Визуализация Бактерии в Нематоды использованием флуоресцентной микроскопии

Резюме

Для изучения взаимности между Xenorhabdus Бактерий и Steinernema Нематод, были разработаны методы для контроля бактериальной наличие и расположение в пределах нематод. Экспериментальный подход, который может быть применен к другим системам, влечет за собой инженерные бактерии, чтобы выразить зеленый флуоресцентный белок и визуализации, с помощью флуоресцентной микроскопии бактерий в прозрачном нематоды.

Аннотация

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic ^1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis ⁴. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects ⁵. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage ^6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects ^9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems ⁹.

We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila ¹⁴. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations ^9,15-18and the approach therefore is generally applicable.

The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization ^14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues ^14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication ²²or grinding ²³, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes ^21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization ^17,18, and is less laborious than other methods, including sonication ^22,25-27and individual nematode dissection ^28,29.

протокол

1. Строительство Флуоресцентные бактериальный штамм с помощью сопряжения

1. Расти получателя деформации (симбионт должны быть рассмотрены) и доноров штамм в течение ночи. Донор деформации, как правило, кишечная палочка, должны быть способны отдавать ДНК через сопряжение и должны быть трансформированы плазмидой (табл. 2), который несет ген, кодирующий флуоресцентный белок. В зависимости от плазмиды штамма сопряжения помощник может также потребоваться. Если так, то это напряжение должно быть также выращивали в течение ночи. Штамма донора и вспомогательные деформации должны быть выращены с антибиотиками, чтобы выбрать для поддержания плазмид.
2. Субкультура донора, помощник, и получатель штаммов в богатых питательными веществами средах роста не хватает антибиотиков в соотношении 1:100 культуры в среду.
3. Рост культур при температуре соответствующей для каждого штамма пока они не достигают середины журнала стадии роста (OD ₆₀₀ ~ 0,6). Для Xenorhabdus и E. палочки этом этапе растутм достигается примерно от 3 до 4 ч после пересева. Это может варьировать в зависимости от штамма, а в некоторых случаях плазмиды, используется.
4. Смешать напряжения в трубе микроцентрифужных и центрифуги в течение 2 мин при 17900 мкг (13,000 оборотов в минуту в большинстве microfuges). Доля донора и реципиента, который дает наилучшие результаты будут различаться для разных комбинаций, и, возможно, придется быть определены эмпирически. Для Xenorhabdus получателя и E. палочка-доноров, мы используем 3:1 или 1:1. Если помощник штамм необходимости (например, кишечная палочка), оно должно быть добавлено в таком же соотношении, как донор.
5. Слейте супернатант.
6. Повторное приостановить осадок клеток в 30 мкл свежей среды.
7. Найди подвески на богатых питательными веществами пластины средствах массовой информации без каких-либо антибиотиков, и позволяют месте для просушки.
8. Инкубировать, перевернутый, в течение ночи при температуре оптимальной для бактерий получателя и допустимо для доноров (и помощник, если это применимо). Пластина должнабыть выведены по крайней мере 18 часов.
9. Собрать место и для отжима одной колонии на селективные антибиотики пластины. Антибиотики должны выбрать от донора и получателя содержащие плазмиды. Одна или две дополнительные полосы изоляции может быть необходимо изолировать чистую культуру.
10. Убедитесь, что в результате колонии получателя симбионтов, а не донора штамма, путем скрининга на наличие конкретного получателя фенотипов, таких как морфологии колонии, или полимеразной цепной реакции обнаружения получателем конкретных генов. Экран колоний на наличие плазмид с помощью полимеразной цепной реакции известной последовательности плазмиды и флуоресценции. В колониях должны светиться под правильным длиной волны, соответствующей флуоресцентного белка.

