Visualización de las bacterias en los nematodos mediante microscopía de fluorescencia

Resumen

Para estudiar el mutualismo entre Xenorhabdus Bacterias y Steinernema, se han desarrollado métodos para monitorizar la presencia bacteriana y la ubicación dentro de los nematodos. El enfoque experimental, que se puede aplicar a otros sistemas, implica bacterias de ingeniería para expresar la proteína verde fluorescente y la visualización, utilizando bacterias de microscopía de fluorescencia dentro del nematodo transparente.

Resumen

Simbiosis, la convivencia de dos o más organismos, se han generalizado en todos los reinos de la vida. Como dos de los organismos más ubicuos en la tierra, nematodos y bacterias formar una amplia variedad de asociaciones simbióticas que van desde beneficioso para patógena ^1-3. Una de estas asociaciones es la relación de beneficio mutuo entre las bacterias y nematodos Steinernema Xenorhabdus, que ha surgido como un sistema modelo de simbiosis ^4. Nematodos entomopatógenos Steinernema son, con su simbionte bacteriano para matar insectos ^5. Para la transmisión entre huéspedes de insectos, las bacterias colonizan el intestino de la etapa del nemátodo infectivo juvenil ^6-8. Recientemente, varias otras especies de nematodos se ha demostrado que las bacterias utilizan para matar insectos ^9-13, y las investigaciones han comenzado a examinar las interacciones entre los nematodos y bacterias en estos sistemas <sup> 9.

Se describe un método para la visualización de un simbionte bacteriano dentro de o en un host nematodo, tomando ventaja de la transparencia óptica de los nematodos cuando se vieron por microscopía. Las bacterias se han diseñado para expresar una proteína fluorescente, lo que permite su visualización por microscopía de fluorescencia. Se dispone de muchos plásmidos que llevan los genes que codifican proteínas que presentan fluorescencia a longitudes de onda diferentes (es decir, verde o rojo), y la conjugación de los plásmidos procedentes de una cepa de Escherichia coli donante en un receptor simbionte bacteriano tiene éxito para una amplia gama de bacterias. Los métodos descritos se han desarrollado para investigar la asociación entre Steinernema carpocapsae y Xenorhabdus nematophila ^14. Métodos similares se han utilizado para investigar otros bacteria nematodos asociaciones ^{9, 15-18} y por lo tanto, el enfoque es en general aplicable.

El METhod permite la caracterización de la presencia bacteriana y la localización dentro de los nematodos en diferentes etapas de desarrollo, y proporciona información sobre la naturaleza de la asociación y el proceso de colonización ^{14, 16, 19.} El análisis microscópico revela tanto la frecuencia de colonización dentro de una población y la localización de las bacterias a los tejidos del huésped ^{14, 16, 19-21.} Esto es una ventaja sobre otros métodos de seguimiento de las bacterias dentro de las poblaciones de nematodos, tales como sonicación ²² o molienda ^23, que puede proporcionar los niveles medios de la colonización, pero no puede, por ejemplo, discriminar poblaciones con una alta frecuencia de bajas cargas simbiontes de poblaciones con una baja frecuencia de las cargas simbiontes altas. La discriminación de la frecuencia y de la carga de bacterias colonizadoras puede ser especialmente importante en el cribado o la caracterización de mutantes bacterianos para fenotipos colonización ^{21, 24.} En efecto, la microscopía de fluorescencia se ha utilizado en el cribado de alto rendimiento de mutantes bacterianos de los defectos de colonización ^{17, 18,} ​​y es menos laborioso que otros métodos, incluyendo la sonicación ^{22, 25-27} y disección nematodos individuales ^{28, 29.}

