Nanoinjection parejas y Ensayo de electrofisiología para la detección de bioactividad de compuestos utilizando el Drosophila melanogaster Sistema de fibra gigante

Resumen

Una rápida En vivo Ensayo para probar compuestos de neuromoduladores que utilizan el sistema de fibra gigante (GFS) de los Drosophila melanogaster Se describe. Nanoinjections en la cabeza del animal, junto con registros electrofisiológicos de la EFP puede revelar la bioactividad de compuestos en las neuronas o músculos.

Resumen

Compuestos de cribado para la actividad in vivo puede ser utilizado como un primer paso para identificar a los candidatos que pueden ser desarrollados en ^1,2 agentes farmacológicos. Hemos desarrollado un novedoso nanoinjection / electrofisiología ensayo que permite la detección de efectos moduladores bioactivos de los compuestos sobre la función de un circuito neuronal que media la respuesta de escape en la Drosophila melanogaster ^3,4. Nuestro ensayo in vivo, que utiliza el sistema Drosophila gigante de fibra (EFP, Figura 1) permite la detección de diferentes tipos de compuestos, tales como pequeñas moléculas o péptidos, y requiere sólo cantidades mínimas para provocar un efecto. Además, el GFS Drosophila ofrece una gran variedad de posibles dianas moleculares en las neuronas o músculos. Las fibras gigantes (GFS) sinapsis eléctrica (uniones Gap), así como químicamente (colinérgico) en una sinapsis periférica Interneuron (PSI) y la neurona Tergo trocantéreo muscular (TTMn) ⁵ 6. Por último, las uniones neuromusculares (UNM) de la TTMn y la DLMn con el salto (TTM) y los músculos de vuelo (DLM) son glutamatérgica ^7-12. Aquí, demostramos cómo inyectar cantidades nanolitros de un compuesto, mientras que la obtención de registros intracelulares electrofisiológicos del sistema de fibra gigante ¹³ y cómo controlar los efectos del compuesto sobre la función de este circuito. Se muestra la especificidad de la prueba con citrato de methyllycaconitine (MLA), un antagonista de nAChR, que interrumpe a la ISP a DLMn conexión, pero no el GF TTMn conexión o la función de la UNM en el salto o los músculos del vuelo.

Antes de comenzar este video es muy importante que se observe con atención y se familiaricen con el video titulado "Jove registros electrofisiológicos de la vía fibra gigante de D. melanogaster "de Augustin et al ^7, como el video que aquí se presenta pretende ser una expansión de esta técnica existente. Aquí se utiliza el método de los registros electrofisiológicos y el enfoque en detalle sólo en la suma de los pares de nanoinjections y la técnica de monitoreo.

Protocolo

1. Electrofisiología Rig Set-up

1. El equipo requerido para el equipo de perforación electrofisiología configuración se describe en detalle por Augustin et al. en este Diario ^14. Por favor, consulte este artículo para obtener una explicación detallada de los aparatos electrofisiológicos necesarios.
2. Modificar el equipo de electrofisiología se ha descrito anteriormente puesta a punto ¹⁴ mediante la adición de un micromanipulador sexto, que ocupa la nanoinjector. Para facilitar el acceso a la cabeza del animal que debe ser colocado entre los dos electrodos estimulantes micromanipuladores como se muestra en la Figura 2.
3. Antes de comenzar el experimento, asegúrese de que tiene un rango confortable en todos los ejes de rotación con todos los micromanipulador, y que todos los electrodos, así como la micropipeta de inyección (ver paso 2) puede alcanzar el animal.

