Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

Résumé

Dans ce protocole d'expression génique, chez la levure ( Saccharomyces cerevisiae) Est modifié après l'exposition au stress oxydatif induit par l'ajout de peroxyde d'hydrogène (H ₂ O ₂), Un agent oxydant.

Résumé

Dans ce protocole, l'expression des gènes dans la levure (Saccharomyces cerevisiae) est modifié après l'exposition au stress oxydatif induit par l'ajout de peroxyde d'hydrogène (H ₂ O _2), un agent oxydant. Dans l'expérience, la levure est cultivée pendant 48 heures dans un bouillon YPD 1/2X contenant du glucose 3X. La culture est divisé en un contrôle et un groupe traité. La culture expérimentation est traitée avec 0,5 mM de H ₂ O ₂ dans Hanks saline tamponnée (HBSS) pendant 1 heure. La culture de contrôle est traitée avec HBSS uniquement. L'ARN total est extrait de deux cultures et est convertie en un produit marqué à la biotine ARNc à travers un processus en plusieurs étapes. Le produit de synthèse final est repris à l'installation de base UVM biopuces et hybridé à l'GeneChips levures Affymetrix. Les données résultant d'expression génique sont téléchargés dans le logiciel d'analyse de données bioinformatiques.

Protocole

1. Isoler ARN total de Saccharomyces cerevisiae En utilisant la lyse enzymatique

1. Préparer une zone de travail exempt de RNase ZAP en utilisant la RNase (Ambion).
2. Préparer une solution fraîche réactif lyticase travailler en ajoutant 1 ml d'eau exempte de RNases directement au flacon lyticase pour faire une solution de travail final de 10 U / ul. Vortex bien et inverser plusieurs fois pour assurer un mélange complet. Ce 10 unités / ul solution est stable pendant 12 heures.
3. Préparer une solution fraîche DNase I solution en utilisant la trousse de Qiagen DNase et de stocker sur la glace.
4. Label d'un tube de 1,7 ml microtubes avec vos informations d'identification. Transfert de 1,5 ml de la culture de levure appropriée dans le tube.
5. Centrifuger le tube à 5000 xg (environ 3 / 4 pleine vitesse) pendant 2 minutes à température ambiante. Retirer délicatement le surnageant (sans déranger granulés) à l'aide d'une micropipette et jeter le surnageant.**** Répétez l'étape 4 si la taille de culot est trop petit ou si elle est indiquée par l'instructeur .****
6. Ajouter de l'eau 1000 ul DEPC au culot, vortex et centrifuger à 5000 xg pendant 2 minutes. Jeter le surnageant. Retirez le plus de liquide que possible à partir du culot de la levure.
7. Ajoutez les lignes suivantes à la levure et granulés de vortex pour mélanger.
   (10u/μl)
8. Incuber pendant 30 min à température ambiante.
9. Mélanger délicatement le tube toutes les 10 minutes pour générer sphéroplastes. Sphéroplastes doit être manipulé avec soin. Examiner la levure sous le microscope pour observer sphéroplastes complète. Tout en examinant la levure sur la lame de microscope, ajoutez une petite quantité de SDS 0,1% à causer la levure à gonfler et à former des sphères parfaites (même pour les cellules en herbe). Cela indique que les parois des cellules ont été digérés.
10. Ajouter 350 pi de tampon RLT-b dans le tube et le vortex Vigoureusement Pendant 1 minute. Assurez vous que votre tube est fermé hermétiquement par la tenue du couvercle fermé pendant vortex. Cette procédure va lyser les sphéroplastes.
11. Ajouter 250 ul d'éthanol à 100% pour le tube et le vortex brièvement. Un précipité peut se former après addition d'éthanol, mais cela n'affectera pas la collecte de l'ARN.
Collecte de l'ARN: Label une colonne RNeasy avec votre identification informationand attentivement transférer l'ensemble de la solution de l'étape 10 à la colonne de centrifugation à l'aide d'une micropipette. Attention à ne pas toucher la membrane de silice avec l'embout de la pipette. Fermer le tube et centrifuger pendant 15 secondes à pleine vitesse. L'ARN dans l'échantillon se conformer à la membrane de silice de la colonne.
12. Retirer la colonne de centrifugation du tube de collecte. Déposer le passage à travers le liquide (le liquide dans le tube collecteur) Retour sur la colonne et centrifuger à nouveau. Jeter le tube collecteur (avec le débit à travers des fluides) et le lieu de la colonne spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml.
