Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

Özet

Bu protokol, maya gen ekspresyonu ( Saccharomyces cerevisiae) Değiştirildi hidrojen peroksit (H eklenmesi ile indüklenen oksidatif strese maruz kaldıktan sonra ₂ O ₂), Oksitleyici ajan.

Özet

Hidrojen peroksit (H ₂ O _2), ek bir oksitleyici ajan tarafından indüklenen oksidatif strese maruz kaldıktan sonra bu protokol, maya (Saccharomyces cerevisiae) gen ekspresyonu değiştirildi. Deneyde, maya, 3X glikoz içeren 1/2X YPD suyu 48 saat boyunca yetiştirilir. Kültür, bir kontrol ve tedavi edilen grup bölünür. 1 saat süreyle deney kültür 0.5 mM Hanks de H ₂ O ₂ ile tedavi edilir (HBSS) Tuzlu Tamponlu. Kontrol kültürü sadece HBSS ile tedavi edilir. Total RNA, her iki kültürde elde edilir ve çok adımlı bir süreç boyunca bir biotin etiketli Crna ürün dönüştürülür. Nihai sentez ürünü UVM Mikroarray Core Tesis için geri alınır ve Affymetrix maya GeneChips melezleşmiştir. Sonuçta elde edilen gen ekspresyon verileri biyoinformatik veri analiz yazılımı yüklenir.

Protokol

1. Elde edilen toplam RNA Yalıtımlı Saccharomyces cerevisiae Enzimatik Lizis

1. RNaz ZAP (Ambion) kullanarak bir RNaz çalışma bölgesi hazırlayın.
2. 10 U / ul son bir çalışma çözeltisi yapmak için doğrudan lyticase flakon RNaz içermeyen su 1 ml ekleyerek taze çalışma lyticase reaktif hazırlayın. Vortex ve tam karıştırma sigortalamak için birkaç kez ters. Bu 10 adet / ml solüsyon 12 saat boyunca stabildir.
3. Taze DNaz I çözümü buz üzerinde Qiagen DNaz kiti ve mağaza kullanarak hazırlayın.
4. Etiket 1.7 ml mikrosantrifüj tüp kimlik bilgileri ile. Tüpe 1,5 ml uygun maya kültürü aktarın.
5. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 5000 xg (yaklaşık 3 / 4 tam hız) tüp santrifüjleyin. Dikkatlice (rahatsız pelet olmadan) bir mikropipet kullanarak supernatant kaldırmak ve süpernatantı atın.**** 4. adımı yineleyin .****
6. Pelet, vorteks, 2 dakika için 5000 xg'de santrifüj 1000 ul DEPC su ekleyin. Süpernatantı atın. Maya pelet mümkün olduğunca sıvı kadar çıkarın.
7. Maya pelet ve vorteks karıştırmak için aşağıdaki ekleyin.
   
8. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
9. Girdap tüp spheroplasts oluşturmak için her 10 dakikada bir nazikçe. Spheroplasts hafifçe ele alınması gerekir. Maya tam spheroplasting gözlemlemek için mikroskop altında inceleyin. Mikroskop lamı üzerine maya incelerken, mükemmel bir küre (tomurcuklanma hücreler için bile) şişer ve form maya neden SDS küçük bir miktar% 0.1 ekleyin. Bu hücre duvarlarının sindirilir olduğunu gösterir.
10. Tüp ve vorteks 350 ul b-RLT tampon ekle Kuvvetlice 1 dakika. Vorteks ederken, tüpü sıkıca kapağı tutarak kapatılmış olduğundan emin olun kapalı. Bu prosedür spheroplasts lyse.
11. Tüp ve kısaca vorteks 250 ul% 100 etanol ekleyin. Etanol ilave edildikten sonra bir çökelti oluşabilir, ancak bu RNA koleksiyon etkilemez.
RNA toplanıyor: Etiket kimlik RNeasy spin kolon mikropipet kullanarak spin kolon için 10 adımı çözüm tüm bilgiler dışında dikkatli bir şekilde aktarmak. Silika membran pipetlemeyin ucu ile dokunmak için dikkatli olun. Tüp kapatılır ve 15 saniye boyunca tam hızda santrifüj. Örnek RNA spin kolon silika membran uyacaktır.
12. Spin kolon toplama tüpünden çıkarın. Pipetleyin geçmek sıvı yoluyla (toplama tüp içinde sıvı) spin sütun üzerine ve tekrar santrifüj. Toplama tüpüne atın (aracılığıyla sıvı akışı ile) ve 2 ml yeni bir toplama tüpüne spin kolon yerleştirmek.
13. Spin kolon 350 ul RW1 tampon ekleyin. Bu çözüm, RNA yıkayın ve tuzları ve çözünmüş hücresel enkaz kaldırmak için kullanılır. Tüp kapatılır ve 15 saniye boyunca tam hızda santrifüj.
DNA sindirerek: Santrifüj spin sütun çıkarın tüp kapağı açın ve spin kolon zarının ortasında 80 ul DNaz I çözüm ekleyin. Bu adım, örnek bir gDNA sindirir. Sütun kapağını kapatın ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
14. Spin kolon 2 ml yeni bir toplama tüpüne aktarın.
Temizleme ve yıkama RNA: Spin kolon 350 ul RW1 tampon ekleyin ve 15 saniye boyunca tam hızda santrifüj.
15. Toplama tüpüne atın ve spin kolon yeni bir 2 ml toplama tüpünün içine yerleştirin.
16. Silika membran RNA yıkamak için spin kolon 500 ul RPE tampon ekleyin. Tam hızda 15 saniye santrifüj tüpü ve kapatın.
17. Toplama tüpüne atın ve spin kolon yeni bir 2 ml toplama tüpünün içine yerleştirin.
18. Silika membran spin kolon, 500 ul RPE tampon ekleyerek tekrar yıkayın. Tüp kapatılır ve 15 saniye boyunca tam hızda santrifüj.
19. Herhangi bir kalıntı sıvı silika zarı kaldırılır sağlamak için 2 ml, 1 dakika boyunca tam hızda bir mikrosantrifüj yeni bir toplama tüpüne ve santrifüj spin kolon yerleştirin.
RNA Kurtarma: Örnek bilgi etiketli yeni bir 1.7 ml mikrosantrifüj tüp RNeasy spin kolon aktarın. Yeni tüp kap önümüzdeki birkaç adım için açık bırakılması olacağını unutmayın.
20. Dikkatlice pipetlemeyin 30 ul RNaz ücretsiz su Doğrudan merkezi üzerine Silika membran. (Bkz. diyagram) pipetlemeyin ucu ile silika membran dokunmayın.. Bu adımı gerçekleştirmek yakından bakın. Pipetlemeyin rehberlik etmek için iki elinizi birden kullanın. Su membran eşit dağıtılmış olduğundan emin olun.
21. Spin kolon 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 30 saniye süreyle tam hızda santrifüjleyin.
22. , Dikkatli bir şekilde, yukarıda adım 22 aynı spin kolon silika membran merkezi sırtına 1.7 ml tüp kurtarılan 30 ul aktarın. Sütun aynı 1.7 ml toplama tüpüne geri koyun ve 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. 1 dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin. Bu çift elüsyon maksimum miktarda RNA membran kurtarıldı olduğunu sigortalanır.
23. Etiket iki yeni 1.7 ml mikrosantrifüj kimlik bilgileri ile tüpler ve bu tüplerin biri kurtarılan RNA örnek aktarmak.
24. Bu örnek diğer etiketli tüpe 4 ul aktarın. Bu örnek için UVM Nanodrop kantifikasyon ve RNA kalitatif değerlendirme (Bu enstitü katılan sitesinde yapılan RNA nicel ve nitel analiz doğrulamak için) geri taşınır.
25. Tüm örnekleri buz koyun.
RNA Niceleme: Eppendorf Biophotometer kullanarak, 1 ile 50 seyreltme spektrofotometre RNA numunenin absorbans ölçümü (1μl örnek + 49μl H ₂ O).
26. E-Gel (Invitrogen)% 1.2 prekast agaroz jel elektroforezi için kullanarak RNA kalitesini değerlendirin.
RNA Kalitatif Analiz: E-jel elektroforezi aparatı ayarlayın. Üreticinin prosedüre göre 2 dakika boyunca jel Ön çalıştırın. Ön çalıştırdıktan sonra, jel tarak kaldırmak ve her kuyuya, her numune 1μl takip her biri 14 ul su ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme iyi karıştırın. Iyi bir boyutu daha sonra karşılaştırma (BioLine Kolay Merdiven standart veya Novagen PCR işaretleyici boyutu) için uygun bir boyut DNA Ladder kullanın. Her kulvarda hangi örnek kaydedin. 20 dakika boyunca jel çalıştırın.
27. Jel bir fotoğraf çekin.