Protocolo

1. Construcción de una cepa bacteriana fluorescente mediante conjugación

1. Crece la cepa receptora (simbionte para ser examinadas) y la cepa donante durante la noche. La cepa donante, generalmente Escherichia coli, debe ser capaz de donar ADN a través de la conjugación y deben transformarse con un. Plásmido (Tabla 2) que lleva un gen que codifica una proteína fluorescente Dependiendo del plásmido, una cepa auxiliar conjugación también puede ser necesaria. Si es así, esta cepa también se cultivaron durante la noche. La cepa donante y la tensión auxiliar debería ser cultivadas con antibióticos para seleccionar para el mantenimiento del plásmido.
2. Subcultivar el donante, ayudante, y cepas receptoras en nutrientes ricos en medios de cultivo que carecen de antibióticos en una proporción de 1:100 de la cultura al medio.
3. Crecer los cultivos a la temperatura apropiada para cada cepa hasta que llegan a mediados de registro de la etapa de crecimiento (OD ₆₀₀ ~ 0,6). Para Xenorhabdus y E. coli esta etapa de crecimientoth se alcanza aproximadamente de 3 a 4 horas después de subcultivo. Esto puede variar dependiendo de la cepa, o en algunos casos el plásmido utilizado,.
4. Mezclar las cepas en un tubo de microcentrífuga y se centrifuga durante 2 min a 17.900 xg (13.000 rpm en la mayoría de microfuges). La proporción de donante y el receptor que produce los mejores resultados pueden variar para diferentes combinaciones, y pueden tener que ser determinado empíricamente. Para que un destinatario Xenorhabdus y E. donante coli, se utiliza un ratio de 3:1 o 1:1. Si una cepa auxiliar que se necesita (por ejemplo, E. coli), se debe añadir en la misma proporción que el donante.
5. Decantar el sobrenadante.
6. Se resuspende el sedimento celular en 30 l de medio fresco.
7. Detectar la suspensión en un plato nutritivo multimedia sin ningún tipo de antibióticos, y permitir que la mancha se seque.
8. Incubar la placa, invertida, durante la noche a una temperatura óptima para la bacteria receptora y permisible para el donante (y ayudante, si es aplicable). La placa deberíase incubaron al menos 18 h.
9. Raspar el punto y raya de colonias individuales en una placa antibiótico selectivo. Los antibióticos se deben seleccionar contra el donante y para el receptor que contiene el plásmido. Uno o dos rayas adicionales de aislamiento puede ser necesario aislar un cultivo puro.
10. Asegúrese de que las colonias resultantes son el simbionte receptor, y no la cepa donante, por la detección de la presencia de receptores fenotipos específicos, tales como morfología de la colonia, o reacción en cadena de polimerasa detección de genes específicos-receptor. Cribar las colonias para la presencia del plásmido mediante la reacción en cadena de polimerasa de una secuencia conocida plásmido y fluorescencia. Las colonias deben fluorescencia bajo la longitud de onda correcta correspondiente a la proteína fluorescente.

