小鼠模型肠组织工程

Erik R. Barthel; Allison L. Speer; Daniel E. Levin; Frédéric G. Sala; Xiaogang Hou; Yasuhiro Torashima; Clarence M. Wigfall; Tracy C. Grikscheit

doi:10.3791/4279

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摘要
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摘要

本文及随附视频我们的协议，用于生成在小鼠小肠组织工程，使用类器官单位支架的方法。

摘要

组织工程化小肠（TESI）已经成功地被用于拯救Lewis大鼠大量小肠切除后，在40天内恢复到术前的权重^。1在人类中，大量小肠切除会导致短肠综合征，功能性吸收不良国家赋予重大的发病率，死亡率和医疗费用，包括肠外营养的依赖，肝功能衰竭和肝硬化，需要multivisceral器官移植。本文中，我们描述和记录我们的协议在小鼠模型中创建组织工程小肠一个多细胞类器官单位支架的方法。类器官单位是多细胞聚集来自肠道粘膜与间充质元素，包含³之间的关系，保留了肠道干细胞小生境。在目前和未来的研究中，我们的技术过渡到的鼠标将允许利用转基因工具，可以在这个物种在TESI形成的过程进行调查^。5免疫功能低下小鼠品系的可用性也将允许我们应用该技术对人体肠道组织和优化形成的人TESI作为小鼠异种移植前的过渡到人类。我们的方法，采用良好生产规范（GMP）试剂和材料已经被批准用于人类患者，因此提供了一个重要的方法，依赖于脱细胞动物组织的优势。这种方法的最终目标是将其翻译给人类作为再生医学的短肠综合征的治疗策略。

研究方案

1。类器官单位准备

仪器适用于鼠标清扫术（剪刀和镊子）应通过高压灭菌器灭菌。
人道安乐死的供体小鼠根据当地IACUC协议。确保该动物是死的，然后再继续。
车型中线切口进入腹膜腔。皮瓣可以反映需要改进的曝光。
剔骨的小肠和Treitz韧带远端分。分离小肠从肠系膜使用锋利和温和的钝性分离。确定回盲部和分裂小肠5毫米近端。
使用剪刀，打开肠道纵向沿antimesenteric边界在培养皿用10毫升4°C，无菌的Hanks缓冲盐溶液（HBSS，Invitrogen公司，卡尔斯巴德CA）/ 1X抗生素抗真菌（抗反，Invitrogen公司）的解决方案。从打开的肠道清除排泄物温和搅拌，然后打开小肠转移到15ml离心管中，用10毫升的4℃下，无菌HBSS / 1X防反。
打开肠洗净三次，在10毫升的4℃下，无菌HBSS / 1X在试管中的抗 - 抗。每次洗涤可以进行轻度的15毫升的试管摇动30秒。振荡后，在肠道组织下沉到试管底部。丢弃浮的材料，它是间充质碎片。将洗涤液仔细吸管。
鱼糜培养皿中洗涤过的小肠用10ml 4℃，无菌HBSS / 1X抗 - 抗小于1毫米见方的小块，用一个剪刀。收集碎的材料与一个自动移液管，将其放置到试管中。
8分钟，在500rpm离心管。丢弃上清，它含有的脂肪和间充质。
消化剁碎，洗涤后的物质用10ml无菌HBSS / 1X防反加0.125毫克/毫升分散酶（Invitrogen公司）和800单位/米L胶原酶1型（沃辛顿，新泽西州莱克伍德）。为了制备40毫升的消化溶液，称出分散酶，胶原酶142毫克的5毫克，并添加无菌HBSS中高达40毫升的体积。准备新鲜每次类器官单位准备的解决方案，并保持在4°C，直到准备使用。从步骤1.8添加的消化溶液直接沉淀。
孵育试管含有碎消化溶液在37℃下20分钟，洗涤后的物质。
检索试管中，并进一步扰乱消化的组织与10毫升移液管研制。重复20〜50次之间，直到得到均匀的外观。
离心试管中，以800rpm的转速进行5分钟。弃上清，其中包含单个细胞。
停止4°C，无菌Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，Invitrogen）中加10％体积/体积的热灭活的胎儿牛血清（HI-FBS，Invitrogen公司）用10毫升的消化反应。重悬PELLEt和动摇管。
离心试管中，以800rpm的转速进行5分钟。仔细取出上清液，用自动移液管，直到最后几滴。最后几滴使用一次性塑料移液管，以避免再悬浮的颗粒。

2。载入聚羟基乙酸支架

表格2毫米长，5毫米外径圆柱支架从非织造布聚乙二醇酸（板材厚度2毫米，60毫克CM-3容重，孔隙率> 95％，康考迪亚纤维，考文垂RI）参考文献。 4。
修剪用70％乙醇在蒸馏水中制备用剪刀一次性1000微升的移液管尖端的前端2毫米。
成4 - 孔培养板中，将支架。装入类器官的单位上的支架与1000微升的移液管，第一入管腔，然后到的外表面。使用的钳子，以确保涂层的管腔。不要破坏或破开的圆柱形状的聚合物。

3。植入主机鼠标

使用同系主机鼠标，在相同的背景下，如果有捐助。否则，采用免疫功能低下的非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷或NOD / SCID动物（杰克逊实验室，萨克拉门托CA）。
异氟醚诱导全身麻醉。剃须，准备和悬垂鼠标的腹部。
使一个5毫米的正中切口，获取入口至腹膜腔。仔细剔骨的大网膜。将加载到大网膜和聚合物包装与组织。不要撕大网膜。
用5-0 monocryl缝合固定聚合物网膜。轻轻地更换网膜包裹的聚合物进入它的解剖位置。
关闭腹壁切口用4-0薇乔缝线层。执行封的肌肉和照顾，不损害以下的切口腹腔脏器。使用间断缝合皮肤。
管理术后镇痛2毫克/千克酮洛芬（Ketofen，Fort Dodge动物保健），在无菌水作为相邻切口皮下水疱。动物应每天进行评价，如果动物展示疼痛或痛苦的迹象，一个额外剂量的酮洛芬，可以在手术后第2天给药。术后第3天，应完全康复的动物，没有证据的疼痛或痛苦。如果疼痛或痛苦继续在手术后第3天，这被认为是不正常的和应该在的的IACUC和动物保健设施协议。
允许鼠标休养，组织工程小肠生长四周。给动物自由采食啮齿动物的食物（实验室的饮食营养，5001，PMI圣路易斯MO）和水Septra 200毫克/ 40毫克每毫升（5高科医药品，鬼哭神嚎NY）在1:100稀释。

4。收成

呼玛植入4周后，nely安乐死的宿主动物。
重新打开原切口，并反映在皮肤头侧，以方便到腹腔。
打开的肌肉层，并确定组织工程作为一个全球组织结构。
以粘连，腹腔脏器的结构，使用的是锋利的解剖。
固定结构在福尔马林后石蜡安装的，或用新鲜的实时PCR或分离蛋白等生化分析的组织。