Visualizzare batteri nei nematodi usando la microscopia a fluorescenza

Riepilogo

Per studiare il mutualismo tra Xenorhabdus Batteri e Steinernema, i metodi sono stati sviluppati per monitorare la presenza di batteri e posizione all'interno nematodi. L'approccio sperimentale, che può essere applicata ad altri sistemi, comporta batteri ingegneria per esprimere la proteina fluorescente verde e visualizzazione, utilizzando batteri microscopia a fluorescenza all'interno del nematode trasparente.

Abstract

Simbiosi, la convivenza di due o più organismi, sono diffusi in tutti i regni della vita. Come due dei microrganismi più diffusi sulla terra, nematodi e batteri formano una vasta gamma di associazioni simbiotiche che vanno dal vantaggioso per patogeni ^1-3. Una tale associazione è il rapporto di reciproco beneficio tra i batteri e nematodi Xenorhabdus Steinernema, che è emerso come un sistema modello di simbiosi ^4. Nematodi Steinernema sono entomopatogeno, usando il loro simbionte batterico per uccidere gli insetti ^5. Per la trasmissione tra gli host di insetti, i batteri colonizzano l'intestino dello stadio infettivo del nematode del giovanile ^6-8. Recentemente, diverse specie di nematodi altri hanno dimostrato di utilizzare i batteri per uccidere insetti ^9-13, ed indagini hanno iniziato a esaminare le interazioni tra i nematodi e batteri in questi sistemi <sup> 9.

Si descrive un metodo per la visualizzazione di un simbionte batterico all'interno o su un host nematode, sfruttando la trasparenza ottica di nematodi quando visti al microscopio. I batteri sono progettati per esprimere una proteina fluorescente, consentendo loro visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza. Sono disponibili molti plasmidi che portano geni che codificano proteine ​​che reagiscono a lunghezze d'onda differenti (verde o rossa), e la coniugazione dei plasmidi da un ceppo di Escherichia coli in un donatore simbionte destinatario batterica è successo per una vasta gamma di batteri. I metodi descritti sono stati sviluppati per indagare l'associazione tra Steinernema carpocapsae e Xenorhabdus nematophila ^14. Metodi simili sono stati utilizzati per studiare altri nematodi batterio associazioni ^{9, 15-18} e l'approccio è quindi generalmente applicabile.

La method consente la caratterizzazione della presenza di batteri e localizzazione all'interno nematodi a diversi stadi di sviluppo, fornendo approfondimenti sulla natura dell'associazione e il processo di colonizzazione ^{14, 16, 19.} Analisi microscopica rivela sia colonizzazione frequenza all'interno di una popolazione di batteri e localizzazione per ospitare tessuti ^{14, 16, 19-21.} Questo è un vantaggio rispetto ad altri metodi di monitoraggio batteri all'interno popolazioni di nematodi, come sonicazione ²² o molatura ^23, che possono fornire livelli medi di colonizzazione, ma non può, per esempio, discriminare popolazioni con una frequenza elevata di bassi carichi simbionti da popolazioni con una bassa frequenza di carichi elevati simbionti. La discriminazione della frequenza e del carico di batteri colonizzatori può essere particolarmente importante quando lo screening o la caratterizzazione di mutanti batterici fenotipi colonizzazione ^{21, 24.} Infatti, microscopia a fluorescenza è stato utilizzato in screening ad alta di mutanti batterici per difetti di colonizzazione ^{17, 18,} ​​ed è meno laborioso rispetto ad altri metodi, compreso sonicazione ^{22, 25-27} e dissezione nematode individuale ^{28, 29.}