13. Ajouter 350 pi de tampon RW1 à la colonne spin. Cette solution est utilisée pour laver les ARN et éliminer les sels dissous et des débris cellulaires. Fermer le tube et centrifuger pendant 15 secondes à pleine vitesse.
La digestion de l'ADN: Retirer la colonne de centrifugation de la centrifugeuse, ouvrez le couvercle du tube et ajouter 80 ul de DNase I solution au milieu de la membrane de la colonne. Cette étape sera digérer toute ADNg dans l'échantillon. Fermez le couvercle colonne et incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
14. Transfert de la colonne spin pour un nouveau tube collecteur de 2 ml.
Nettoyage et lavage de l'ARN: Ajouter 350 pi de tampon RW1 à la colonne et centrifuger à pleine vitesse pendant 15 secondes.
15. Jeter le tube collecteur et le lieu de la colonne spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml.
16. Ajouter 500 ul de tampon RPE à la colonne spin pour laver l'ARN sur la membrane de silice. Fermer le tube et centrifuger pendant 15 secondes à pleine vitesse.
17. Jeter le tube collecteur et le lieu de la colonne spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml.
18. Lavez la membrane de silice à nouveau en ajoutant un autre tampon RPE 500 ul de la colonne. Fermer le tube et centrifuger pendant 15 secondes à pleine vitesse.
19. Placer la colonne spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml et centrifuger dans une microcentrifugeuse à pleine vitesse pendant 1 minute pour s'assurer que tout liquide résiduel est retiré de la membrane de silice.
Récupération de l'ARN: Transférer la colonne RNeasy dans un nouveau microtube 1,7 ml qui a été étiqueté avec vos informations d'échantillon. Notez que le bouchon du tube de nouvelles sera laissé ouvert pour les prochaines étapes.
20. Délicatement la pipette 30 ul d'eau sans RNase Directement sur le centre De la membrane de silice. Ne pas toucher la membrane de silice avec l'embout de la pipette (voir schéma). Regardez de plus près que vous effectuez cette étape. Utilisez les deux mains pour guider la pipette. Assurez-vous que l'eau est répartie uniformément sur la membrane.
21. Incuber la colonne de centrifugation à la température ambiante pendant 1 minute. Centrifugeuse à pleine vitesse pendant 30 secondes.
22. Délicatement le transfert de l'ul 30 qui est récupéré dans le tube de 1,7 ml de retour sur le centre de la membrane de silice de la colonne de même spin que dans l'étape 22 ci-dessus. Placer la colonne de retour dans le même tube de prélèvement 1,7 ml et incuber pendant 1 minute à température ambiante. Centrifuger 1 minute à pleine vitesse. Cette élution doubles assure que le montant maximal de l'ARN est récupéré à partir de la membrane.
23. Label deux nouveaux microtubes 1,7 ml avec vos informations d'identification et de transférer l'ensemble de l'échantillon récupéré l'ARN à l'un de ces tubes.
24. Transfert 4 pi de cet échantillon à l'autre tube étiqueté. Cet échantillon sera transporté vers UVM pour la quantification et l'ARN Nanodrop évaluation qualitative (Ceci est de valider l'analyse quantitative et qualitative d'ARN effectuées sur place à participer institut).
25. Placez tous les échantillons sur la glace.
Quantification ARN: Utiliser le BioPhotometer Eppendorf, mesurer l'absorbance de l'échantillon d'ARN sur le spectrophotomètre à une dilution de 1 à 50 (1 microlitre d'échantillon + 49μl H ₂ O).
26. Evaluer la qualité d'ARN en utilisant le E-Gel (Invitrogen) 1,2% préfabriqué gel d'agarose pour électrophorèse.
ARN analyse qualitative: Mettre en place l'appareil d'électrophorèse E-gel. Pré-run le gel pendant 2 minutes selon le protocole du fabricant. Après la pré-course, enlever le peigne gel et ajouter 14 l d'eau à chaque bien suivi par 1 microlitre de chaque échantillon dans chaque puits. Mélangez bien par aspiration et refoulement. Utilisez une échelle de taille appropriée de l'ADN dans un puits pour comparaison de taille plus tard (BioLine échelle facile, je taille standard ou Novagen PCR marqueur). Enregistrement dont l'échantillon est dans chaque couloir. Exécutez le gel pendant 20 minutes.
27. Prenez une photo du gel.