2. Производство стерильный Яйца нематод

1. Расти 5 мл естественный бактериальный симбионта ночь. Чтобы начать культуры, бактерии могут быть привиты лизогении бульон (LB) или других у.е.lture средств массовой информации непосредственно из морозильной камеры акций или от полосы пластины.
2. Распределите 600 мкл бактериальной культуры на 10 мм липидов агар (LA) пластин ^29. От восьми до десяти пластин даст достаточно нематод для большинства видов.
3. Инкубировать в темноте без влаги при 25 ° C в течение двух дней.
4. Добавить 5000 инфекционного несовершеннолетних нематоды, или другие этапы в зависимости от нематод используются, в 500 мкл среды с бактериальным газонов. Инкубируйте пластины при температуре 25 ° С в течение 3 дней.
5. Проверьте пластины на наличие взрослых нематод и яйца. Поместите 20 мкл воды на предметное стекло микроскопа. С помощью стерильной палочкой-царапина на небольшое количество нематод от бактериального газона. Положите палку в воду и позволяют нематод отплыть. Посмотрите на слайд при низком увеличении. Более подробную информацию о появлении см. обсуждение и рисунке 2.
6. Если яйца и женщины являются видимыми, продолжать, в противном случае, инкубировать пластин при 25 и Dнапример, C и проверьте для правильного развития каждые 6-12 часов. Когда женщины содержат яиц, положите на несколько мл воды на поверхности пластины. Осторожно вращать тарелки и залить воду в 50 мл коническую трубку. Нематоды должны оторваться от плиты и быть не видна на поверхности пластины. Несколько полоскания может быть необходимым.
7. Разрешить нематод оседают на дно пробирки.
8. Промыть нематод. Внесите излишки воды из верхней части трубки. Пополнение с чистой водой и дайте взрослых нематод, чтобы обосноваться. Внесите лишнюю воду.
9. Заполните конических труб с яйцом решение. Как только яйцо раствор добавляют сроки всех этапов с яйцом решение должно исходить именно так, как описано для максимального выхода яйцеклетки. Инкубировать пробирки при осторожном встряхивании ровно 10 мин. Большинство нематод должен быть распущен в конце инкубации.
10. Сразу центрифуги конических труб при 1250 х г в течение ровно 10 минут (это включает в себя приведение центрифуг до скоростино не до 0 х гр. Используйте тормоз).
11. Сразу переливать супернатант.
12. Сразу повторно приостановить гранул с яйцом решение с помощью пипетки.
13. Сразу заполнить коническую трубку с яйцом решения и хорошо перемешать путем обращения в 3-5 раз. Затем сразу же вращаться как в 2.10.
14. Сразу переливать супернатант.
15. Повторное приостановить гранул в LB с помощью пипетки, трансфер в 15 мл коническую трубку для улучшения гранулирования во время промывания. LB является стандартным для Steinernema SPP. Другие буферы (например, минимальной средней соли) могут быть использованы в зависимости от нематоды и бактерии, имея в виду буфера не должно вредить или нематоды или бактерии.
16. Заполнить трубу с LB и спина, как и в 2.10.
17. Слейте супернатант, и вновь приостановить LB.
18. Промойте нематод в общей сложности 3 раза, повторяя 2,14 и 2,15.
19. Развести повторно приостановил яйца нематод в соответствующем объеме. Там должно быть не менее 10 яиц в мкл. Например,GS могут быть сохранены в 6-см чашки Петри в 5 мл LB, по крайней мере, четыре дня, добавив антибиотиков, которые подавляют рост колонизации бактериями и упаковка пластины в парафильмом. Яиц нужно мыть раз в 15 мл LB (как и в 2,13 и 2,14) до посева на бактериальную газонов. Обратите внимание, что яйцо будет люк в это время и не могут быть синхронизированы развитием при использовании в колонизации анализов.

3. Совместное выращивание анализа с флуоресцентной бактерии

1. Расти флуоресцентные бактерий в течение ночи, выбрав для плазмиды, если необходимо.
2. Распределите 600 мкл бактериальной культуры на 10 мм пластины липидов Агар стерильной палочкой. Инкубировать при 25 ° С в течение 2 дней.
3. Место 500-5,000 стерильный яйца нематод в общей сложности от 100 до 400 мкл (оптимально 2000 нематоды в 200 мкл) на каждую пластину агара липидов.
4. Инкубировать в темноте без влаги при температуре 25 ° C до IJs или других этапов интерес, форма. IJs будет видно, как фуЗЗЫ белое кольцо на край тарелки. Чтобы посмотреть на других этапах жизни, см. Протокол 4.
5. Установите пластины в измененном Белый ловушку ^30. Снимите крышку пластины агара липидов и поместить нижний на дно пустого 100 мм х 20 мм чашки Петри. Наполните большую чашку Петри с водой или другой буфер подходящий для вашей нематоды, чтобы окружить небольшую тарелку. Уровень воды должна быть примерно половину высоты маленькую тарелку.
6. Выдержите воду ловушки, пока потомство IJs появились в буфер.
7. Нематоды Инфекционный несовершеннолетних могут быть сохранены в воду в колбе культуре ткани.