2. Nanoinjection Set-up

1. El nanoinjection puesta en marcha requiere un Nanoliter2000 (World Precisisobre los instrumentos, Sarasota, FL, EE.UU.) o de tipo similar de inyección que permite inyecciones controladas en cantidades nanolitros.
2. Preparar aguja de inyección utilizando las micropipetas de vidrio se suministran con el inyector tirando de ellos a una resistencia de 80-100 mW con un extractor de electrodo.
3. Para las inyecciones suaves que se requiere para biselar las micropipetas a una apertura 11-17 m con un ángulo de 45 grados (Figura 3).
4. Poco a poco rellenar la micropipeta de inyección de aceite sintético con una jeringa Hamilton con las instrucciones del manual de Nanoliter2000, asegurando que no queden burbujas de aire.
5. Con cuidado, garantizar la micropipeta en el nanoinjector y prepararla para cargar el compuesto por vaciar el exceso de aceite según las instrucciones del manual de Nanoliter2000.
6. Coloque el inyector en el micromanipulador y cargar el compuesto tal como se indica en el manual de Nanoliter2000. Asegúrese de que la punta de la micropipeta no se rompe durante esteprocedimiento.
7. Establecer la cantidad deseada de nanolitros a ser inyectados en la caja de control del inyector según las instrucciones del manual de Nanoliter2000. Tenga en cuenta que la inyección de la cantidad total no debe superar los 100 nl. Hemos encontrado que las grandes cantidades de soluciones de control de solución salina puede afectar a la función del circuito de EFP.
8. Es crítico para que el inyector desconectado de la caja de control durante la adquisición de grabación con la excepción de la inyección en sí, ya que la fuente de alimentación de la nanoinjector interfiere con las grabaciones, lo que es visible como el ruido de fondo (Figura 4). Sin embargo, no desconecte la fuente de alimentación a la caja de control, ya que volver a configurar.

3. Drosophila melanogaster Preparación

1. Anestesie de 2 a 6 días de edad moscas con CO ₂ o en el hielo a lo descrito previamente ^14,15.
2. Una vez inmóvil, utilizar un par de pinzas para transferir al animal a una red Wi plato pequeñoª cera blanda dental por recogerlo en sus piernas. Tenga en cuenta que una mosca de la fruta macho pesa alrededor de 1,0 mg y una mosca de la fruta hembra pesa alrededor de 1,2 mg, por lo tanto compuesto de-a-peso relación es diferente en las moscas macho en comparación con las mujeres. Por lo tanto, se recomienda utilizar sólo un género para los experimentos.
3. Como se ha descrito previamente ^14,15, cuidadosamente montar la parte dorsal mosca y asegurarse de que el tórax y la cabeza se inmovilizan con cera blanda dental colocado alrededor del cuerpo. Con cuidado, extender las alas de manera que ponen perpendicular al tórax (fig. 2, C). La mosca debe ser montado con el menor daño posible.

4. Nanoinjection emparejado / electrofisiología

1. Coloque la marcha montados en la plataforma de electrofisiología con la cabeza hacia los electrodos de estimulación.
2. Empalar el animal con el estimulante correspondiente suelo, y electrodos de registro como se ha descrito previamente ^14,15 (Figura 2, C). A menos que se lo desea, coloque un electrodo en la grabación de DLM y el otro en el músculo TTM. El músculo DLM está situado en el tórax entre las anteriores dorso-centrales pelos y la línea media de la mosca. El músculo TTM se encuentra cerca de los accesorios de las alas, entre los anteriores y posteriores Supra-Alar pelos de la mosca de la ^7.
3. Alinear la micropipeta inyectable que contiene el compuesto con el centro de la ocelos tres situado en la porción media posterior de la cabeza, pero no se inyecte todavía (Figura 2, C).
4. Antes de la inyección compuesto de obtener un registro al inicio del GF de TTM y GF de DLM vías del sistema de fibra gigante (EFP, Figura 1) a través de la estimulación cerebral. Para ello, activar las fibras gigantes (GFS), con 10 trenes de 10 estímulos (40-50 mV) cada una y durante un tiempo de 0,03 ms a 100 Hz con un retraso de 1 segundo entre las ^14,15 trenes (Figura 4). De tipo salvaje vuela shOuld ser capaz de seguir uno a uno en este tipo de estimulación tanto para DLM y las vías de TTM. Deseche la marcha si el GF GF DLM y de las vías de TTM no siguen la estimulación de 100 Hz con una relación 1:1.
5. Cambie a una estimulación continua del GF con pulsos individuales en 1 Hz (Figura 4).
6. Rápidamente conecte el inyector en la caja de control. A pesar de que el ruido de fondo puede interferir con las grabaciones de 1 Hz de estimulación, no lo deje.
7. Introducir cuidadosamente la micropipeta inyección en la cápsula de la cabeza de la mosca justo debajo de la cutícula, e inyectar la cantidad deseada de compuesto en la hemolinfa de la mosca mientras se mantiene la estimulación de 1 Hz (Figura 4). Debido al sistema circulatorio abierto de la mosca, todo el sistema nervioso será expuesto en el compuesto en cuestión de segundos. Aunque un sitio de inyección en particular no es crítico para entregar compuestos en la hemolinfa, se encuentra la región de la ocelos, que se localizand medial en la parte más dorsal de la cápsula de la cabeza, que es un sitio práctico que permite una inyección que lleva a la distribución rápida y uniforme del compuesto.
8. Inmediatamente eliminar micropipeta inyección desde el sitio de inyección y desconectar el inyector de la caja de control mientras continúa la estimulación de 1 Hz GF hasta 1 min después de la inyección (Figura 4).
9. Con el fin de revelar los efectos más sutiles de los compuestos en el modelo GFS, destacar las fibras gigantes (GFS), con 10 trenes de 10 estímulos a 100 Hz con un retraso de 1 segundo entre los trenes. Continuar para probar la función de las vías de GF con este paradigma cada 5 minutos hasta 15 minutos (Figura 4). Sin embargo, intervalos más cortos o más largos períodos de seguimiento son también posibles.
10. Con el fin de probar si el compuesto tiene un efecto en las uniones neuromusculares (NMJs) de la EFP, y posiblemente reducir los efectos del compuesto, proceder a activar el motor neuronas direccióntemente por la estimulación torácica. Para ello, quite los electrodos de estimulación de los ojos y vuelva a colocar a los lados anterior del tórax con el fin de estimular las neuronas motoras con 10 trenes de 10 estímulos a 100 Hz.