2. Synthèse du premier brin d'ADNc

1. Label de 0,5 ml PCR tube avec vos informations d'identification. De la concentration d'ARN déterminée à partir de l'expérience ci-dessus, calculer le volume de l'échantillon pour obtenir 3,0 ug. Reporter ce montant dans le tube. Ajouter suffisamment d'eau sans RNase pour porter le volume à 11,0 ul.
2. Ajouter 1,0 ul T7 oligo (dT) _{24 pour le tube. Assurez-vous d'accorder une attention particulière au volume pipette lors de cette étape pour s'assurer que tous les réactifs ont été transférés. Vortex, le tube et centrifuger à pleine vitesse pendant 5 secondes. Placer le tube dans un thermocycleur à 70 ° C pendant 10 minutes.}
3. Alors que les 70 ° C d'incubation est en cours, préparer le mélange du premier brin de maître dans un nouveau tube. Soyez sûr d'ajouter les réactifs suivants EN ORDRE, et centrifuger à pleine vitesse pendant 5 secondes et placer le tube sur la glace.
   

SGbuffer	10 ul
30 pl

Utiliser une micropipette P2 pour mesurer les volumes de 2 pi ou moins.
28. Après le 70 ° C d'incubation à l'étape 2 est terminée, ajouter 8 ul du mélange maître brin d'abord fait à l'étape 3 dans le tube et incuber dans un thermocycleur à 42 ° C pendant 60 minutes. Lors de la première synthèse des brins d'incubation est terminée, placer le tube sur la glace. Pendant cette incubation, préparer le mélange du deuxième brin maître.

3. Synthèse du second brin d'ADNc

1. Faire les suivants deuxième mélange maître brin au sein d'un nouveau tube. Gardez-le sur la glace. Vortex et centrifuger tous les réactifs avant utilisation. Ajouter les réactifs dans l'ordre indiqué.
   

Premier mix master volet:
FirstStrandBuffer5X	4 pl
0.1MDTT	2 pl
10mMdNTP	1 pl
SuperscriptII	1 pl

Ecoli ADN ligase (10U/ul) Ecoli ADN polymérase I (10U/ul) Ecoli RNase H (2U/ul)
29. Vortex le tube et centrifuger pendant 5 secondes à pleine vitesse.
30. Quand les 42 ° C d'incubation est terminée, le transfert de tous les ul 130 de la master mix deuxième volet au tube échantillon contenant de l'ARN et des réactifs premier volet. Vortex et centrifuger pendant 5 secondes à la température ambiante. Incuber le tube pendant 2 heures à 16 ° C dans un thermocycleur.
31. A la fin de l'incubation de 2 heures et alors que l'échantillon est encore à 16 ° C, ajouter 2μl réactif T4 ADN polymérase du tube. Brièvement au vortex et centrifuger le tube et incuber à 16 ° C pendant plus de 5 minutes supplémentaires. L'incubation plus longue de 5 minutes peut réduire la qualité de l'ADNc en raison de l'activité 5'exonuclease 3'to de la polymérase T4.
32. A la fin de l'incubation de 5 minutes, ajouter 10 ul d'EDTA 0,5 M pour arrêter la réaction de la T4 ADN polymérase. Stocker le tube à -20 ° C.

4. Précipitants de l'ADNc

1. Centrifuger un tube de gel à verrouillage de phase à pleine vitesse pendant une minute pour s'assurer que le gel est au fond du tube. Ne pas vortexer TUBES VERROUILLAGE DE PHASE.
2. Ajouter 162 pi de la À partir du pH 8,0 tampon Tris phénol / chloroforme / alcool isoamylique (PCI) pour le contenu du brin d'ADNc second tube réaction de synthèse et de vortex pendant 5 secondes pour mélanger le contenu (le volume total de l'étape de synthèse d'ADNc à partir de l'expérience ci-dessus est de 162 ul. L'étape PCI nécessite des volumes égaux des mélanges aqueux et organiques).
3. Transfert de tous les mélange d'ADNc-PCI sur le tube de gel de verrouillage de phase utilisant une micropipette. Ne pas vortexer Le tube de gel à verrouillage de phase.
à pleine vitesse pendant 2 minutes.
4. Label d'un nouveau microtube 1,7 ml. Utiliser une micropipette pour transférer la couche supérieure du tube de gel de verrouillage de phase à la nouvelle étiquette 1,7 ml tube. Essayez de recueillir autant de la couche que possible.
5. Ajoutez les lignes suivantes dans le tube de 1,7 ml à centrifuger et le vortex.
   