Protocollo

1. Costruzione di un ceppo batterico fluorescente via Coniugazione

1. Crescere il ceppo ricevente (simbionte da esaminare) e ceppo donatore overnight. Il ceppo donatore, di solito Escherichia coli, dovrebbe essere in grado di donare DNA tramite coniugazione e devono essere trasformati con un plasmide (Tabella 2) che porta un gene codificante una proteina fluorescente. A seconda del plasmide, un ceppo helper coniugazione può anche essere richiesto. Se è così, questo ceppo deve anche essere coltivate durante la notte. Il ceppo donatore e ceppo helper dovrebbero essere coltivate con antibiotici per selezionare per il mantenimento del plasmide.
2. Eseguire sottocolture il donatore, aiutante, e le tensioni dei destinatari nel terreno di coltura ricco di nutrienti privi di antibiotici in un rapporto 1:100 di cultura e media.
3. Crescono le colture a temperatura appropriata per ogni ceppo fino a raggiungere metà log fase di crescita (OD ₆₀₀ ~ 0,6). Per Xenorhabdus ed E. coli questa fase di crescitath viene raggiunta circa 3 a 4 ore dopo subcoltura. Questo può variare a seconda del ceppo, o in alcuni casi il plasmide, utilizzato.
4. Miscelare i ceppi in una microprovetta e centrifugare per 2 min a 17.900 xg (13.000 rpm in maggior microfuges). La proporzione di donatore e ricevente che produce migliori risultati variano per combinazioni diverse, e possono essere determinate empiricamente. Per un destinatario Xenorhabdus ed E. donatore coli, usiamo un 3:1 o 1:1. Se un ceppo helper è necessario (ad esempio E. coli), va aggiunto nello stesso rapporto come donatore.
5. Decantare il surnatante.
6. Risospendere il pellet di cellule in 30 ml di mezzi freschi.
7. Spot la sospensione su un piatto nutriente multimediale senza antibiotici, e lasciare il posto ad asciugare.
8. Incubare la piastra, capovolta, tutta la notte a una temperatura ottimale per il batterio ricevente e ammissibile per il donatore (helper e, se del caso). La piastra deveessere incubate almeno 18 ore.
9. Raschiare il posto e striscia per singole colonie su una piastra selettiva antibiotico. Gli antibiotici dovrebbero scegliere contro il donatore e il ricevente contenente il plasmide. Uno o due strisce di isolamento supplementari può essere necessario isolare una coltura pura.
10. Garantire le colonie risultanti sono il simbionte destinatario, e non il ceppo donatore, attraverso lo screening per la presenza di fenotipi destinatario specifici, quali la morfologia delle colonie, o catena della polimerasi reazione di rilevamento destinatario geni specifici. Schermare le colonie di presenza del plasmide da PCR di una sequenza nota plasmide e fluorescenza. Le colonie dovrebbe fluorescenza sotto la corretta lunghezza d'onda corrispondente alla proteina fluorescente.