2. La producción de huevos de nematodos axénicos

1. Crecer 5 ml del simbionte bacteriano natural durante la noche. Para iniciar un cultivo, las bacterias pueden ser inoculadas en Lisogenia Broth (LB) o Cu otrasmedios de comunicación lture directamente de una acción o de un congelador de placa racha.
2. Corre 600 l del cultivo bacteriano en 10 mm de lípidos Agar (LA) placas ^29. De ocho a diez placas dará nematodos suficientes para la mayoría de las especies.
3. Incubar en la oscuridad sin humedad a 25 ° C durante dos días.
4. Añadir 5.000 nematodos infectivos juveniles, u otras etapas en función del nematodo se utiliza, en 500 l de medios de comunicación a los céspedes bacterianos. Incubar las placas a 25 ° C durante 3 días.
5. Revise sus placas para determinar la presencia de nematodos adultos y huevos. Colocar 20 l de agua en un portaobjetos de microscopio. Usando un palillo estéril rascado-up una pequeña cantidad de nematodos desde el césped bacteriano. Coloque la barra en el agua y permitir que los nematodos a nadar fuera. Mira a tu diapositiva con una lupa bajo. Para obtener más información sobre la aparición ver la discusión y la Figura 2.
6. Si los huevos y las hembras son visibles, continuar, de lo contrario, incubar las placas a 25 & dpor ejemplo, C y comprobar para el desarrollo adecuado cada hora 6-12. Cuando las hembras contienen huevos, colocar unos pocos ml de agua en la superficie de las placas. Agite suavemente las placas y vierta el agua en un tubo cónico de 50 ml. Los nematodos debe salir de las placas y ya no será visible en la superficie de la placa. Varios enjuagues puede ser necesario.
7. Permitir que los nematodos se depositen en el fondo del tubo.
8. Enjuague nematodos. Pipetear el exceso de agua desde la parte superior del tubo. Vuelva a llenar con agua limpia y dejar nematodos adultos se asiente. Pipetear el exceso de agua.
9. Llenar los tubos cónicos con solución de huevo. Una vez que la solución de huevo se añade la sincronización de todos los pasos con solución huevo debe continuar exactamente como se describe para el rendimiento máximo de huevo. Incubar los tubos mientras agitando suavemente durante exactamente 10 min. La mayoría de los nematodos debe ser disuelto por el final de la incubación.
10. Inmediatamente centrifugue los tubos cónicos a 1250 xg durante exactamente 10 minutos (esto incluye traer la centrífuga a la velocidadpero no a 0 x g. Utilice el freno).
11. Inmediatamente decantar el sobrenadante.
12. Inmediatamente vuelva a suspender el pellet con solución huevo al vaso.
13. Inmediatamente llenar tubo cónico con una solución de huevo y mezclar bien mediante la inversión de 3-5 veces. Inmediatamente después, girar como en 2.10.
14. Inmediatamente decantar el sobrenadante.
15. Se resuspende el precipitado en LB pipeteando, transferir a un tubo cónico de 15 ml por granulación mejorada durante los pasos de lavado. LB es estándar para Steinernema spp. Otros tampones (por ejemplo, un medio mínimo de sales) se pueden utilizar dependiendo de la bacteria y nematodos, teniendo en cuenta el tampón no debe dañar ya sea el nematodo o bacteria.
16. Llenar el tubo con LB y vuelta como en 2.10.
17. Decantar el sobrenadante y volver a suspender en LB.
18. Enjuagar los nematodos un total de 3 veces mediante la repetición de 2,14 y 2,15.
19. Diluir los huevos de nematodo re-suspendido a un volumen apropiado. Debe haber al menos 10 huevos por microlitro. Por ejemplo:gs se pueden almacenar en un plato de Petri de 6 cm en 5 ml de LB durante al menos cuatro días mediante la adición de antibióticos que inhiben el crecimiento de bacterias colonizadoras y envolver la placa en parafilm. Los huevos deben ser lavados una vez en 15 ml de LB (como en 2,13 y 2,14) antes de inocular en los céspedes bacterianos. Tenga en cuenta que los huevos se incuban durante este tiempo y no se pueden sincronizar de desarrollo cuando se utiliza en ensayos de colonización.

3. Co-cultivo de ensayo con bacterias fluorescentes

1. Crecer bacterias fluorescentes durante la noche, la selección para el plásmido si es necesario.
2. Corre 600 l del cultivo bacteriano en placas de agar 10 mm de lípidos con un palillo estéril. Incubar a 25 ° C durante 2 días.
3. Place 500-5.000 huevos de nematodos axénicos en un total de 100 a 400 l (óptimamente 2.000 nematodos en 200 l) a cada placa de agar de lípidos.
4. Incubar en la oscuridad, sin humedad a 25 ° C hasta IJs, o etapas de interés, la forma. IJs será visible como una fuZZY anillo blanco en el borde de la placa. Para ver otras etapas de la vida, véase el Protocolo 4.
5. Colocar las placas en una trampa modificada Blanco ^30. Retirar la tapa de la placa de agar de lípidos y coloque la parte inferior en la parte inferior de un vacío 100 mm x 20 mm placa de Petri. Llene la gran placa de Petri con agua, u otro tampón apropiado para su nematodo, para rodear el plato pequeño. El nivel de agua debe ser aproximadamente la mitad de la altura de la placa pequeña.
6. Incubar la trampa de agua hasta IJs progenie han surgido en el búfer.
7. Nematodos juveniles infecciosos se pueden almacenar en agua en un matraz de cultivo de tejidos.