Nota: Las huellas de electrofisiología se muestran en el video no corresponden a los efectos de la inyección de tinte puro.

5. Los resultados representativos

Efecto de un antagonista en el PSI a DLM sinapsis del sistema de fibra gigante

Methyllycaconitine citrato (MLA) es un antagonista nAChR que es específico para a7 subtipos Nachr. El PSI DLMn sinapsis en la vía de GF-DLM depende del subtipo de nAChR Dα7 para su correcto funcionamiento, mientras que la eliminación genética del subtipo nAChR Dα7 no tiene ningún efecto sobre la vía de GF-TTM ^5,6. A fin de demostrar la especificidad y sensibilidad de nuestro ensayo se inyectó MLA a diferentes concentraciones (0, 0,02, 0,04, 0.08, 0,12 ng / mg, 46 nl inyectado) en la cabeza del animal (n = 10 por tratamiento con el compuesto, n = 15 para el tratamiento de solución salina). Sólo las moscas macho (de tipo silvestre genotipo 10E salvaje) fueron utilizados, y el efecto del compuesto se controló durante un total de 15 minutos después de la inyección.

La Figura 5 representa la diferencia entre las grabaciones de referencia obtenidos antes de la inyección y los obtenidos después de la inyección en respuesta a MLA y solución salina de control. Hemos encontrado que la inyección de MLA como resultado la incapacidad de la vía de GF-DLM para seguir uno a uno a 100 Hz por estimulaciones de la FC en el cerebro, mientras que la vía de GF-MTT no se vio afectado. (Figura 5, trazo superior y media, t-test realizado entre los controles de solución salina [0 ng / mg] y las diferentes concentraciones de MLA en cada punto de tiempo a menos que los datos no paramétricos [la normalidad y la igualdad de las diferencias prueba], de lo contrario se utiliza una prueba de rangos de Mann-Whitney Sum. * p <0,001). Sin embargo, una r uno-a-unoespuesta de la DLM se observó cuando las neuronas motoras fueron estimuladas directamente (Figura 5, traza de fondo), lo que demuestra que la función de la UNM DLM y TTM no se ve afectada por la MLA. MLA apareció para alcanzar su efecto máximo 1 minuto después de la inyección de 0,04, 0,08 y 0,12 ng / mg de MLA inyectado, como no hay cambios significativos adicionales se observaron durante los siguientes 15 minutos de período de prueba. Además, el compuesto alcanza un efecto máximo a 0,08 ng / mg, ya fuertes respuestas no se observaron con la dosis mayor de 0,12 ng / mg.

Figura 1. El gigante de fibra de diagrama del sistema del sistema de fibra gigante (EFP). Las fibras gigantes (GFS, que se muestra en rojo) sinapsis eléctrica (uniones Gap), así como químicamente (colinérgico) en un Interneuron sinapsis periférica (PSI, que se muestran en verde) y la neurona Tergo muscular trocantéreo (TTMn, que se muestra en amarillo) ^5. El PSI DLMn (neurona dorsal del músculo longitudinal, que se muestra en azul) de conexión depende de Dα7 nAChR subtipo ^6. Por último, la unión neuromuscular (UNM) de la TTMn y DLMn el salto a la (TTM, que se muestra en color morado) y los músculos del vuelo (DLM, que se muestra en morado) es glutamatérgica.