Second mélange maître brin
L'eau DEPC	91 ul
Buffer 5X deuxième brin	30 ul
DNTP (10 mM)	3 ul
1 ul
4 ul
1 ul

33. Placer le tube dans la centrifugeuse avec la charnière du tube vers l'extérieur et centrifuger à pleine vitesse pendant 20 minutes à température ambiante.
34. Retirez doucement le tube de la centrifugeuse en faisant attention de ne pas perturber le culot d'ADNc. Le culot doit être rose et environ la taille d'un grain de sel et sur le côté du tube sous la charnière. Placez-le sur la glace et de procéder immédiatement à l'étape suivante.

5. Nettoyage du culot d'ADNc

1. Utiliser une micropipette P1000, retirez soigneusement tout le surnageant du tube. Attention à ne pas perturber le culot. Rappelez-vous que la pastille est votre échantillon!
2. Ajouter 500μl d'éthanol froid à 80% (-20 stockées dans ^° Congélateur C) pour le tube. Doucement bouchon du tube et de l'inverser plusieurs fois lentement. Regardez vos granulés de très près. Si le culot se détache, placer le tube de retour à grille et laisser le culot se déposent au fond. Alternativement, vous pouvez Centrifuger le tube à plein régime pendant 15 secondes pour obtenir le culot de retour vers le fond du tube.
3. Utiliser une micropipette P1000, retirez soigneusement l'éthanol étant très attentif à ne pas perturber le culot. Astuce du tube pour permettre l'enlèvement des autant de liquide que possible.
4. Répétez les étapes 2 et 3 avec une aliquote de nouvelles d'éthanol à 80%.
5. Enfin, enlever tous les éthanol possible en utilisant une micropipette P1000. Centrifuger le tube à pleine vitesse pendant 5 secondes et en utilisant une micropipette P20, retirez le microlitres dernières années de l'éthanol. Le but est d'enlever l'éthanol autant que possible sans perturber le culot.
6. Placez le tube ouvert dans un rack ou une boîte de séchage pendant 10-20 minutes pour faire évaporer l'éthanol restant. Les granulés secs se perd facilement une fois qu'elle est sèche. Méfiez-vous de traiter le tube doucement. Quand vous avez terminé, fermer le couvercle. Visualisez les granulés secs pour confirmer qu'elle est présente dans le tube.
7. Reprendre le culot dans 22 ul d'eau exempte de RNase et placer le tube sur la glace.

6. InVitroTranscription (IVT)

1. Le ENZO BioArray kit contient tous les réactifs nécessaires pour préparer la biotine ARNc marqué à partir d'ADNc.
   Un mixfor maître toute la classe sera préparé à titre d'instructeur follows.The va préparer ce mélange, ou de désigner quelqu'un de la classe. Cela doit être fait dans une région exempte de RNase.
   

L'éthanol (100%)	405 ul
NH 4 OAc	80 ul
Peinture Pellet	1 ul

2 [Biotinnucleotides 10x] 3 [TNT 10x] 5 [20x T7 RNA polymérase] NOTE:
35. Label de 0,5 ml PCR tube. Combinez les éléments suivants dans le tube et la pipette et plusieurs fois vers le bas pour mélanger. Spin dans une centrifugeuse à pleine vitesse pendant 5 secondes pour obtenir tous les réactifs au fond du tube.
    