2. İlk Strand cDNA Sentezi

1. 0,5 ml PCR tüpü kimlik bilgileri ile etiketleyin. Yukarıdaki deneyi belirlenen RNA konsantrasyonu, 3.0 ug elde etmek için numune hacmi hesaplayabilir. Bu miktarın tüpüne aktarın. 11.0 ul için ses getirmek için yeterli RNaz içermeyen su ekleyin.
2. 1.0 ul T7 oligo (dT) ₂₄ Tüp reaktif. Pipetlemeyin ucu hacmi tüm reaktif transfer olduğundan emin olmak için bu adımı sırasında özellikle dikkat etmeniz emin olun. Vorteks tüp ve 5 saniye süreyle tam hızda santrifüj. ° C'de 10 dakika için 70 olarak belirlenmiştir PCR tüp yerleştirin.
, yeni bir tüp içinde ilk iplikçik ana karışımı hazırlar. Aşağıdaki reaktifler eklemek için emin olun AMACIYLA, 5, ikinci ve buz üzerinde tüp tam hızda vorteks ve santrifüj.


SGbuffer	10 ul
Lyticasesolution (10u/μl)	30 ul

P2 mikropipet ul 2 veya daha az hacimleri ölçmek için kullanın.
28. 70 olduktan sonra 2. adımda ° C de inkübasyon tamamlandığında, 42 ° C'de 60 dakika için, bir termalcycler tüp ve inkübe 8 ul 3. adımda yapılan ilk iplikçik ana karışımı ekleyin. Ilk iplikçik sentez inkübasyon bittiğinde, buz tüpü yerleştirin. Bu kuluçka sırasında, ikinci iplikçik ana karışımı hazırlar.

3. İkinci Strand cDNA Sentezi

1. Yeni bir tüp içinde aşağıdaki ikinci iplikçik ana karışımı olun. Buz üzerinde tutun. Vortex ve kullanmadan önce tüm reaktifler santrifüj. Listelenen sırada reaktifler ekleyin.
   

İlk iplikçik ana karışımı:
FirstStrandBuffer5X	4 ul
0.1MDTT	2 ul
10mMdNTP	1 ul
SuperscriptII	1 ul

Ecoli Ecoli DNA Polimeraz I (10U/ul) Ecoli RNaz H (2U/ul)
29. Vortex az 5 saniye süreyle tam hızda santrifüj tüpü ve.
30. 42 ° C de inkübasyon bittiğinde, RNA ve ilk iplikçik reaktifleri içeren numune tüpü ikinci iplikçik ana karışımı 130 ul aktarmak. Vorteksleyin ve oda sıcaklığında 5 saniye süreyle santrifüj. Tüp, 16 ° C'de bir termalcycler 2 saat inkübe edin.
31. 2 saat inkübasyon sonunda ve örnek hala 16 yaşında iken ° C, tüp 2μl T4 DNA polimeraz reaktif ekleyin. Kısaca vorteks ve en fazla 5 ek dakika tüp ve 16 ° C'de inkübe santrifüj. 5 dakikadan uzun süre sonra kuluçka T4 polimeraz 3'to 5'exonuclease faaliyeti nedeniyle cDNA kalitesini azaltabilir.
32. 5 dakika inkübasyon sonunda, T4 DNA polimeraz reaksiyonu durdurmak için 10 ul 0.5 M EDTA ekleyin. -20 ° C'de tüp Mağaza

4. CDNA çökeltisi

1. Jel tüpün dibinde sigortalamak için bir dakika için tam hızda bir Phase Lock Gel tüp santrifüjleyin. VORTEX FAZ KİLİT BORULAR ETMEYİN.
2. 162 ul ekle Alt katman PH 8.0-Tris içeriği (Yukarıdaki deneyi cDNA sentezi adım toplam hacmi karıştırmak için 5 saniye süreyle ikinci iplikçik cDNA sentezi reaksiyon tüpü ve vorteks içeriğine Fenol / Kloroform / izoamil Alkol (PCI) tamponlu 162 ul. PCI adım) eşit miktarda sulu ve organik karışımları gerektirir.
3. CDNA-PCI karışımı bir mikropipet kullanarak faz kilit jel tüpüne aktarın. VORTEX ETMEYİN Faz kilidi jel tüpü.
4. 2 dakika boyunca tam hız santrifüjleyin.
5. Yeni bir 1.7 ml mikrosantrifüj tüp etiketleyin. Faz kilidi jel tüpten yeni etiketli 1.7 ml tüp üst tabakası aktarmak için bir mikropipet kullanın. Katmanı mümkün olduğu kadar toplamaya çalışın.
6. 1.7 ml mikrosantrifüj tüp ve vorteks için aşağıdaki ekleyin.
   