Nota: El Fondo Mundial para la conexión ISP es eléctrica y química. Sin embargo, en los mutantes que carecen de shakB (uniones), no hay respuesta puede ser grabado desde el DLM a la estimulación de la FC en el cerebro, lo que demuestra que el componente químico en la ausencia de conexiones eléctricas no es suficiente para provocar un potencial de acción en el PSI ^5,16-18. Debido a que el GF a la conexión de la ISP es dependiente de las uniones, esta cifra sólo muestra la brecha de la salida en la sinapsis por razones de simplicidad.

Figura 2.

Micromanipuladores set-up.

1. Una modificación puesta en marcha de un protocolo previamente publicado ¹⁴ se utiliza para ajustar el micromanipulador de inyección de pares de grabaciones de las EFP con nanoinjections simultáneas. La preparación marcha montada se orienta a la cabeza de la mosca hacia el experimentador. El micromanipulador inyección (# 1) se coloca delante de la experimentador entre los dos manipuladores para los electrodos de tungsteno estimulantes (# 2 y # 3). Los dos micromanipuladores para los electrodos de vidrio de grabación (# 4 y # 5) se colocan en el lado izquierdo y derecho, respectivamente. El micromanipulador para el electrodo de tierra de tungsteno (# 6) se coloca más lejos en la parte posterior ya sea en el lado izquierdo (mostrado aquí), o en el lado derecho.
2. Una vista cercana de la parte superior de las disposiciones de los diversos electrodos y micropipeta de inyección.
3. Un bien montado D. melanogaster empalado con electrodos y micropipeta inyección lista para la inyección. Observe que el cuerpo del animalse monta con su tórax en sentido horizontal y sus alas extendidas. La cera está firmemente envuelto alrededor de su cuerpo impidiendo que el animal se mueva. Además, el electrodo de tierra (# 6, en el abdomen), los electrodos de registro de vidrio (# 4 y # 5, en el tórax, resaltada en contornos oscuros) y los electrodos de estimulación (# 2 y # 3, una en cada ojo ) se empalado en su lugar, como se ha descrito previamente ^14. La micropipeta de inyección (# 1) está correctamente alineado con el centro de la ocelos tres (círculo). La inserción de la micropipeta inyección debe ser colocado en esta área.

Figura 3. Micropipeta de inyección de biselado. Un diagrama de una micropipeta adecuadamente biselados se muestra aquí. La apertura del electrodo debe ser biselado a un ángulo de 45 grados y tiene una abertura entre 11 a 17 micras. Una micropipeta adecuada inyección de biselado es crucial para una inyección suave con un mínimo de dAmage a la mosca.

Figura 4. Esquema general del protocolo de nanoinjection / electrofisiología. Un esquema representativo del régimen general de la nanoinjection / protocolo de electrofisiología. Comience por la obtención de un registro al inicio mediante la estimulación de las fibras gigantes (GFS) a 100 Hz con 10 trenes de 10 estímulos cada uno (sólo uno de los trenes que se muestra aquí). Antes de la inyección, comienzan los estímulos 1 Hz un segundo de diferencia. Durante el tiempo de inyección (inyectores, mientras que está conectado a la caja de control), se observará el ruido de fondo considerable, sin embargo, no interrumpir las grabaciones. Después de la inyección (inyectores y está desconectado de la caja de control), continuar con la estimulación de 1 Hz durante 1 minuto más. Por último, procede destacar la FC con 10 trenes de 10 estímulos a 100 Hz, y poniendo a prueba la función de las vías de GF con este paradigma cada 5 minutos hasta 15 minutos. Nota: Las grabaciones wantes de manipular para crear el esquema general y no representan un resultado específico obtenido. No es a escala, no todos los restos se muestran. Haga clic aquí para ampliar la imagen .

Figura 5. Los efectos de la MLA en la EFP.