	Amt / échantillon	# Échantillons	Total
Réactif 1 [tampon de réaction 10X]	4μl
4μl
4μl
Réactif 4 [Inhibiteur de RNase 10x]	4μl
2μl
Volume total	18 ul

Préparer le mélange maître suffisante pour le nombre d'échantillons plus un. Ceci assurera assez pour fins de pipetage.
36. Incuber le tube à 37 ° C for16 heures dans le thermocycleur. Lorsque la réaction est terminée, stocker l'échantillon à -20 ° C

7. Nettoyage de la biotinylé ARNc

1. Transférer l'échantillon ARNc ensemble à un nouveau microtube 1,7 ml. Ajouter 60 ul d'eau exempte de RNase et 350 ul tampon RLT et de vortex pendant 5 secondes.
2. Ajouter 250 ul d'éthanol à 100% et le vortex de nouveau.
3. Label une colonne RNeasy et le transfert de l'échantillon ARNc toute la colonne. Soyez prudent de ne pas toucher la pointe de la pipette sur la membrane de silice. Fermer le couvercle et centrifuger pendant 15 secondes à pleine vitesse.
4. Retirer la colonne de centrifugation du tube de collecte. Déposer le passage à travers le liquide (le liquide dans le tube collecteur) Retour sur la colonne et centrifuger à nouveau pendant 15 secondes.
5. Placer la colonne spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml et pipette 500 ul de tampon RPE dans la colonne spin. Fermer le tube et centrifuger pendant 15 secondes à pleine vitesse. Jeter le tube collecteur et le col à travers le liquide. Placer la colonne spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml.
6. Ajouter un autre tampon RPE 500 ul de la colonne.
7. Transfert de la colonne de centrifugation dans un tube de collecte de nouvelles et d'effectuer une colonne «séchage» tournent à pleine vitesse pendant 2 minutes.
8. Label d'un nouveau microtube 1,7 ml avec vos informations d'identification. Transférer la colonne spin pour ce tube.
30 ul d'eau sans RNase sur la membrane de silice centre RNeasy et incuber à température ambiante pendant 1 minute. Fermer le tube et centrifuger pendant 1 minute à pleine vitesse.
9. Délicatement le transfert de l'ul 30 qui est récupéré dans le tube de 1,7 ml de retour sur le centre de la membrane de silice de la colonne RNeasy même spin. Placer la colonne de retour dans le même tube de prélèvement 1,7 ml et incuber pendant 1 minute à température ambiante. Centrifuger 1 minute à pleine vitesse. Cette élution doubles assure que la quantité maximale d'ARNc est récupéré à partir de la membrane.
10. Transférer ce nettoyage ARNc marqué à la biotine à un nouveau tube à centrifuger 1,7 ml et une étiquette appropriée.
11. Déterminer la concentration ARNc utilisant la même procédure que décrite ci-dessus lors de la procédure d'isolement d'ARN. Noter la concentration et de 260/280 ratio.

8. Fragmentation de l'ARNc cible pour la préparation

1. Label de 0,5 ml PCR tube avec vos informations d'identification. Transférer 5 ug de la quantité équivalente de ARNc au tube. Ajouter suffisamment d'eau sans RNase pour porter le volume total à 16,0 ul, puis ajoutez 4,0 l de tampon 5X la fragmentation du tube. Le volume total dans le tube devrait être 20,0 ul.
2. Vortex le tube et centrifuger pendant 10 secondes. Incuber le tube à 94 ° C pendant 30 minutes dans un thermocycleur. Mis sur la glace après l'incubation.

9. Évaluation de l'ARNc fragmentés et non fragmentés en utilisant gel d'agarose

1. Mettre en place l'appareil d'électrophorèse E-gel en utilisant un préfabriqué de 1,2% en gel d'agarose. Pré-run le gel pendant 2 minutes selon la recommandation du fabricant
2. Ajouter 14 ul d'eau pour chaque puits sur le E-gel.
3. Ajouter 2μl de chaque échantillon dans chaque puits et pipette haut et bas pour bien mélanger. Analyser les ARNc fragmentés et non fragmentés de chaque échantillon. Il est préférable de charger les échantillons (fragmentés et non fragmentés) dans les ruelles avoisinantes. Noter l'identité de chaque échantillon dans chaque couloir.
4. Ajouter 4 pi d'une échelle d'ADN (BioLine échelle facile, je taille standard ou Novagen PCR marqueur) à une voie du gel
5. Exécuter le gel pendant 20 minutes.
6. Visualiser le E-gel sur un transilluminateur. Prenez une photo du gel.