4. Коллекция ранних стадиях жизни для скрининга

1. Использование шаги 3,1 через 3,4 до настройки анализа.
2. Инкубируйте пластины нужный этапах жизни нет. Ежедневный визуальный осмотр может быть необходимо для определения времени. Для проверки пластин, использовать процедуру, описанную в протоколе 2.5. Для С. carpocapsae eggsgrown с X. nematophila на пластинах Лос-Анджелесе, беременных самок будет присутствовать в течение 4-5 дней, несовершеннолетним будет присутствовать в 7 дней, и инфекционный несовершеннолетних начнет производиться на 15-17 дней.
3. Когда желаемый этапах жизни присутствуют, собирать ваши образца. Заполните лунку 96-луночный планшет с 200 мкл PBS или другого соответствующего буфера. Аккуратно очистите от некоторых бактериальных газон, который содержит нематод. Величиной с горошину (~ 50 мг) обеспечит по крайней мере, несколько сотен нематод раз F1 потомство производят, но еще может быть необходимо для более ранних моментов времени. Положите палку в лунку, содержащую буфер.
4. Выдержите в течение 30 секунд до минуты. Снимите палку и соскоблить оставшиеся остатки. Используйте палку, чтобы удалить агара из колодца. Нематоды должны быть видны в буфер. Переместить буферную смесь в чистую пробирку отцентрифугировать.
5. Лечить нематод с левамизол или других парализующих агента. Растворите несколько зерен левамизол в 30-ти; Л воды. Добавить 1-2 мкл этой смеси для каждого 50 мкл образца. После левамизол лечение нематоды будет нежизнеспособным.
6. Если образцы будут рассматриваться позднее, установить, как описано в этом шаге. Если нет, перейдите к шагу 4.6. Добавить 200 мкл фиксирующего раствора, содержащего 1X буфере и 4% параформальдегида. Осторожно перемешать, пипетирование может привести к тонким этапах жизни лизировать. Накрыть фольгой, и инкубировать при комнатной температуре на шейкере на низко в течение по крайней мере 18 часов.
7. Поместите трубы в трубу стойки, и позволяют нематод оседают на дно пробирки.
8. Промыть нематоды, чтобы удалить фон. Внесите лишнюю жидкость и добавить 200 - 500 мкл буфера и аккуратно перемешать. Повторить. Это может быть повторен несколько раз, чтобы удалить больше фона при желании.
9. Разрешить нематод оседают на дно пробирки и вновь приостановить в нужном объеме.
10. Если нематоды не фиксированы, экран практически мгновенно. Исправлена ​​нематоды могут храниться в холодильнике в течениедо двух недель. Хранить в темноте.

5. Скрининг Нематоды для бактериальной ассоциацией по микроскопии

1. Выберите некоторых нематод, чтобы посмотреть под микроскопом, удаляя небольшой образец вашей смеси.
2. Чтобы убедиться, что нематоды еще за картину, относиться с паралитического агента, как описано в протоколе 4.5. Если вы не принимаете изображения или нематоды уже зафиксированы, этот шаг можно пропустить.
3. Добавить 20-30 мкл нематод в воде, чтобы ваше стекло микроскопа и поместите покровное на вершине.
4. Просмотреть все нематод с помощью световой микроскопии для обеспечения нематоды находятся в поле зрения.
5. Просмотр нематод использованием флуоресцентных установка на микроскоп, который соответствует флуоресценции выраженные бактерий.
6. Для выявления бактериальной локализации, сфотографировать нематод под флуоресцентным установки и настройки световой микроскопии, а затем наложить изображения. Фотографии должны быть одного и того же Фиэльд зрения. Это может быть необходимо, чтобы попробовать несколько увеличений и виды нематод, чтобы найти бактерии.
7. Распределение нематод колонизации может быть определена количественно путем подсчета населения нематод, забив на наличие или отсутствие бактерий, и расчет процентов колонизирована. Мы рекомендуем счет до по крайней мере 30 нематоды в популяции насчитывается в каждой категории (с или без колонизации), чтобы получить надежные значения.
8. Когда только несколько нематод в популяции колонизирована, это может быть необходимо, чтобы насчитать несколько тысяч нематод до 30 не наблюдается. Для высокой пропускной подсчета выполните следующие действия.
9. Вместо подсчета нематод отдельно, аликвоты населения в мульти-луночный планшет (например, 24-луночный планшет). После того, нематодами осели на дно тарелки, каждую лунку могут быть проверены на микроскоп и число колонизированных нематод может быть засчитан.
10. Общее количество нематод яН.А. населения могут быть определены последовательные разведения нематод в скважине. Например, 1 мл нематоды могут быть добавлены к хорошо, хорошо перемешивают при перемешивании с пипетки наконечник, и 3 мкл может быть удалена и считал для количественного определения общей численности населения в скважине.
11. Процент колонизировали нематоды могут быть получены путем деления числа колонизировали общее количество нематод в скважине.

