L&#39;ingegneria dei tessuti del colon in un modello murino

Erik R. Barthel; Allison L. Speer; Daniel E. Levin; Frédéric G. Sala; Xiaogang Hou; Yasuhiro Torashima; Clarence M. Wigfall; Tracy C. Grikscheit

doi:10.3791/4279

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Riepilogo
Abstract
Protocollo
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Materiali
Riferimenti
Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo e il video di accompagnamento presentare il nostro protocollo per la generazione di tessuto ingegnerizzato intestino nel topo, utilizzando un organoid unità-on-scaffold approccio.

Abstract

Dell'ingegneria tissutale piccolo intestino (TESI) è stato utilizzato con successo per salvare i ratti Lewis dopo massiccia resezione dell'intestino tenue, con conseguente ritorno al peso pre-operatorie entro 40 giorni. ^{1 negli esseri} umani, massiccia resezione del piccolo intestino può causare sindrome da intestino corto, un malassorbimento funzionale stato che conferisce una significativa morbidità, mortalità e costi sanitari tra cui la dipendenza nutrizione parenterale, insufficienza epatica e cirrosi, e la necessità di trapianti di organi multiviscerale. ² In questo lavoro si descrivono e documentano il nostro protocollo per la creazione di tessuti ingegnerizzati intestino in un modello murino con una unità multicellulare organoid-on-scaffold approccio. Unità Organoid sono aggregati multicellulari derivanti dall'intestino che contengono elementi sia delle mucose e mesenchimali, ³ il rapporto tra che conserva l'intestinale nicchia delle cellule staminali. ⁴ Nella ricerca in corso e future, la transizione della nostra tecnica nelladel mouse consentirà di indagine dei processi che intervengono durante la formazione TESI utilizzando gli strumenti disponibili transgeniche in questa specie. ⁵ La disponibilità di ceppi di topi immunocompromessi inoltre ci permette di applicare la tecnica di tessuto intestinale umano e ottimizzare la formazione di TESI umana come xenotrapianto del mouse prima della sua transizione verso gli esseri umani. Il nostro metodo utilizza le buone prassi di fabbricazione (GMP) reagenti e materiali che sono già stati approvati per l'uso in pazienti umani, e offre quindi un vantaggio significativo rispetto agli approcci che si basano su tessuti animali decellularizzato. L'obiettivo finale di questo metodo è la sua traduzione per gli esseri umani come una strategia di medicina rigenerativa terapeutico per la sindrome dell'intestino corto.

Protocollo

1. Organoid unità di preparazione

Strumenti adeguati per la dissezione del mouse (forbici e pinze) devono essere sterilizzati in autoclave.
Umanamente eutanasia il mouse donatore secondo protocolli locali IACUC. Assicurarsi che l'animale è morto prima di procedere.
Fare una incisione mediana per accedere alla cavità peritoneale. Lembi cutanei può essere riflessa come necessario per migliorare l'esposizione.
Sventrare il piccolo intestino e dividerlo appena distalmente al legamento di Treitz. Separare il piccolo intestino dal suo mesentere con tagliente e dolce smussa. Identificare la giunzione ileocecale e dividere il piccolo intestino 5 millimetri prossimale a questo.
Con forbici, aprire l'intestino longitudinalmente lungo il confine antimesenterico in una piastra di Petri con 10 ml 4 ° C, soluzione salina tamponata sterile Hanks '(HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiotico-antimicotico (Anti-Anti, Invitrogen) soluzione. Cancella materia fecale dall'intestino aperto conagitazione poi trasferimento intestino aperto un tubo da centrifuga 15 ml con 10 ml di 4 ° C, sterili HBSS / 1X anti-anti.
Lavare l'intestino aperto tre volte in 10 ml di 4 ° C, HBSS 1X sterile / anti-anti in una provetta. Ogni lavaggio può essere eseguito con lieve agitazione del tubo 15 ml per 30 sec. Dopo agitazione, il tessuto intestinale scende sul fondo della provetta. Eliminare materiale galleggiante, che è detriti mesenchimale. Rimuovere la soluzione di lavaggio accuratamente con una pipetta.
Tritare l'intestino lavato in una piastra di Petri con 10 ml di 4 ° C, HBSS 1X sterile / anti-anti a meno di 1 millimetro pezzi quadrati utilizzando un paio di forbici. Raccogliere il materiale tritato con una pipetta automatica e metterla in una provetta.
Centrifugare la provetta a 500 rpm per 8 min. Eliminare il supernatante, che contiene grassi e mesenchima.
Digerire il tritato, materiale lavato con 10 ml di HBSS sterili / 1X anti-anti + 0,125 mg / ml dispasi (Invitrogen) e 800 unità / ml collagenasi di tipo 1 (Worthington, Lakewood NJ). Per preparare 40 ml della soluzione di digestione, pesare 5 mg di dispasi, 142 mg di collagenasi, e aggiungere HBSS sterili fino ad un volume di 40 ml. Preparare questa soluzione fresca ogni unità di tempo organoid sono preparati, e mantenere a 4 ° C fino al momento dell'uso. Aggiungere la soluzione digestione direttamente al pellet dal passo 1,8.
Incubare la provetta contenente il macinato, materiale lavato con la soluzione di digestione a 37 ° C per 20 min.
Recuperare la provetta e in seguito a distruggere il tessuto digerito da triturazione con una pipetta 10 ml. Ripetere tra 20 fino a 50 volte un aspetto uniforme.
Centrifugare la provetta per 5 min a 800 rpm. Eliminare il supernatante, che contiene le cellule singole.
Arrestare la reazione di digestione con 10 ml di 4 ° C, sterile Eagle modificato da Dulbecco (DMEM, Invitrogen) più 10% v / v di calore-siero fetale bovino inattivato (HI-FBS, Invitrogen). Risospendere la pellet e agitare la provetta.
Centrifugare la provetta per 5 min a 800 rpm. Rimuovere il surnatante con cura con una pipetta automatica fino a quando le ultime gocce. Utilizzare una pipetta di plastica monouso per le ultime gocce per evitare di risospensione del pellet.