İkinci iplikçik master miks
DEPC Su	91 ul
5X İkinci Strand Tampon	30 ul
DNTP (10mM)	3 ul
1 ul
4 ul
1 ul

DNA ligaz (10U/ul)
33. , Dışarı bakacak şekilde tüp menteşe ile santrifüj tüp yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika tam hızda santrifüj.
34. CDNA pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak santrifüj tüpü yavaşça çıkarın. Pelet pembe ve bir tuz tanesinden ve menteşe altında tüp tarafında yaklaşık boyutu. Buz koyun ve hemen sonraki adıma geçin.

5. CDNA Pelet Temizleme

1. P1000 mikropipet tüp dikkatli bir şekilde kullanarak, tüm süpernatantı kaldırmak. Pelet rahatsız etmemek için dikkatli olun. Pelet örnek olduğunu unutmayın!
2. 500μl soğuk% 80 etanol (-20 saklanan Ekle ^· C tüp dondurucu). Yavaşça tüpün kapağı ve yavaş yavaş birkaç kez ters. Çok yakından pelet izleyin. Pelet müstakil hale gelirse, raf tüp yeri ve pelet dibe yerleşmek izin. Alternatif olarak, pelet aşağı tüpün dibine geri almak için 15 saniye süreyle tam hızda tüp santrifüj olabilir.
3. P1000 mikropipet kullanarak etanol pelet rahatsız etmemek için çok dikkatli olmak, dikkatlice çıkarın. Mümkün olduğu kadar çok sıvı çıkarılmasını sağlamak için tüp ucu.
4. % 80 etanol yeni bir kısım ile 2. ve 3. adımları tekrarlayın.
5. Son olarak, P1000 mikropipet kullanarak etanol tümünü çıkarın. 5 saniye süreyle tam hızda tüp santrifüj ve P20 mikropipet kullanarak, etanol, son birkaç mikrolitre çıkarın. Hedefi pelet rahatsız olmadan, mümkün olduğu kadar etanol gibi çıkarın.
6. Kalan etanol buharlaşması için 10-20 dakika bir raf ya da kuruma kutusu açık tüp yerleştirin. Kuru bir kez kuru pelet kolaylıkla kaybolur. Becareful yavaşça tüp ele. Bittiğinde, kapağı kapatın. Tüp onaylamak için kuru pelet gözünüzde canlandırın.
7. 22 ul RNaz ücretsiz su ve buz üzerinde tüp pelletini tekrar.

6. InVitroTranscription (IVT)

1. ENZO bioarray kiti cDNA biotin etiketli Crna hazırlamak için gerekli tüm reaktifleri içerir.
   Tüm sınıf follows.The eğitmen olarak hazırlanacak ana mixfor Bu karışımı hazırlamak veya sınıf birini tayin edecektir. Bu RNaz boş alan yapılmalıdır.
   

Etanol (% 100)	405 ul
NH 4 Oac	80 ul
Pelet Boya	1 ul

Reaktif 1] Not:
35. 0,5 ml PCR tüpü etiketleyin. Tüp ve pipetlemeyin kadar aşağıdaki birleştirin ve aşağı birkaç kez karıştırın. Tüm reaktifler tüp altına almak için 5 saniye süreyle tam hızda santrifüj Spin.
    