6. Представитель Результаты

Пример микроскопа, нематоды Steinernema, связанные с Xenorhabdus бактерий показано на рисунке 3. Для создания составного изображения показано на рисунке 3А, изображение фазового контраста был обложен флуоресцентные изображения. Стрелка на рисунке указывает 3A бактерий, присутствующих в инфекционных несовершеннолетних нематода (бар = 100 мкм). 3В был построен аналогичным образом и изображает несовершеннолетних нематоды Wiм зеленый флуоресцентный белок меченых бактерий (зеленый стержни), локализованных по всему нематоды просвете кишечника (бар = 20 мкм). Население нематод из двух сред были подсчитаны и забил для колонизации бактериальных симбионтов (табл. 1). Для надежной статистики, то лучше рассчитывать по меньшей мере 100 нематоды на образец, по крайней мере, 30 попадающие в каждой категории. Как видно из таблицы 1, эти нематоды колонизировали на уровне примерно 14,6% при росте на агаре липидов и 68,6% при росте на агаре печень почки. Другие нематоды и бактериальных видов было показано, что различные уровни колонизации. Например X. nematophila колонизирует 99% S. carpocapsae несовершеннолетних инфекционный (Martens 2003) и П. luminescens колонизирует 26% H. bacteriophora инфекционного несовершеннолетних (Ciche 2003).

Рисунок 1. Схема схема метода. А. бактерии разработан, чтобы выразить флуоресцентного белка. Яиц нематод B. изолированы от взрослых нематод для производства стерильных нематод. C. стерильную нематоды совместно культивируют с люминесцентными бактериями. D. В результате этапах жизни рассматривается под Микроскоп для оценки бактериального присутствия в нематодой.

Рисунок 2. Изображение взрослых самок, содержащие яйца. А. Схема показывает общий вид женщины Steinernema. Врезка: DIC образ С. feltiae беременной женщины. Черная стрелка указывает на наружных половых органах. Белые стрелки показывают видимые яйца. Изображение на 20-кратным увеличением, и шкалы составляет 100 мкм. B. DIC образом разработаны, но невылупившиеся С.feltiae нематоды яйцо. Изображение 40-кратном увеличении, а шкалы составляет 50 мкм. C. DIC изображение яйца изолированы от S. feltiae нематод при 10-кратном увеличении. Шкала бар 100 мкм.

Рисунок 3. Пример микроскопа, нематоды-бактериальных ассоциаций. А. С. puntauvense нематод, связанных с их бактериальных симбионтов, X. bovienii, выражая GFP. Изображение составного изображения производится путем наложения изображений фазового контраста с флуоресцентное изображение из того же поля зрения. Стрелка указывает на флуоресцентные бактериальных симбионтов в нематодой хозяина. Шкала бар составляет 100 мкм. B. Это изображение показывает S. carpocapsae несовершеннолетних нематод с GFP-экспрессирующих X. nematophila локализованы в пределах нематоды кишечника.Этот снимок был построен через наложение флуоресцентное изображение более контрастное изображение вмешательства дифференциала. Шкалы составляет 20 мкм.

