención meticulosa a la pastilla es imprescindible.

La aplicación del agua en el centro de la membrana: Durante la etapa de elución de ARN de la membrana, es importante "squirt" el l 30 de agua directamente al centro de la membrana de sílica. Si esto no se logra, la columna puede ser centrifugada y el eluyente resultante puede ser re-aplicado a la membrana de sílica de nuevo. Esto se puede repetir tantas veces como sea necesario.

Modificaciones y sustituciones del producto:

1. Alternativa ARN de limpieza de las columnas puede ser sustituido. Ejemplos de ello son los USB de preparación-la facilidad y la Invitrogen puro Enlace ARN kit, y el Omega ARN kit de limpieza para nombrar unos pocos.
2. Schizosaccharomyces pombe es una levadura opcional. El Affymetrix GeneChip contiene dos genomas en el mismo chip
3. Diversos tratamientos y los tiempos pueden ser utilizados. Esto puede incluir tratamientos de drogas, tratamientos térmicos, antioxidantes, etc veces El tratamiento también puede ser ajustado.
4. DNasa tratamiento puede no ser necesaria debido a los métodos descritos emplear el uso de un oligo (dT) primer.
5. No es necesario realizar una doble elución del RNA de la columna con la misma alícuota de 30 microlitros. Una vez que casi siempre es adecuada. Esto es sugerido para asegurarse de que una recuperación completa se obtiene. Además, el agua utilizada para eluir el RNA de la columna puede ser pre-calentado a 65 ° C para mejorar aún más la capacidad de recuperar el ARN de la columna de sílice.
Muchas están disponibles para cuantificar el ARN. El Eppendorf y Nanodrop sólo han sido seleccionados por su facilidad de uso y prueba de precisión.
6. Electroforesis en gel de agarosa muchas llevarse a cabo utilizando un equipo estándar de laboratorio. El E-Gel no es necesaria, pero es deseable, ya que es RNasa libre y no requiere tiempo de solidificación de gel de espera.
7. Información de pedido para los productos ha sido enviada. Sin embargo, muchos reactivos en general se pueden pedir de múltiples proveedores.
8. Uno de los reactivos del ciclo de cDNA se pueden comprar por separado si es más rentable.
9. Hay otros métodos de preparación objetivo, pero creemos que ésta ofrece más oportunidades de enseñanza para el estudiante.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spetrophotometer
Termociclador
Microcentrífuga
Vortex
Agitar las placas (2)
P-10 pipetas
P-200 de pipetas:
Cámara y transiluminador
E-Gel aparato Invitrogen G6000-08
E-Gel Invitrogen G6018-02
Axygen 1,7 ml. Claro Krackler 383-MCT175C
Axygen tubos de 0,5 ml claro Krackler 383-MCT060C
Axygen tubos de 2 ml de captura Krackler 383-MCT200NC
Cajas de consejos ART P-10: CLP BT10XL
Cajas de P-100 consejos ART: CLP BT200
Cajas de P-20 Consejos ART: CLP BT20
Cajas de ART Consejos P-1000: CLP BT1000
Chips de levadura
25 ml desechables pipetas estériles
5 ml pipetas desechables estériles
Microfuge bastidores de tubo
Kimwipes:
Batas de laboratorio
Agregue Bares
Frascos de cultivo
Lazos de inoculación de
Sharples
Guantes
Cinta de autoclave
Agitador bares
30% de peróxido de hidrógeno EMD Millipore 386790
HBSS sin Ca, Mg, o el tinte Sigma-Aldrich H6648-100ml
Qiagen RNeasy Mini Kit: Qiagen 74104
Qiagen DNasa del kit: Qiagen 79254
Rnase Remover Denville Científico D1180
Harleco Alcohol 100% EMD Millipore 65347
ENZO IVT Kit ENZO ENZ-42655-10
Liticasa: una botella VWR IC19012310
El agua, el grado de Cultivos Celulares EMD Millipore 4,86505
Cultivo de levadura: ATCC 18824
YPD caldo en polvo EMD Millipore 4,8504
D (+) glucosa, anhidra EMD Millipore 346351
Sorbitol EMD Millipore 56755
EDTA EMD Millipore 4005
SDS solución, el 20% EMD Millipore 7990-OP
Pellet Pintura EMD Millipore 69049
PCI RNasa libre de DNasa (7 alícuotas): Fisher AC32711-500
7,5 millones de NH4OAc Fisher ICN1987 5980
La fragmentación del buffer (200 mM Tris-acetato, pH 8,1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA)
Base Trizma Fiaher 50-899-90034
KOAc Fisher NC9757725
MgOA Fisher NC9681042
Colorante de carga Invitrogen 10482055
Marcadores PCR EMD Millipore 69278-3
Sincronización de geles Fisher FP2302820
Un ciclo de cDNA Kit Invitrogen A10752-030
Incluye;
E. coli ADN Pol
DNTP
Pol ADN T4.
T-7 oligod (T)
0,5 ml de EDTA pH 8,0
Buffer primer capítulo
E. Coli RNaseH
Buffer segunda línea
E. Coli ADN ligasa
Superíndice II
TDT