Tissue Engineering des Darms in einem Mausmodell

Erik R. Barthel; Allison L. Speer; Daniel E. Levin; Frédéric G. Sala; Xiaogang Hou; Yasuhiro Torashima; Clarence M. Wigfall; Tracy C. Grikscheit

doi:10.3791/4279

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In diesem Artikel

Zusammenfassung
Zusammenfassung
Protokoll
Ergebnisse
Diskussion
Offenlegungen
Danksagungen
Materialien
Referenzen
Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel und das dazugehörige Video präsentieren unser Protokoll zur Erzeugung von Tissue-Engineering-Darm der Maus, mit einem organoiden Einheiten-on-Gerüst Ansatz.

Zusammenfassung

Tissue-Engineering Dünndarm (TESI) erfolgreich verwendet worden, um Lewis Ratten nach massiven Dünndarmresektion zu retten, was im Gegenzug die präoperative Gewichte innerhalb von 40 Tagen. ¹ Bei Menschen, massive Dünndarmresektion in Kurzdarmsyndrom, eine funktionelle malabsorptive führen Staat, der erheblichen Morbidität, Mortalität und Kosten im Gesundheitswesen einschließlich der parenteralen Ernährung abhängig, Leberversagen und Zirrhose, und die Notwendigkeit für multiviszerale Organtransplantation. ² In diesem Papier verleiht, beschreiben und dokumentieren wir unser Protokoll für die Erstellung von Tissue-Engineering-Darm in einem Mausmodell mit einem vielzelligen organoide Einheiten-on-Gerüst Ansatz. Organoiden Einheiten sind mehrzellige Aggregate aus dem Darm abgeleitet, die sowohl mukosale und mesenchymalen Elemente enthalten, ³ die Beziehung zwischen denen die intestinale Stammzellnische bewahrt. ⁴ In laufende und zukünftige Forschung, der Übergang der Technik in derMaus zur Untersuchung der Vorgänge während TESI Bildung durch die Nutzung der transgenen Instrumenten in dieser Art beteiligt zu erlauben. ⁵ Die Verfügbarkeit von immungeschwächten Mausstämmen auch erlauben uns, die Technik für die menschliche Darmgewebe anwenden und optimieren die Bildung des menschlichen TESI als Maus-Xenograft vor dessen Übergang in den Menschen. Unsere Methode beschäftigt Good Manufacturing Practice (GMP)-Reagenzien und Materialien, die bereits für die Verwendung bei menschlichen Patienten zugelassen wurden, und bietet somit einen deutlichen Vorteil gegenüber Ansätzen, die auf dezellularisierten tierischen Geweben verlassen. Das ultimative Ziel dieser Methode ist die Übersetzung für den Menschen als regenerative Medizin therapeutische Strategie für Kurzdarmsyndrom.

Protokoll

Ein. Organoid Units Vorbereitung

Instrumente geeignet für Maus Dissektion (Schere und Pinzette) sollte im Autoklaven sterilisiert werden.
Menschlich einschläfern den Spender Maus nach lokalen IACUC Protokolle. Stellen Sie sicher, dass das Tier tot ist, bevor Sie fortfahren.
Einen Mittellinieneinschnitt um Zugang zu dem Peritonealraum gewinnen. Hautlappen können reflektiert je nach Bedarf, um die Exposition zu verbessern.
Ausweiden des Dünndarms und teilen sie knapp distal des Lig. Treitz. Trennen Sie den Dünndarm von seinem Mesenterium mit scharfen und sanften stumpf. Identifizieren Sie die ileocecal Kreuzung und unterteilen den Dünndarm 5 mm proximal dazu.
Mit Schere, öffnen Sie den Darm längs der Kraterbildung Grenze in einer Petrischale mit 10 ml 4 ° C, sterile Hanks 'Salzlösung (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X Antibiotika-Antimykotika (Anti-Anti, Invitrogen) Lösung. Löschen Fäkalien aus dem geöffneten Darm mitvorsichtiges Schütteln dann übertragen eröffnet Darm zu einem 15ml Zentrifugenröhrchen mit 10 ml 4 ° C, sterile HBSS / 1X Anti-Anti.
Waschen Sie die geöffneten Darm dreimal in 10 ml 4 ° C, sterile HBSS / 1X anti-anti in einem Reagenzglas. Jede Wäsche kann mit mildem Schütteln der 15 ml Tube für 30 sec durchgeführt werden. Nach Schütteln, sinkt das Darmgewebe dem Boden des Röhrchens. Entsorgen schwimmenden Material, das mesenchymalen Fremdkörpern ist. Entfernen Sie die Waschlösung vorsichtig mit einer Pipette.
Mince des gewaschenen Darm in einer Petrischale mit 10 ml 4 ° C, sterile HBSS / 1X anti-anti auf weniger als 1 mm quadratische Stücke mit einer Schere. Sammeln Sie die gehackte Material mit einer automatischen Pipette und legen Sie sie in ein Reagenzglas.
Zentrifugieren bei 500 Upm für 8 min. Überstand verwerfen, die Fett-und Bindegewebes enthält.
Verdauen zerkleinertem, gewaschenem Material mit 10 ml sterilem HBSS / 1X anti-anti plus 0,125 mg / ml Dispase (Invitrogen) und 800 Einheiten / ml Collagenase Typ 1 (Worthington, Lakewood NJ). Bis 40 ml der Aufschlusslösung vorzubereiten, abwiegen 5 mg Dispase, 142 mg Kollagenase, und fügen Sie sterile HBSS bis zu einem Volumen von 40 ml. Diese Lösung jeweils frisch organoide Einheiten vorbereitet sind, und halten bei 4 ° C bis zum Gebrauch. Fügen Sie die Aufschlusslösung direkt an den Pellet aus Schritt 1.8.
Inkubieren der Test-Röhrchen mit dem zerkleinerten, gewaschenen Materials mit der Aufschlußlösung bei 37 ° C für 20 min.
Rufen Sie das Reagenzglas und weiter stören die verdaute Gewebe durch Verreiben mit einer 10 ml Pipette. Wiederholen zwischen 20 bis 50 mal, bis ein einheitliches Erscheinungsbild entsteht.
Zentrifuge das Reagenzglas 5 min bei 800 UpM. Überstand verwerfen, die einzelne Zellen enthält.
Stoppen des Verdaureaktion mit 10 ml 4 ° C, steril Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM, Invitrogen) plus 10% v / v hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS HALLO-, Invitrogen). Resuspendieren pellet und schütteln Sie die Röhre.
Zentrifuge das Reagenzglas 5 min bei 800 UpM. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer automatischen Pipette bis zu den letzten paar Tropfen. Verwenden Sie eine Einweg-Kunststoff-Pipette für den letzten Tropfen zu vermeiden Resuspendieren des Pellets.