10. L'hybridation de la levure 2,0 GeneChip

:

Figure 1. Un numérisés Affymetrix GeneChip levure Image (Software Affymetrix GeneChip d'exploitation (SMOC))

Figure 2. Plot de dispersion 2D de tous les transcrits génétiques (~ 6700 gènes), comparant un contrôle et des données de la levure traitée. Chaque point représente un seul gène. Les gènes de couleur en violet indiquent les gènes qui sont différentiellement exprimés alors que les gènes de couleur rouge ne sont pas. Les descriptions des gènes différentiellement exprimés sont étiquetés dans la légende correspondante et la plupart sont impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire dans cet exemple. (Affymetrix GeneChip d'exploitation Software (GCOS))

Figure 3. Cet organigramme illustre de façon différentielle des gènes exprimés dans une voie affectée biologique. Les gènes indiqués avec une étoile rouge indiquent les gènes régulés à la baisse dans la voie méiotique. (La base de données pour l'annotation, visualisation et intégré de découverte (DAVID)

Figure 4. Résultats Représentant d'un complot du volcan. Les échantillons de contrôle et de traitement ont été comparés avec une valeur-p coupure de 0,05 et un changement d'expression 1,5 fois coupé. Cette parcelle a été généré en utilisant un logiciel de Genesifter Geospiza gracieusement offert aux étudiants à des fins éducatives.

Mélange d'ADNc	22μl
Enzomastermix [fromabove]	18μl
TotalVolume	40μl

Discussion

Applications et la signification.

Le Vermont Génétique Réseau programme de sensibilisation, à l'Université du Vermont, effectue cycle de sensibilisation à huit collèges au baccalauréat partenaires à travers l'état. L'objectif de la sensibilisation VGN Core est d'exposer les étudiants dans l'État du Vermont à l'état de l'art et la technologie scientifique des ressources en utilisant des expériences pratiques. Le module décrit puces a été développé en 2003 et mises à jour ultérieurement. Il a été proposé comme un mini-cours ou intégré dans le curriculum de laboratoire existantes dans les établissements participants.

Ce projet, entre les cœurs de la recherche universitaire et des collèges de premier cycle, favorise les collaborations en matière d'éducation et de recherche. Microarray de sensibilisation à travers l'État a renforcé des programmes et la recherche et créé des occasions de réseautage pour les installations de base, les professeurs et les étudiants.

Comme la faculté d'adopter le programme de premier cycle, ils sont encouragés à concevoir des expériences uniques à condition qu'il existe appropriée GeneChips Affymetrix et d'annotation disponibles. Toutes les informations pour ce module, y compris le manuel de laboratoire, des références et des présentations PowerPoint sont disponibles en ligne (Vermont Génétique Réseau, 2008).

Les étapes critiques:

Sphéroplastes: Il est important d'observer sphéroplastes réussie sous le microscope. L'utilisation de SDS est très bénéfique car il provoque le gonflement de la levure résultant en sphéroïdes. Il est important d'observer que les cellules bourgeonnantes forment sphéroïdes ainsi. Si sphéroplastes partielle est observée, un traitement prolongé avec lyticase est recommandée.

Nettoyage Pellet: Au cours de la réaction de précipitation et après lavage éthanol, il est très facile de perdre de l'ADNc de granules. Un soin extrême et une attention méticuleuse au culot est impérative.

Application de l'eau au centre de la membrane: Lors de l'étape d'élution d'ARN à partir de la membrane, il est important de "gicler" l'ul 30 de l'eau directement au centre de la membrane de silice. Si ce n'est pas accomplie, la colonne peut être centrifugé et l'éluant qui en résulte peut être ré-appliquée sur la membrane de silice à nouveau. Ceci peut être répété autant de fois que nécessaire.