2. La produzione di uova Nematode axeniche

1. Grow 5 ml del simbionte batterico naturale durante la notte. Per avviare una cultura, i batteri possono essere inoculati in lisogenia Broth (LB) o cu altrisupporti lture direttamente da uno stock congelatore o da una lastra di striscia.
2. Diffusione 600 microlitri della coltura batterica su 10 millimetri lipidici Agar (LA) piastre ^29. Da otto a dieci piatti produrrà nematodi sufficienti per la maggior parte delle specie.
3. Incubare al buio senza umidità a 25 ° C per due giorni.
4. Aggiungi 5000 nematodi infettive giovanile, o altre fasi a seconda del nematode in uso, in 500 ml di media per i prati batteriche. Incubare le piastre a 25 ° C per 3 giorni.
5. Controllare le piastre per la presenza di nematodi adulti e uova. Mettere 20 l di acqua su un vetrino da microscopio. Utilizzando un bastoncino sterile scrape-up una piccola quantità di nematodi dal prato batterica. Mettere il bastone in acqua e permettere ai nematodi a nuotare fuori. Guarda il tuo scivolate sotto basso ingrandimento. Per ulteriori informazioni sulla comparsa vedere la discussione e Figura 2.
6. Se le uova e le femmine sono visibili, continuare, altrimenti, incubare le piastre a 25 & dad esempio, C e controllare per un corretto sviluppo ogni ora 6-12. Quando le femmine contengono uova, posizionare alcuni ml di acqua sulla superficie delle piastre. Mescolare delicatamente i piatti e versare l'acqua in un tubo da 50 ml. Nematodi dovrebbe venire fuori delle lastre e non sarà più visibile sulla superficie della lastra. Risciacqui Possono essere necessari più.
7. Permettono i nematodi di depositarsi sul fondo della provetta.
8. Sciacquare nematodi. Pipettare l'acqua in eccesso dalla parte superiore del tubo. Riempire con acqua pulita e lasciare nematodi adulti di risolvere. Pipettare l'acqua in eccesso.
9. Riempire i tubi conici con soluzione uovo. Una volta che la soluzione uovo viene aggiunta la tempistica di tutte le fasi con la soluzione uovo deve procedere esattamente come descritto per la resa uovo di massimo. Incubare le provette, mentre scuotendo delicatamente per esattamente 10 minuti. La maggior parte dei nematodi deve essere disciolta dal termine dell'incubazione.
10. Immediatamente centrifugare le provette coniche a 1250 xg per esattamente 10 minuti (questo include portando la centrifuga a regimema non fino a 0 x g. Utilizzare il freno).
11. Immediatamente decantare il supernatante.
12. Immediatamente risospendere il pellet con la soluzione uovo pipettando.
13. Subito riempire tubo conico con la soluzione d'uovo e mescolare bene per inversione 3-5 volte. Poi subito girare come in 2.10.
14. Immediatamente decantare il supernatante.
15. Risospendere il pellet in LB pipettando, trasferire in una provetta da 15 ml conica per pellet migliore durante le fasi di lavaggio. LB è standard per Steinernema spp. Altri buffer (ad esempio un mezzo minimo sali) può essere utilizzato a seconda del nematode e batterio, tenendo presente il buffer non deve danneggiare sia il nematode o batterio.
16. Riempire il tubo con LB e spin come in 2.10.
17. Decantare il surnatante e risospendere in LB.
18. Risciacquare i nematodi un totale di 3 volte ripetendo 2,14 e 2,15.
19. Diluire le ri-sospese le uova di nematodi a un volume adeguato. Ci devono essere almeno 10 uova per microlitro. Ad esempio,gs possono essere memorizzati in un 6-centimetri Petri in 5 ml di LB per almeno quattro giorni aggiungendo antibiotici che inibiscono la crescita di batteri colonizzatrici e avvolgendo la piastra in parafilm. Le uova dovranno essere lavate una volta in 15 ml di LB (come in 2,13 e 2,14) prima inoculando sui prati batteriche. Si noti che le uova si schiudono in questo periodo e non possono essere sincronizzati evolutivo quando viene utilizzato in saggi colonizzazione.

3. Co-coltura test con batteri fluorescenti

1. Crescere batteri fluorescenti overnight, selezionando per il plasmide se necessario.
2. Diffusione 600 microlitri della coltura batterica su 10 piatti dei lipidi millimetri Agar con un bastone sterile. Incubare a 25 ° C per 2 giorni.
3. Luogo 500-5,000 uova di nematodi axeniche in un totale da 100 a 400 microlitri (in modo ottimale 2000 nematodi a 200 pl) su ciascuna piastra di agar lipidi.
4. Incubare al buio senza umidità a 25 ° C fino a IJ, o altre fasi di interesse, la forma. IJ sarà visibile come fuzzy anello bianco sul bordo del piatto. Per vedere altre fasi della vita, consultare protocollo 4.
5. Posizionare le piastre in una trappola modificata Bianco ^30. Rimuovere il coperchio della piastra agar lipidico e posizionare la parte inferiore nella parte inferiore di un vuoto 100 mm x 20 millimetri piatto Petri. Riempire il grande piatto di Petri con acqua, o altro buffer appropriato per il nematode, a circondare la piastrina. Il livello dell'acqua dovrebbe essere circa la metà dell'altezza della piastrina.
6. Incubare la trappola acqua fino IJs progenie sono emersi nel buffer.
7. Nematodi giovanili infettivi possono essere conservati in acqua in un pallone di coltura tissutale.