4. Colección de los estados tempranos de detección

1. Utilice los pasos 3.1 a 3.4 para establecer el ensayo.
2. Se incuban las placas hasta que las etapas de la vida deseados están presentes. Inspección visual diaria puede ser necesario para determinar el tiempo. Para inspeccionar las placas, utilizar el procedimiento descrito en el Protocolo de 2,5. Para S. carpocapsae eggsgrown con X. nematophila en placas LA, hembras grávidas estará presente en 4-5 días, los menores estarán presentes en 7 días, y juveniles infectivos comenzará a ser producido por 15-17 días.
3. Cuando las etapas de la vida deseados están presentes, recoger la muestra. Llenar un pocillo de una placa de 96 pocillos con 200 ul de PBS o tampón apropiado. Suavemente raspe un poco del césped bacteriano que contiene los nematodos. Una cantidad pequeña (~ 50 mg) se proporcionan al menos varios cientos de nematodos una vez progenie F1 se producen, pero más puede ser necesario para los puntos de tiempo anteriores. Coloque la barra en el búfer, así que lo contiene.
4. Incubar durante 30 segundos a un minuto. Remueva la varilla y raspe el residuo restante. Utilizar el palo para remover cualquier agar del pozo. Los nematodos debe ser visible dentro de la memoria intermedia. Mover la mezcla de tampón a un tubo de microcentrífuga limpio.
5. Tratar a los nematodos con levamisol u otro agente paralizante. Disolver unos granos de levamisol en 30 y mu; L de agua. Añadir 1-2 l de esta mezcla para cada 50 l de muestra. Después del tratamiento levamisol los nematodos será no viable.
6. Si las muestras se vieron en una fecha posterior, fijar como se describe en este paso. Si no es así, vaya al paso 4.6. Añadir 200 l de solución fijadora que contiene tampón 1X y 4% de paraformaldehído. Mezclar suavemente, pipeteo puede causar etapas delicadas vida para lisar. Cubrir con papel de aluminio, y se incuba a temperatura ambiente en un agitador a temperatura baja durante al menos 18 h.
7. Colocar los tubos en una gradilla de tubos, y permitir que los nematodos se depositen en el fondo del tubo.
8. Enjuague los nematodos para eliminar el fondo. Pipetear el exceso de líquido y añadir 200 a 500 l de tampón y mezcle suavemente. Repetir. Esto puede repetirse varias veces para eliminar más fondo si se desea.
9. Permitir que los nematodos se depositen en el fondo del tubo y volver a suspender en el volumen deseado.
10. Si los nematodos no son fijos, pantalla inmediatamente. Nematodos fijos se pueden almacenar en el refrigerador hastaa dos semanas. Almacenar en la oscuridad.

5. Los nematodos de cribado para Asociación bacteriana por Microscopía

1. Seleccione algunos nematodos para ver bajo el microscopio mediante la eliminación de una pequeña muestra de la mezcla.
2. Para asegurarse de que los nematodos son todavía de la imagen, se trata con un agente paralizante, como se describe en el Protocolo 4.5. Si no va a tomar una foto o los nematodos son fijos ya, este paso puede ser omitido.
3. Añadir 20-30 l de nematodos en el agua a su portaobjetos y colocar un cubreobjetos encima.
4. Ver nematodos enteros usando microscopía de luz para asegurar los nematodos están en el campo de visión.
5. Ver nematodos utilizando el ajuste en el microscopio fluorescente que corresponde a la fluorescencia expresada por la bacteria.
6. Para identificar la localización bacteriana, tome fotos del nematodo bajo valor fluorescente y un ajuste de microscopía de luz, y luego superponer las imágenes. Las fotos tienen que ser de la misma field de vista. Puede ser necesario tratar varias ampliaciones y vistas al nematodo de encontrar la bacteria.
7. La distribución de la colonización nematodo se puede cuantificar mediante recuento de una población de nematodos, anotando la presencia o ausencia de bacterias, y calculando el porcentaje colonizado. Se recomienda contar hasta al menos 30 nematodos dentro de la población se cuentan en cada categoría (con o sin colonización) para obtener un valor fiable.
8. Cuando sólo unos pocos nematodos en la población son colonizados, puede ser necesario contar con varios miles de nematodos antes de 30 se observó. Para alto rendimiento de cómputo utilice los pasos siguientes.
9. En lugar de contar los nematodos individualmente, alícuota de la población en una placa de múltiples pocillos (por ejemplo, una placa de 24 pocillos). Después de que los nematodos han depositado en el fondo del plato, cada pocillo se pueden escanear en el microscopio y el número de nematodos colonizados puede ser anotado.
10. El número total de nematodos ina población puede ser identificado por diluciones en serie de nematodos en el pozo. Por ejemplo, 1 ml de los nematodos puede ser añadido a un pozo, se mezcló bien por agitación con una punta de pipeta, y 3 l se puede quitar y se contaron para la cuantificación de la población total en el pozo.
11. El porcentaje de nematodos colonizados se puede obtener dividiendo el número colonizados por el número total de nematodos en el pozo.

