Ingeniería de tejidos del intestino en un modelo murino

Erik R. Barthel; Allison L. Speer; Daniel E. Levin; Frédéric G. Sala; Xiaogang Hou; Yasuhiro Torashima; Clarence M. Wigfall; Tracy C. Grikscheit

doi:10.3791/4279

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Resumen

Este artículo y el vídeo de acompañamiento presentar nuestro protocolo para la generación de tejido de ingeniería intestino en el ratón, utilizando un organoide unidades-on-andamio enfoque.

Resumen

De tejido de ingeniería intestino delgado (TESI) ha sido utilizado con éxito para rescatar a ratas Lewis después de la resección masiva del intestino delgado, resultando en retorno a pesos preoperatorios en 40 días. ¹ En los seres humanos, resección masiva del intestino delgado puede resultar en el síndrome del intestino corto, una malabsorción funcional Estado que confiere una significativa morbilidad, mortalidad y costes sanitarios, incluyendo la dependencia de nutrición parenteral, la insuficiencia hepática y cirrosis, y la necesidad de un trasplante de órganos multivisceral. ² En este trabajo se describen y documentan nuestro protocolo para la creación de tejido modificado intestino en un modelo de ratón con un organoide multicelular unidades-on-andamio enfoque. Unidades de organoides son agregados multicelulares derivados del intestino que contienen elementos tanto de la mucosa y mesenquimales, ³ la relación entre el que conserva el nicho de células madre intestinal. ⁴ En la investigación en curso y futuros, la transición de nuestra técnica en laratón permitirá la investigación de los procesos que intervienen durante la formación de TESI mediante la utilización de las herramientas transgénicas disponibles en esta especie. ⁵ La disponibilidad de las cepas de ratón inmunocomprometidos también nos permitirá aplicar la técnica de tejido intestinal humano y optimizar la formación de TESI humana como un de ratón con xenoinjerto antes de su transición a los seres humanos. Nuestro método utiliza buenas prácticas de fabricación (GMP) reactivos y materiales que ya han sido aprobados para su uso en pacientes humanos, y por lo tanto ofrece una ventaja significativa sobre los enfoques que se basan en los tejidos animales descelularizados. El objetivo final de este método es su traducción a los seres humanos como una estrategia de medicina regenerativa terapéutico para el síndrome de intestino corto.

Protocolo

1. Unidades de Preparación organoide

Instrumentos apropiados para la disección del ratón (tijeras y pinzas) debe ser esterilizado por autoclave.
Humanamente sacrificar al ratón donante de acuerdo con los protocolos locales IACUC. Asegúrese de que el animal está muerto antes de continuar.
Hacer una incisión de línea media para tener acceso a la cavidad peritoneal. Los colgajos de piel se puede reflejar como sea necesario para mejorar la exposición.
Eviscerar el intestino delgado y se divide justo distal al ligamento de Treitz. Separe el intestino delgado de su mesenterio utilizando disección roma fuerte y suave. Identificar la unión ileocecal y dividir el intestino delgado 5 mm proximal a este.
Usando tijeras, abrir el intestino longitudinalmente a lo largo del borde antimesentérico en una placa de Petri con 10 ml 4 ° C, la solución salina tamponada estéril de Hanks (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiótico-antimicótico (anti-anti, Invitrogen) solución. Borrar la materia fecal desde el intestino se abrió conagitación suave a continuación, transferir intestino se abrió a un tubo de centrífuga de 15 ml con 10 ml de 4 ° C, HBSS estéril / 1X anti-anti.
Se lava el intestino se abrió tres veces en 10 ml de 4 ° C, 1X HBSS estéril / anti anti-en un tubo de ensayo. Cada lavado se puede realizar con agitación suave del tubo de 15 ml por 30 seg. Después de agitar, el tejido intestinal se hunde hasta el fondo del tubo. Deseche el material flotante, que es basura mesenquimal. Quitar la solución de lavado cuidadosamente con una pipeta.
Picar el intestino lavado en una placa de Petri con 10 ml de 4 ° C, 1X HBSS estéril / anti anti-a menos de piezas de 1 mm cuadrados usando unas tijeras. Reúna el material triturado con una pipeta automática y colocarlo en un tubo de ensayo.
Centrifugar el tubo a 500 rpm durante 8 min. Eliminar el sobrenadante, que contiene grasa y el mesénquima.
Se digiere el material triturado, se lavó con 10 ml de HBSS estéril / 1X anti-anti más 0,125 mg / ml de dispasa (Invitrogen) y 800 unidades / ml colagenasa tipo 1 (Worthington, Lakewood NJ). Para preparar 40 ml de la solución de digestión, pesar 5 mg de dispasa, 142 mg de colagenasa, y añadir HBSS estéril hasta un volumen de 40 ml. Preparar esta solución recién cada unidad de tiempo organoides se preparan, y mantener a 4 º C hasta su utilización. Añadir la solución de digestión directamente a la pastilla del paso 1,8.
Incubar el tubo de ensayo que contiene el material triturado, se lavó con la solución de digestión a 37 ° C durante 20 min.
Recuperar el tubo de ensayo y además perturbar el tejido digerido por trituración con una pipeta de 10 ml. Repita entre 20 a 50 veces hasta una apariencia uniforme.
Centrifugar el tubo de ensayo durante 5 min a 800 rpm. Eliminar el sobrenadante, que contiene las células individuales.
Detener la reacción de digestión con 10 ml de 4 ° C, Modificado de Dulbecco estéril medio Eagle (DMEM, Invitrogen) más 10% v / v inactivado por calor suero fetal bovino (HI-FBS, Invitrogen). Resuspender el pellet y agitar el tubo.
Centrifugar el tubo de ensayo durante 5 min a 800 rpm. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta automática hasta las últimas gotas. Usar una pipeta de plástico desechable para las últimas gotas para evitar resuspendiendo el sedimento.