4. Raccolta delle prime fasi di vita per lo screening

1. Utilizzare i passaggi da 3.1 al 3.4 per impostare il dosaggio.
2. Incubare le piastre fino a quando le fasi di vita desiderati sono presenti. Giornaliera ispezione visiva può essere necessario determinare la temporizzazione. Per ispezionare le piastre, utilizzare la procedura descritta nel protocollo 2.5. Per S. carpocapsae eggsgrown con X. nematophila su piatti LA, femmine gravide saranno presenti in 4-5 giorni, i giovani sarà presente in 7 giorni, e larve infettive inizierà a essere prodotta da 15-17 giorni.
3. Quando le fasi di vita desiderati sono presenti, raccogliere il campione. Riempire un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con 200 microlitri di PBS o altro tampone appropriato. Delicatamente togliere alcuni del prato batterica che contiene nematodi. Una piccola quantità (~ 50 mg) fornirà almeno diverse centinaia di nematodi volta progenie F1 sono prodotti, ma più può essere necessario per intervalli di tempo precedenti. Posizionare la barra nel buffer pozzetto contenente.
4. Incubare per 30 secondi a un minuto. Rimuovere il bastone e raschiare il residuo. Usare il bastone per rimuovere qualsiasi agar dal pozzo. I nematodi dovrebbero essere visibili all'interno del buffer. Spostare la miscela tampone in una provetta da microcentrifuga pulito.
5. Trattare i nematodi con levamisolo o altro agente paralizzante. Sciogliere qualche grano di levamisolo in 30 & mu; L di acqua. Aggiungere 1-2 ml di questa miscela per ogni 50 microlitri di campione. Dopo il trattamento levamisolo i nematodi saranno non vitali.
6. Se i campioni saranno visti in una data successiva, fissare come descritto in questo passaggio. In caso contrario, passare al punto 4.6. Aggiungere 200 pl di soluzione di fissativo contenente 1X tampone e 4% paraformaldeide. Mescolare delicatamente, pipettaggio può causare delicate fasi della vita per la lisi. Coprire con un foglio, e incubare a temperatura ambiente su un agitatore a bassa per almeno 18 ore.
7. Porre i tubi in un portaprovette, e permettere ai nematodi di depositarsi sul fondo della provetta.
8. Sciacquare nematodi a rimuovere lo sfondo. Pipettare il liquido in eccesso e aggiungere 200-500 ml di tampone e mescolare delicatamente. Ripeti. Questo può essere ripetuto alcune volte per rimuovere più di fondo, se desiderato.
9. Permettono i nematodi di depositarsi sul fondo della provetta e risospendere nel volume desiderato.
10. Se i nematodi non sono fissi, schermo immediatamente. Nematodi fissi possono essere conservate in frigorifero finoa due settimane. Conservare al buio.