	Amt / numune	# Örnekleri	Toplam
4μl
Reaktif 2 [10x Biotinnucleotides]	4μl
Reaktif 3 [10x DTT]	4μl
Reaktif 4 [10x RNaz İnhibitörü]	4μl
Reaktif 5 [20x T7 RNA polimeraz]	2μl
Toplam Hacim	18 ul

Için yeterli sayıda örnekleri artı bir ana karışımı hazırlayın. Bu pipetleme amaçlar için yeterli sigorta olacaktır.
36. Tüp termalcycler 37 ° C for16 saat inkübe edin. Reaksiyon tamamlandığında, -20 ° C'de örnek saklamak

7. Biotinlenmiş Crna Temizleme

1. Yeni bir 1.7 ml mikrosantrifüj tüp tüm Crna örnek aktarın. 60 ul RNaz ücretsiz su ve 5 saniye için 350 ul RLT tampon ve vorteks ekleyin.
2. 250 ul% 100 etanol ve vorteks tekrar ekleyin.
3. RNeasy bir spin kolon Etiket ve sütun tüm Crna örnek aktarmak. Silika membran pipetlemeyin ucu dokunmak için dikkatli olun. Kapak ve tam hızda 15 saniye santrifüj kapatın.
4. Spin kolon toplama tüpünden çıkarın. Pipetleyin geçmek sıvı yoluyla (toplama tüp içinde sıvı) spin kolon üzerine ve 15 saniye boyunca tekrar santrifüj.
5. Spin kolon üzerine yeni bir 2 ml toplama tüpü ve RPE tampon pipetlemeyin 500 ul spin kolon içine yerleştirin. Tüp kapatılır ve 15 saniye boyunca tam hızda santrifüj. Sıvı yoluyla toplama tüpü ve pas atın. Spin kolon yeni bir 2 ml toplama tüpünün içine yerleştirin.
6. Spin kolon, 500 ul RPE tampon ekleyin.
7. Spin kolon yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 2 dakika boyunca tam hızda bir sütun "kuruma" spin gerçekleştirmek.
8. Kimlik bilgileri ile yeni bir 1.7 ml mikrosantrifüj tüp etiketleyin. Bu tüp spin kolon aktarın.
9. 1 dakika boyunca oda sıcaklığında merkezi RNeasy silika membran ve inkübe üzerine pipetleyin 30 ul RNaz içermeyen su. Tam hızda 1 dakika boyunca santrifüj tüpü ve kapatın.
10. 30 ul merkezi aynı spin kolon RNeasy silika zarının arkasında 1.7 ml tüp ele dikkatlice aktarın. Sütun aynı 1.7 ml toplama tüpüne geri koyun ve 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. 1 dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin. Bu çift elüsyon maksimum miktarda Crna membran kurtarıldı olduğunu sigortalanır.
11. Uygun yeni bir 1.7 ml santrifüj tüp ve etiket bu temiz biotin etiketli Crna aktarın.
12. RNA izolasyon prosedürü sırasında yukarıda belirtildiği gibi aynı prosedürü kullanarak Crna konsantrasyonu belirler. Konsantrasyon ve 260/280 oranı kaydedin.

8. Hedef Hazırlama Crna parçalamadan

1. 0,5 ml PCR tüpü kimlik bilgileri ile etiketleyin. Tüpüne eşdeğer miktarda Crna 5 ug aktarın. Toplam hacmi 16.0 ul getirmek ve daha sonra tüp 5X parçalanma tampon 4.0 ul eklemek için yeterli RNaz içermeyen su ekleyin. Tüp içinde toplam hacmi 20.0 ul olmalıdır.

9. Agaroz Jel kullanarak, parçalanmış ve parçalanmamış Crna Değerlendirilmesi

1. % 1.2 prekast agaroz jel kullanarak E-jel elektroforezi aparatı ayarlayın. Üreticinin tavsiyesine göre, 2 dakika için jel Ön çalıştırmak
2. E-jel, her bir kuyunun 14 ul su ekleyin.
3. , Her iyi ve pipetlemeyin her numune 2μl ekleyin ve iyice karıştırın. Her numunenin parçalanmış ve parçalanmamış Crna analiz edin. Komşu şerit örnekleri (parçalanmış ve parçalanmamış) yüklemek için en iyisidir. Her kulvarda her numunenin kimliğini kaydedin.
4. Jel tek şeritli DNA merdiveni (standart ya da Novagen PCR işaretleyici boyutu BioLine Kolay Merdiven) 4 ul ekle
5. 20 dakika için jel çalıştırın.
6. Bir transilluminator'de E-jel gözünüzde canlandırın. Jel fotoğraf çekin.