6. Los resultados representativos

Ejemplo, imágenes de microscopio de nematodos Steinernema asociadas a bacterias Xenorhabdus se muestra en la Figura 3. Para crear la imagen compuesta se ve en la figura 3A, una imagen de contraste de fase se superpone con una imagen fluorescente. La flecha en la Figura 3A indica las bacterias presentes en el nematodo infectivo juvenil (barra = 100 mm). Figura 3B se construyó de una manera similar y muestra un menor nematodo wiTH Green bacterias proteínas fluorescentes etiquetados (barras verdes), situados a lo largo de los nematodos intestinales lumen (barra = 20 micras). Una población de los nematodos de los dos medios se contaron y se obtuvo para la colonización por el simbionte bacteriano (Tabla 1). Para la estadística robusta, lo mejor es contar al menos 100 nematodos por muestra con al menos 30 cae en cada categoría. Como se ve en la Tabla 1, estos nemátodos son colonizados a un nivel de aproximadamente 14,6% cuando se cultiva en agar de lípidos y 68,6% cuando se cultiva en agar hígado riñón. Nematodos y otras especies bacterianas han demostrado tener diferentes niveles de colonización. Por ejemplo X. nematophila coloniza el 99% de S. carpocapsae juveniles infectivos (Martens 2003), y P. luminescens coloniza el 26% de H. bacteriophora juveniles infectivos (Ciche 2003).

Figura 1. Plan esquemático del método. A. La bacteria está diseñado para expresar una proteína fluorescente. Huevos de nematodos B. están aislados de los nematodos adultos para producir nematodos estériles. C. Los nematodos estériles se co-cultivan con bacterias fluorescentes. D. Las etapas de la vida resultantes se observan bajo un microscopio para evaluar la presencia de bacterias en el nematodo.

Figura 2. Representación de las mujeres adultas que contienen huevos. A. El esquema muestra el aspecto general de las hembras Steinernema. DIC imagen de un S.: Inset feltiae hembras grávidas. La flecha de color negro indica la vulva. Las flechas blancas muestran huevos visibles. La imagen es de 20 aumentos, y la barra de escala representa 100 m. B. DIC imagen de un país desarrollado, pero sin eclosionar S.feltiae huevos de nematodos. La imagen es un aumento de 40X, y la barra de escala representa 50 micras. C. DIC imagen de huevos aislados de S. feltiae nematodos bajo ampliación de 10X. Barra de escala es de 100 m.

Figura 3. Ejemplo de imágenes de microscopio de nematodos-bacterial asociación. A. S. nematodos puntauvense se asociaron con su simbionte bacteriano, X. bovienii, GFP expresando. La imagen es una imagen compuesta producida mediante la superposición de una imagen de contraste de fase con una imagen fluorescente del mismo campo de vista. La flecha indica el simbionte bacteriano fluorescente dentro del huésped nematodos. La barra de escala representa 100 m. B. Esta imagen muestra una S. carpocapsae juvenil nematodos con GFP-expresando X. nematophila localizados en el intestino de nematodos.Esta imagen fue construida a través de la superposición de una imagen fluorescente sobre una imagen de contraste de interferencia diferencial. La barra de escala representa a 20 micras.

Tensión	Número de nematodos con acteria	Los nematodos totales Contado	El porcentaje de nematodos olonized
S. puntauvense Agar lípidos	30	205	14,60%
S. Hígado Riñón puntauvense Agar	72	105	68.60%

Tabla 1. Ejemplo de puntuación de una población de nematodos para la presencia de bacterias. En este experimento, axénico S. nematodos puntauvense se cultivaron con su simbionte que expresan GFP en diferentes medios de cultivo (agar agar y lípidos del hígado riñón ³²⁾ para la prueba de defectos de colonización. Un total de al menos un hundred nematodos por muestra se contaron y se anotó la presencia de bacterias. Para poder estadístico, experimental tres repeticiones se deben contar por lo menos con 30 nematodos que caen en cada categoría.