Modifications et substitutions de produits:

1. Alternatif de l'ARN de nettoyage des colonnes peut être substitué. Les exemples sont la clé USB de préparation l'aise et le Invitrogen pure Lien ARN kit, et l'Oméga ARN nettoyage kit pour en nommer quelques uns.
2. Schizosaccharomyces pombe est une levure en option. Le GeneChip d'Affymetrix contient deux génomes sur une même puce
3. Divers traitements et les temps peuvent être utilisés. Cela peut inclure des traitements médicamenteux, les traitements de température, anti-oxydants, temps de traitement etc peuvent également être ajustés.
4. DNase traitement peut ne pas être nécessaire parce que les méthodes décrites employer l'utilisation d'un oligo (dT) primer.
5. Il n'est pas nécessaire d'effectuer une élution de l'ARN à double arrêt de la colonne avec la même partie aliquote 30 pi. Une fois n'est presque toujours suffisante. Ceci est suggéré d'assurer une récupération complète est obtenue. De plus, l'eau utilisée pour éluer l'ARN à partir de la colonne peut être pré-chauffée à 65 ° C pour améliorer encore la capacité de récupérer l'ARN de la colonne de silice.
Beaucoup sont disponibles pour quantifier l'ARN. Le Eppendorf et Nanodrop ont seulement été choisis pour leur facilité d'utilisation et tester la précision.
6. Électrophorèse sur gel de nombreux être effectuée en utilisant l'équipement de laboratoire standard. Le E-Gel n'est pas obligatoire mais est souhaitable, car elle est la RNase gratuit et ne nécessite pas de temps de solidification du gel d'attente.
7. Informations de commande pour des produits a été fourni. Cependant, de nombreux réactifs généraux peuvent être commandés auprès de plusieurs fournisseurs.
8. Un cycle de réactifs d'ADNc peuvent être achetés séparément si cela est plus rentable.
9. Il existe d'autres méthodes de préparation cible, mais nous nous sentons celui-ci offre des possibilités d'enseignement de plus pour l'étudiant.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spetrophotometer
Thermocycleur
Microcentrifugeuse
Vortex
Incorporer plaques (2)
P-10s pipeteurs
P-20 de pipettes:
P-200 de pipettes:
P-1000 est pipeteurs:
Camera et transilluminateur
E-Gel Appareillage Invitrogen G6000-08
E-Gels Invitrogen G6018-02
Axygen 1,7 ml. Effacer Krackler 383-MCT175C
Axygen tubes de 0,5 ml claires Krackler 383-MCT060C
Les boîtes de pointes ART P-10: CLP BT10XL
Boîtes de P-100 astuces ART: CLP BT200
Boîtes de P-20 Conseils ART: CLP BT20
Boîtes de Conseils ART P-1000: CLP BT1000
25 ml stériles pipettes jetables
5ml stérile pipettes jetables
Racks tube de centrifugeuse
Kimwipes:
Lab Manteaux
Incorporer Bars
Boucles inoculer
Sharples
Gants
Ruban autoclave
Barres Agitateur
Peroxyde d'hydrogène à 30% EMD Millipore 386790
HBSS sans Ca, Mg, ou de la teinture Sigma-Aldrich H6648-100ml
Qiagen RNeasy Mini Kit: Qiagen 74104
Qiagen DNase kit: Qiagen 79254
Remover Rnase Denville scientifique D1180
Harleco alcool à 100% EMD Millipore 65347
ENZO IVT Kit ENZO ENZ-42655-10
Lyticase: une bouteille VWR IC19012310
L'eau, le grade de culture cellulaire EMD Millipore 4,86505
YPD de bouillon en poudre EMD Millipore 4,8504
D (+) Glucose anhydre EMD Millipore 346351
Sorbitol EMD Millipore 56755
EDTA EMD Millipore 4005
SDS solution, 20% EMD Millipore 7990-OP
Peinture Pellet EMD Millipore 69049
PCI RNase DNase libre (7 aliquotes): Fisher AC32711-500
7.5M NH4OAC Fisher ICN1987 5980
La fragmentation du tampon (200 mM Tris-acétate, pH 8,1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA)
Base de Trizma Fiaher 50-899-90034
KOAc Fisher NC9757725
MgOA Fisher NC9681042
Chargement Dye Invitrogen 10482055
Marqueurs PCR EMD Millipore 69278-3
Phase Lock Gel Fisher FP2302820
Un cycle de kit d'ADNc Invitrogen A10752-030
Comprend;
E. coli ADN Pol
DNTP
T-7 oligod (T)
0.5ml EDTA pH 8,0
Tampon First Strand
E. RNaseH Coli
Tampon deuxième brin
E. ADN ligase Coli
SuperScript II
TNT