1. Una representación gráfica de los efectos de la α7 antagonista de citrato de nAChR Methyllycaconitine (MLA) en el camino de GF-DLM de la mosca de la fruta a diferentes concentraciones (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg de n = 10 por tratamiento con el compuesto.; n = 15 para el tratamiento de solución salina). Sólo un minuto después de la inyección, un efecto inmediato y significativo fue visto con 0,04 ng / mg de MLA. Un efecto significativo también fue visto con 0.8ng/mg y 0.12ng/mg del Eje de acción a 100 Hz con la estimulación de la FG. No se observaron diferencias significativas entre los controles de solución salina y 0,02 ng / mg de MLA. Además, no puedo cambiarn efecto fue visto después de un minuto después de la inyección durante el tiempo de prueba (15 minutos). Un t-test se realizó entre los controles de solución salina (0 ng / mg) y las diferentes concentraciones del Eje de acción en cada momento. Los niveles se presentan como media + / - SEM, * p <0,001.
2. Rastros de muestra de las respuestas a 100 DLM Hz de estimulación. Trazo superior muestra las respuestas de los músculos antes de la inyección diputado a la estimulación de la FG en el cerebro. Observe que el músculo es capaz de responder a cada estímulo de uno a uno a 100 Hz. Medio traza muestra las respuestas de la DLM después de la inyección de MLA (0,12 ng / mg). Observe que el músculo no es capaz de responder a cada estímulo de uno a uno a 100 Hz. (Asteriscos). Traza de fondo muestra las respuestas del DLM de la misma preparación (0,12 ng / mg) a la estimulación directa de las neuronas motoras en el tórax. Debido DLM responde uno a uno a 100 Hz con estimulación torácica, la falta de respuestas con estimulaciones cerebrales se puede atribuir a la colinérgica PSI-DLMn conexión.
3. Una representación gráfica de los efectos de diferentes concentraciones de MLA (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg) en la vía GF-TTM. No se observaron efectos significativos entre la solución salina (0 ng / mg) y las inyecciones de compuestos en cualquier punto del tiempo. Un t-test se realizó entre los controles de solución salina (0 ng / mg) y las diferentes concentraciones del Eje de acción en cada momento, * p <0,001.
4. Rastros de muestra de las respuestas a 100 TTM Hz de estimulación. Trazo superior muestra las respuestas del músculo antes de la inyección MLA tras la activación GF con la estimulación en el cerebro. Tenga en cuenta que el músculo es capaz de responder a todos los estímulos a 100 Hz. Medio traza muestra las respuestas de la DLM después de la inyección de MLA (0,12 ng / mg). Las respuestas del músculo MTT a la estimulación del GF en el cerebro siendo uno-a-uno. Traza de fondo muestra las respuestas de la MTT de la misma preparación a la estimulación de 100 Hz de las neuronas motoras en el tórax (0,12 ng / mg).

Discusión

El bioensayo nanoinjection / electrofisiología que aquí se presenta permite una detección rápida de los compuestos en el sistema nervioso de la mosca de la fruta. Esta es una novedosa técnica in vivo que requiere pequeñas cantidades de un compuesto para provocar un efecto sobre una variedad de objetivos moleculares en un circuito bien caracterizado neuronal. Este método puede ser utilizado para probar la bioactividad de compuestos diferentes, de las toxinas desconocidas a agentes farmacológicos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Electrodos de registro de vidrio: vidrio borosilicato capilares	World Precision Instruments	1B100F-4	1.0mm OD, 0.58mm ID
Estimulador	Grass Instruments	Modelo S48
Amplificador	Obtener Instruments Inc.	Modelo 5A
Adquisición de datos del software: Digidata	Molecular Devices	Modelo 1440A
Los datos del software colección: pCLAMP	Molecular Devices	La versión 10
Estereomicroscopio wde fibra óptica ésima microscopio de lámpara anular	AmScope	SM-4T Modelo HL250-AR
La disección de alcance para el montaje	AmScope	SM-2TZ
Manual de Kite Micromanipulador y basculante Base	World Precision Instruments	Modelo # M3301 Kite: Modelo # KITE-M3-L
Drosophila melanogaster Wild 10E genotipo (cepa de tipo salvaje)	Bloomington Stock Center	Foto # 3892
Extractor vertical la pipeta	David Kopf Instruments	Modelo 700C
Micropipetas de inyección de vidrio: vidrio borosilicato capilares	World Precision Instruments	Catálogo # 4878	1.14mm diámetro exterior, 0,5 mm ID
Aceite de silicona	Pescador	Catálogo # S159-500
Biselador	Sutter Instrument Co.	KT Brown Tipo Modelo # BV-10
Nanoliter2000	World Precision Instruments	Catálogo # B203XVY
Colorante azul	McCormick	N / A	Ingredientes: agua, propilenglicol, FD & C Azul 1, y el 0,1% Propilparabeno (conservante).
Methyllycaconitine citrato (MLA)	Bioscience Tocris	Catálogo # 1029
Barras de plástico de cera	Hygenic Corporation (Akron, Ohio, EE.UU.)