2. Caricamento di acido poliglicolico impalcatura

Formare 2-mm, 5 mm di diametro scaffold cilindriche esterne di acido poliglicolico non tessuto (2 mm di spessore, 60 mg cm-3 densità apparente, la porosità> 95%, Fibre Concordia, RI Coventry) come descritto nel rif. 4.
Tagliare il distale 2 mm di una usa e getta 1000 pipetta microlitro punta con le forbici preparati con etanolo al 70% in acqua distillata.
Posizionare il patibolo in un 4-pozzetti cultura. Caricare le unità organoid sull'impalcatura con la pipetta 1000 microlitri, prima nel lume e quindi sulla superficie esterna. Utilizzare una pinza per garantire rivestimento del lume. Non disturbare o rompere la forma cilindrica del polimero.

3. L'impianto in mouse Host

Utilizzare un mouse singenici host lo stesso sfondo del donatore, se disponibile. In caso contrario, impiegano un diabetico non obesi immunocompromessi / immunodeficienza combinata grave o NOD / SCID animale (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
Indurre l'anestesia generale con isoflurano. Shave, preparazione ed attaccare l'addome del mouse.
Eseguire un'incisione 5 millimetri linea mediana per guadagnare l'accesso alla cavità peritoneale. Identificare e sviscerare con attenzione l'omento maggiore. Posizionare il polimero caricato sulla omento e avvolgerlo con il tessuto. Non strappare l'omento.
Fissare il polimero all'omento con una sutura 5-0 monocryl. Delicatamente sostituire il omento con il polimero avvolto nella sua posizione anatomica.
Chiudere l'incisione addominale a strati con 4-0 punti di sutura Vicryl. Eseguire la chiusura dei muscoli e fare attenzione a non danneggiare i visceri addominali sotto l'incisione. Utilizzare punti staccati per la pelle.
Somministrare analgesia postoperatoria con 2 mg / kg di ketoprofene (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) in acqua sterile come un pomfo sottocutanea adiacente alla incisione. Gli animali devono essere valutati tutti i giorni e se l'animale sta dimostrando segni di dolore o disagio, una dose supplementare di ketoprofene può essere somministrato il giorno post operatorio 2. Il terzo giorno post-operatorio, l'animale deve essere totalmente recuperato senza evidenza di dolore o disagio. Se il dolore o angoscia continua il giorno post operatorio 3, questo è considerato anormale e dovrebbe essere affrontata in conformità con i protocolli di cura IACUC e animale degli impianti.
Lasciare il mouse per recuperare e il tessuto-ingegnerizzato intestino a crescere per quattro settimane. Dare l'annuncio accesso animale libitum nei roditori chow (Lab Dieta 5001, PMI nutrizione, St. Louis MO) e acqua con Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml (Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) alla diluizione 1:100.

4. Raccolto

HumaNely eutanasia l'animale ospite quattro settimane dopo l'impianto.
Riaprire l'incisione originale e riflettere la pelle cranialmente per facilitare l'accesso alla cavità peritoneale.
Aprite il livello muscolare e di identificare il tessuto ingegnerizzato costrutto come un globo di tessuto.
Abbattere adesioni al costrutto da intra-addominale con visceri dissezione netta.
Fissare il costrutto in formalina per paraffina dopo il montaggio, oppure utilizzare il tessuto fresco per saggi biochimici come real-time PCR o isolamento delle proteine.