2. Laden von Polyglykolsäure Scaffold

Form 2-mm lang, 5-mm Außendurchmesser zylindrischen Gerüste aus Vlies Polyglykolsäure (2-mm Blechdicke, 60 mg cm-3 Schüttdichte; Porosität> 95%, Concordia Fibers, Coventry RI) wie in Lit. beschrieben. 4.
Schneiden Sie die distalen 2 mm eines Einweg 1.000 Mikroliter Pipette mit einer Schere mit 70% Ethanol in destilliertem Wasser zubereitet kippen.
Legen Sie das Gerüst in ein 4-Loch-Kulturplatte. Laden der organoiden Einheiten auf das Stützgerüst mit der 1000 Mikroliter-Pipette, zuerst in das Lumen und dann auf die äußere Oberfläche. Verwenden Sie eine Pinzette Beschichtung des Lumen zu gewährleisten. Nicht stören oder Aufbrechen der zylindrischen Form des Polymers.

3. Implantation in Wirt Maus

Verwenden Sie einen syngenen Host Maus auf dem gleichen Hintergrund wie der Spender, falls verfügbar. Ansonsten beschäftigen einen immungeschwächten nonobese diabetischen / schwere kombinierte Immunschwäche oder NOD / SCID Tier (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
Erbrechen Vollnarkose mit Isofluran. Rasur, prep und drapieren der Maus den Bauch.
Eine 5 mm Mittellinieneinschnitt zum Eingang in die Bauchhöhle zu gewinnen. Identifizieren und sorgfältig ausweiden das Omentum. Setzen Sie den geladenen Polymers auf das Omentum und wickeln Sie es mit dem Gewebe. Nicht reißen die Omentum.
Sichern Sie das Polymer auf die Omentum mit einem 5-0 Monocryl Naht. Gently ersetzen Omentum mit dem gewickelt Polymer in seine anatomische Position.
Schließen Sie den Bauchschnitt in Schichten mit 4-0 Vicryl Nähte. Führen Sie den Muskel-Verschluss und kümmern sich nicht um die Bauchorgane unterhalb des Einschnitts zu verletzen. Verwenden Knopfnähte für die Haut.
Verwalten postoperative Analgesie mit 2 mg / kg Ketoprofen (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) in sterilem Wasser als subkutane Quaddel neben dem Einschnitt. Die Tiere sollten täglich ausgewertet werden, und wenn das Tier zeigt Anzeichen von Schmerzen oder Leiden, eine zusätzliche Dosis von Ketoprofen können auf postoperativen Tag 2 verabreicht werden. Mit dem dritten postoperativen Tag, sollte das Tier komplett ohne Anzeichen von Schmerzen oder Leiden wiederhergestellt werden. Wenn Schmerzen oder Leiden weiter auf postoperativen Tag 3, wird dies als abnormal und sollte in Übereinstimmung mit den IACUC und Tier Betreuungseinrichtung Protokollen angesprochen werden.
Lassen Sie die Maustaste zu erholen und das Tissue-Engineering-Darm für vier Wochen wachsen. Geben Sie das Tier ad libitum Zugang zu Nagetierfutter (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis MO) und Wasser mit Septra 200 mg / 40 mg pro 5 ml (Hallo-Tech Pharmacal, Amityville NY) bei einer Verdünnung von 1:100.

4. Ernte

Humanely euthanize das Wirtstier vier Wochen nach der Implantation.
Erneuten Öffnen der ursprünglichen Einschnitt und spiegeln die Haut kopfwärts Zugang zur Bauchhöhle erleichtern.
Öffnen Sie die Muskulatur und Identifizierung der Tissue-Engineering-Konstrukt als eine Kugel von Gewebe.
Nehmen Sie sich Verwachsungen der Konstrukt aus intraabdominellen Eingeweide mit scharfen Dissektion.
Befestigen Sie das Konstrukt in Formalin für spätere Paraffin Montage oder Verwendung das Gewebe frisch biochemischen Assays wie real-time PCR-oder Protein-Isolation.