2. La carga de ácido poliglicólico Andamio

Formar 2-mm de largo, 5-mm andamios diámetro exterior cilíndrico de ácido poliglicólico no tejido (2 mm de espesor de chapa, 60 mg cm-3 densidad, porosidad> 95%, Fibras Concordia, Coventry RI) como se describe en la ref. 4.
Recorte el distal 2 mm de una pipeta de microlitro desechable 1.000 inclinar con tijeras preparadas con 70% de etanol en agua destilada.
Coloque el andamio en una placa de cultivo de 4 pocillos. Cargar las unidades de organoides al andamio con la pipeta de microlitro 1.000, primero en el lumen y, a continuación sobre la superficie exterior. Utilice una pinza para asegurar el revestimiento del lumen. No interrumpir o romper la forma cilíndrica del polímero.

3. Implantación en ratones Host

Utilice un ratón singénico anfitrión en el mismo fondo que el donante si están disponibles. De lo contrario, emplean un diabéticos no obesos inmunocomprometidos / grave inmunodeficiencia combinada o NOD / SCID animal (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
Inducir la anestesia general con isoflurano. Afeitado, preparación y cubrir el abdomen del ratón.
Haga una incisión de 5 mm de la línea media para ganar la entrada a la cavidad peritoneal. Identificar y destripar cuidadosamente el epiplón mayor. Coloque el polímero cargado en el epiplón y se envuelve con el tejido. No rompa el epiplón.
Asegure que el polímero el epiplón con una sutura 5-0 monocryl. Suavemente reemplazar el epiplón con el polímero envuelto en su posición anatómica.
Cierre la incisión abdominal en capas con suturas de vicryl 4-0. Ejecute el cierre del músculo y tener cuidado de no lesionar las vísceras abdominales por debajo de la incisión. Use suturas interrumpidas para la piel.
Administrar analgesia postoperatoria con 2 mg / kg de ketoprofeno (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) en agua estéril como una pápula subcutánea adyacente a la incisión. Los animales deben ser evaluados diariamente y si el animal está demostrando signos de dolor o angustia, una dosis adicional de ketoprofeno puede ser administrado el día después de la operación 2. En el tercer día postoperatorio, el animal debe estar completamente recuperado sin evidencia de dolor o angustia. Si el dolor o molestia persiste en el día 3 después de la operación, se considera anormal y debería ser tratado de acuerdo con los protocolos del IACUC instalaciones y cuidado de los animales.
Permitir el ratón para recuperar y el intestino de tejido de ingeniería crecer durante cuatro semanas. Dar acceso a la ad libitum a los animales roedores chow (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis MO) y el agua con Septra 200 mg / 40 mg por 5 ml (Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) a una dilución 1:100.

4. Cosecha

Humanely sacrificar al animal huésped cuatro semanas después de la implantación.
Vuelva a abrir la incisión original y reflejan la piel cefálica a facilitar el acceso a la cavidad peritoneal.
Abra la capa muscular e identificar el constructo de tejido modificado como un globo de tejido.
Tome las adherencias a la construcción de las vísceras intraabdominales mediante disección cortante.
Fijar el constructo en formalina para posterior parafina montaje o el uso del tejido fresco para ensayos bioquímicos tales como la PCR en tiempo real o aislamiento de las proteínas.