Напрягаться	Количество нематод с acteria	Всего Нематоды Подсчитано	Процент от нематоды olonized
С. puntauvense липидов Агар	30	205	14,60%
С. puntauvense Печень Почки Агар	72	105	68,60%

Таблица 1. Пример озвучивание нематоды населения для бактериального присутствия. В этом эксперименте, стерильный С. puntauvense нематоды были выращены с их GFP-экспрессирующих симбионта на различные питательные среды (агар липидов печени и почек агар ³²⁾ для проверки колонизации дефектов. В общей сложности по меньшей мере одной hundreг нематод за образец были подсчитаны и забил на наличие бактерий. Для статистической мощности, три экспериментальных повторяет следует считать, по крайней мере, 30 нематоды падения в каждой категории.

Таблица 2. Флуоресцентные белки, содержащие плазмиды. Список потенциальных плазмиды для введения флуоресцентных белков в бактериальных симбионтов дается перечисленные по имени плазмиды. Другая информация включены флуоресцентного белка закодированного, антибиотик кассеты использовались для поддержания плазмид, другие инструкции по применению, источник плазмиды. Концентрация отметил в скобках концентрация антибиотиков, используемых для X. nematophila. Каждый из этих плазмид был успешно использован в любом Xenorhabdus или Photorhabdus. Дополнительная информация может быть получена из отметили, цитаты. В зависимостина бактерии проходят испытания, некоторые плазмиды не могут работать основанные на флуоресцентных белков, антибиотиков выбора, вставки сайте, или происхождение репликации. Плазмиды содержат перечисленные выше различные функции, которые могут позволить использование в бактерию интерес. Например, мини-Tn7-KSGFP вставляет в attTn7 сайте хромосомы, в то время как pECM20 вставляет в X. nematophila хромосомы гомологичной рекомбинации. Кроме того, pPROBE плазмиды сохраняются хромосомы, и каждый pPROBE плазмида имеет те же основы и флуорофор, но имеют разные селективных маркеров или происхождение репликации для обеспечения возможности их использования в различных таксономических или мутантного происхождения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, предоставляет метод для оптического обнаружения бактерий в нематодой хост (рис. 1). Этот метод использует оптическую прозрачность нематод и способности флуоресцентной меткой бактерий, что позволяет в естественных условиях анализа бактерий в не...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Липидный Агар (Стерильные)			8 грамм питательного бульона, 15 г агара, 5 граммов экстракта дрожжей, 890 мл воды, 10 мл 0,2 г / мл MgCl 2. 6H 2 0, 96 мл кукурузного сиропа решение *, 4 мл кукурузного масла * Движение средств массовой информации при заливке плиты * Добавить стерильную ингредиента после автоклавирования
Решение кукурузный сироп (Стерильные)			7 мл кукурузного сиропа, 89 мл воды смеси и автоклава
Яйцо решение			16,6 мл 12% гипохлорит натрия, 5 мл 5М KOH, 80 мл воды
Отвар лизогении (Стерильные)			5 г дрожжевого экстракта, 10 г триптон, 5 г соли, 1 л воды смеси и автоклава
Микроцентрифуге	Рыбак	13-100-675	Любой микроцентрифужную, который держит микроцентрифуге трубы будет работать
Центрифугировать	Beckman	366802	Большой центрифуги верхней таблице, которая содержит 15 мл и 50 мл конические пробирки
Стерильные 60 мм X 15 мм чашку Петри	Рыбак	0875713
50 тюбиков мл центрифуги	Рыбак	05-539-6
15 ламп мл центрифуги	Рыбак	05-531-6
Стерильные 100 мм X 20 мм чашку Петри	Рыбак	0875711Z	Глубже, чем стандартные чашки Петри
24-луночный планшет	Greiner Bio-One	662000-06
Микроскоп			Микроскоп необходимо люминесцентные возможности совместима с вашей флуорофора
Параформальдегид	Электрон наук микроскопии	15710
PBS (Стерильные)			8 г NaCL 0,2 г хлорида калия 1,44 г Na 2 HPO 4 0,24 г KH 2 PO 4 1 л воды Отрегулируйте рН 7,4 и воды до 1 л и автоклав
Микроцентрифуге труб	Рыбак	05-408-138	2 мл или 1,5 мл пробирки
Шейкер			Любой шейкер, который вызывает жидкость осторожно двигаться будет работать
Диаминопимелиновой кислоты	Сигма	D-1377	При необходимости, дополнять средства массовой информации к концентрации или 1 мм