10. Maya 2.0 GeneChip için Hibridizasyon

Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1. Taranan Affymetrix Maya GeneChip Resim (Affymetrix GeneChip İşletim Yazılımı (GCOS))

Şekil 2. 2D scatter plot. Her nokta, tek bir geni temsil eder. Mor renkli Genler, kırmızı renkli genleri ise farklı ifade edilir genleri göstermektedir. Farklı genlerin Açıklamaları ilgili efsane etiketli ve çoğu bu örnekte hücre döngüsü kontrolü dahil. (Affymetrix GeneChip İşletim Yazılımı (GCOS))

Şekil 3. Bu akış şeması etkilenen bir biyolojik pathway farklı genlerin göstermektedir. Kırmızı bir yıldız ile gösterilen genlerin mayotik yol aşağı düzenlenmiş genlerin göstermektedir. (Not, Görselleştirme ve Entegre Discovery (DAVID Veritabanı)

Şekil 4. Volkan Arsa Temsilcisi Sonuçları. Kontrol ve tedavi örnekleri .05 kesilmiş ve 1.5 kat ifade değişikliği kesilmiş bir p-değeri ile karşılaştırıldı. Bu komplo nazik öğrencilere eğitim amaçlı bağışlanan Geospiza Genesifter yazılımı kullanılarak oluşturulmuştur.

CDNA karışımı	22μl
Enzomastermix [fromabove]	18μl
TotalVolume	40μl

Tartışmalar

Uygulamalar ve önemi.

Vermont Genetik Ağ tanıtım programı, Vermont Üniversitesi, eyalet çapında sekiz ortak lisans kolej lisans sosyal yürütmektedir. VGN Sosyal Yardım Core hedefi Vermont eyaletinde ellerini kullanarak deneyimleri-state-of-the-art bilimsel teknoloji ve kaynakları lisans maruz. 2003 yılında açıklanan mikroarray modülü geliştirdi ve daha sonra yükseltildi. Mini bir ders olarak sunulan veya katılan kurumlarda mevcut laboratuvar müfredat içine entegre edilmiştir.

Bu proje, araştırma, üniversite çekirdek ve yüksek lisans kolej arasında, eğitim ve araştırma işbirliklerini teşvik etmektedir. Mikroarray yardım boyunca devlet müfredat geliştirilmiş ve çekirdek tesisleri, öğretim üyeleri ve öğrenciler için araştırma ve ağ fırsatları yarattı.

Lisans öğretim programı benimsemek gibi uygun Affymetrix GeneChips ve ek açıklama vardır sağlanan eşsiz deneyler tasarlamak için teşvik edilir. Laboratuvar kılavuzu, referanslar ve PowerPoint sunumları da dahil olmak üzere bu modül için tüm bilgiler online (Vermont Genetik Network, 2008).

Kritik adımları izleyin:

Spheroplasting: Mikroskop altında başarılı spheroplasting gözlemlemek önemlidir. Parçacıklarının sonuçlanan maya şişmesine neden olur SDS kullanımı son derece faydalıdır. Tomurcuklanan hücreleri de parçacıklarının formu gözlemlemek önemlidir. Kısmi spheroplasting görülürse lyticase ile uzun bir tedavi tavsiye edilir.

Pelet temizleme: Yağış reaksiyon ve bunu takip eden etanol yıkama sırasında, cDNA pelet kaybetmek çok kolaydır. Pelet çok dikkatli ve titiz dikkat zorunludur.

Membran merkezine su uygulamak: Membran RNA elüsyon adım sırasında, suyun doğrudan silika membran merkezine 30 ul "squirt" için önemlidir. Bu başarılı değilse, sütun santrifüj ve çıkan elutant silika membran tekrar tekrar uygulanan olabilir. Bu gerekli olduğu birçok kez tekrarlanabilir.

Modifikasyon ve Ürün Oyuncu Değişikliği:

1. Alternatif RNA temiz-up sütunlar ikame edilebilir. Örneğin, USB hazırlık kolaylığı ve Invitrogen Saf Link RNA kiti ve birkaç isim Omega RNA temizleme kiti.
2. Schizosaccharomyces pombe isteğe bağlı bir maya. Affymetrix GeneChip aynı yonga üzerinde hem genomların
3. Çeşitli tedaviler ve saatler kullanılıyor olabilir. Bu ilaç tedavileri, sıcaklık tedavileri, anti-oksidanlar, vb Tedavi kez de ayarlanmış olabilir içerebilir.
4. DNaz tedavi yöntemleri Oligo (dT) astar kullanımı açıklanan istihdam çünkü gerekli olmayabilir.
5. Aynı 30 ul kısım sütun kapalı RNA çift elüsyon gerçekleştirmek için gerekli değildir. Bir kere hemen hemen her zaman yeterli olmaktadır. Bu, tam bir iyileşme elde edilir olmasını sağlamak için tavsiye edilir. Ayrıca, sütun RNA Zehir kullanılan su 65 Önceden ısıtılmış ° C daha fazla silis sütun RNA kurtarmak için yeteneklerini geliştirmek.
6. RNA ölçmek için pek çok yöntem mevcuttur. Eppendorf ve Nanodrop sadece kullanım kolaylığı için seçilen ve doğruluğu test edilmiştir.
7. Agaroz jel elektroforezi birçok standart laboratuar ekipmanları kullanılarak yapılabilir. E-Gel gerekli ama RNaz ücretsiz ve jel katılaşma bekleme süresi gerektirmez, çünkü arzu değildir.
8. Ürünler için Sipariş bilgileri temin edilmiştir. Ancak, birçok genel reaktifler birden çok tedarikçiden sipariş edilebilir.
Bir Döngüsü cDNA reaktifleri ayrı ayrı satın alınabilir.
9. Diğer hedef hazırlık yöntemlerdir, ancak bu bir öğrenci için daha fazla eğitim fırsatları sunmaktadır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spetrophotometer
Thermocyler
Mikrosantrifüj
Vortex
Stir Tabaklar (2)
P-10s Pipet
P-20 Pipet:
P-200 Pipet:
P-1000 Pipet:
Kamera ve transilluminator'de
E-Jel Aparatı Invitrogen G6000-08
E-Jeller Invitrogen G6018-02
Axygen 1,7 ml. Açık Krackler 383-MCT175C
Axygen 0.5 ml açık tüpler Krackler 383-MCT060C
Axygen 2ml yakalama tüpler Krackler 383-MCT200NC
P-10 ART ipuçları kutuları: CLP BT10XL
Kutular P-100 SANAT ipuçları: CLP BT200
Kutular P-20 ART ipuçları: CLP BT20
Maya Chips
25 ml steril tek kullanımlık pipetler
5ml steril tek kullanımlık pipetler
Mikrofuge'de tüp rafları
Kimwipes:
Lab Coats
Barlar karıştırın
Kültür matara
Innoculating döngüler
Sharpies
Eldiven
Otoklav bandı
Karıştırıcı bar
% 30 Hidrojen Peroksit EMD Millipore 386.790
Ca, Mg olmadan HBSS veya boya Sigma-Aldrich H6648-100ml
Qiagen Rneasy Mini Kit: Qiagen 74.104
Qiagen DNaz Kit: Qiagen 79.254
Rnase Remover Denville Bilimsel D1180
Harleco Alcohol% 100 EMD Millipore 65.347
ENZO IVT Seti ENZO ENZ-42655-10
Lyticase: Bir şişe VWR IC19012310
Su, Hücre Kültürü notu EMD Millipore 4,86505
Maya kültürü: ATCC 18.824
YPD suyu tozu EMD Millipore 4,8504
D (+) Glikoz, Susuz EMD Millipore 346.351
Sorbitol EMD Millipore 56.755
EDTA EMD Millipore 4005
SDS çözeltisi,% 20 EMD Millipore 7990-OP
Pelet Boya EMD Millipore 69.049
PCI RNaz DNaz bedava (7 alikotları): Fisher AC32711-500
7.5 Milyon NH4OAc Fisher ICN1987 5980
Parçalanma Tampon (200 mM Tris-asetat, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA)
Trizma Base Fiaher 50-899-90034
KOAc Fisher NC9757725
MgOA Fisher NC9681042
Yükleme Boya Invitrogen 10482055
PCR Belirteçleri EMD Millipore 69.278-3
Faz Kilit Jeller Fisher FP2302820
Bir Döngüsü cDNA Kit Invitrogen A10752-030
Içerir;
E. coli DNA Pol
DNTP
T4 DNA Pol.
T-7 oligod (T)
0.5 ml EDTA, pH 8.0
İlk Strand Tampon
E. Coli RNaseH
İkinci Strand Tampon
E. Coli DNA ligaz
Üst Simge II.
DTT