Tabla 2. Plásmidos que contienen proteína fluorescente. Una lista de los posibles plásmidos para la inserción de una proteína fluorescente en el simbionte bacteriano se da enumeran por nombre de plásmido. Otra información incluida son la proteína fluorescente casete codificado, antibiótico que se usa para el mantenimiento del plásmido, otras instrucciones para el uso, la fuente del plásmido. La concentración se indica en paréntesis es la concentración del antibiótico usado para X. nematophila. Cada uno de estos plásmidos se ha utilizado con éxito en cualquiera de Xenorhabdus o Photorhabdus. Información adicional se puede obtener a partir de las citas indicadas. Dependienteen la bacteria que se prueba, algunos plásmidos pueden no funcionar en base a la proteína fluorescente, selección de antibióticos, sitio de inserción, o el origen de la replicación. Los plásmidos mencionados anteriormente contienen diferentes características que pueden permitir su uso en la bacteria de interés. Por ejemplo, mini-Tn7-KSGFP se inserta en el sitio attTn7 del cromosoma, mientras que pECM20 inserta en la X. nematophila cromosoma por recombinación homóloga. Alternativamente, los plásmidos se mantienen extracromosómicamente pPROBE, y cada pPROBE plásmido tiene el mismo esqueleto y el fluoróforo, pero tienen diferentes marcadores seleccionables o los orígenes de replicación para permitir su uso en una variedad de taxonómica o mutantes antecedentes.

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Discusión

El protocolo aquí descrito proporciona un método para la detección óptica de las bacterias dentro de un huésped nematodo (Figura 1). Este método tiene la ventaja de la transparencia óptica de los nematodos y la capacidad de las bacterias de etiquetas fluorescentemente, lo que permite el análisis in vivo de las bacterias dentro del huésped nemátodo (Figura 3). En concreto, este enfoque identifica la localización de bacterias dentro de su huésped. Al contar u...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Lípidos Agar (Estéril)			8 gramos de caldo nutriente, 15 gramos de agar de extracto de levadura, 5 gramos, 890 ml de agua, 10 ml de 0,2 g / ml de MgCl 2. 6 H 2 0, 96 ml de jarabe de maíz solución *, 4 ml de aceite de maíz * Revuelva los medios de comunicación mientras se vierte placas * Añadir ingrediente estéril después del autoclavado
Solución de jarabe de maíz (Estéril)			7 ml de jarabe de maíz, 89 ml de agua mezcla y autoclave
Huevo Solution			16,6 ml de sodio 12% de hipoclorito, 5 ml de KOH 5 M, 80 ml de agua
Lisogenia Caldo (Estéril)			5 gramos de extracto de levadura, 10 g de triptona, 5 gramos de sal, 1 l de agua mezcla y autoclave
Microcentrifugue	Pescador	13-100-675	Cualquier microcentrífuga que contiene tubos de microcentrífuga funcionará
Centrífugo	Beckman	366802	Gran mesa centrífuga superior que posee el 15 ml y 50 ml tubos cónicos
Estéril 60 mm X 15 mm Petri Dish	Pescador	0875713
50 ml tubos de centrífuga	Pescador	05-539-6
15 ml tubos de centrífuga	Pescador	05-531-6
Estéril 100 mm X 20 mm Petri Dish	Pescador	0875711Z	Más profundo que el estándar de placas de Petri
24-así placa	Greiner Bio-One	662000-06
Microscopio			El microscopio tiene capacidad fluorescentes compatibles con el fluoróforo
Paraformaldehído	Microscopía Electrónica de Ciencias	15710
PBS (Estéril)			8 g de NaCl 0,2 g de KCl 1,44 g de Na 2 HPO 4 0,24 g de KH 2 PO 4 1 L de agua Ajuste a un pH de 7,4 y agua a 1 L y autoclave
Tubos de microcentrífuga	Pescador	05-408-138	2 ml o 1,5 ml tubos
Shaker			Cualquier agitador que hace que el líquido se mueva suavemente funcionará
Ácido diaminopimélico	Sigma	D-1377	Si es necesario, suplementar medios a una concentración de 1 mM o