5. Nematodi di screening per associazione batterica di Microscopia

1. Selezionare alcuni nematodi per visualizzare al microscopio rimuovendo un piccolo campione della miscela.
2. Per garantire che i nematodi sono ancora per l'immagine, trattare con un agente paralizzante come descritto nel protocollo 4,5. Se non si scatta una foto o dei nematodi sono già fissati, questo passaggio può essere saltato.
3. Aggiungere 20-30 ml di nematodi in acqua al vetrino da microscopio e mettere un coprioggetto sopra.
4. Guarda nematodi intere usando microscopia ottica a garantire nematodi sono nel campo di vista.
5. Guarda nematodi utilizzando l'impostazione fluorescente del microscopio che corrisponde alla fluorescenza espressa dai batteri.
6. Per identificare la localizzazione batterica, scattare foto del nematode in impostazione fluorescente e un ambiente microscopia ottica, e poi sovrapporre le immagini. Le foto devono essere della stessa Field di vista. Potrebbe essere necessario provare diversi ingrandimenti e vista sul nematode per trovare i batteri.
7. La distribuzione della colonizzazione nematode può essere quantificata contando una popolazione di nematodi, punteggio per la presenza o assenza di batteri, e il calcolo della percentuale colonizzato. Si consiglia di conteggio e almeno 30 nematodi all'interno della popolazione sono conteggiati in ciascuna categoria (con o senza colonizzazione) per ottenere un valore affidabile.
8. Quando solo pochi nematodi nella popolazione sono colonizzati, può essere necessario contare diverse migliaia di nematodi prima 30 sono osservati. Per high-throughput conteggio eseguire le seguenti operazioni.
9. Invece di contare nematodi singolarmente, un'aliquota della popolazione in una piastra multipozzetto (ad esempio, una piastra a 24 pozzetti). Dopo i nematodi hanno depositata sul fondo del piatto, ogni pozzetto possono essere acquisiti sul microscopio ed il numero di nematodi colonizzati può essere ottenuto.
10. Il numero totale di nematodi ipopolazione na può essere identificato da diluizioni seriali di nematodi nel pozzo. Per esempio, 1 ml di nematodi può essere aggiunto a un pozzo, ben miscelato mediante agitazione con una punta di pipetta, e 3 microlitri possono essere rimossi e contati per la quantificazione della popolazione totale nel pozzo.
11. La percentuale di nematodi colonizzati può essere ottenuto dividendo il numero colonizzato dal numero totale di nematodi nel pozzo.

6. Risultati rappresentativi

Immagini di esempio microscopio di nematodi Steinernema associati batteri Xenorhabdus sono mostrati in Figura 3. Per creare l'immagine composita visto nella figura 3A, un'immagine contrasto di fase era rivestita con un'immagine fluorescente. La freccia in Figura 3A indica i batteri presenti all'interno del nematode infettiva giovanile (bar = 100 micron). Figura 3B è stato costruito in modo simile e raffigura un minore nematode wi° i batteri la proteina fluorescente verde (etichettati barre verdi) localizzate in tutto il lume nematodi intestinali (bar = 20 micron). Una popolazione dei nematodi di due supporti sono state contate e ottenuto per la colonizzazione batterica dal simbionte (Tabella 1). Per le statistiche robuste, è meglio contare almeno 100 nematodi per campione con almeno il 30 che rientrano in ciascuna categoria. Come si vede nella tabella 1, questi nematodi sono colonizzati ad un livello di circa il 14,6% quando coltivate su agar lipidica e 68,6% quando coltivate su agar fegato rene. Nematode altre specie batteriche hanno dimostrato di avere diversi livelli di colonizzazione. Per esempio X. nematophila colonizza il 99% di S. larve infettive carpocapsae Martens (2003), e P. luminescens colonizza il 26% di H. larve infettive bacteriophora (Ciche 2003).

Figura 1. Contorno schematica del metodo. A. Il batterio è progettato per esprimere una proteina fluorescente. Nematode B. uova sono isolati da nematodi adulti per produrre nematodi sterili. C. I nematodi sterili sono co-coltivati ​​con i batteri fluorescenti. D. Gli stadi di vita risultanti sono visti al microscopio per valutare la presenza di batteri all'interno del nematode.

Figura 2. Rappresentazione di femmine adulte contenenti uova. A. Lo schema mostra l'aspetto generale delle femmine Steinernema. Nel riquadro: immagine DIC di un S. feltiae gravido femminile. La freccia nera indica la vulva. Frecce bianche indicano le uova visibili. L'immagine è un ingrandimento 20x, e la barra della scala rappresenta 100 micron. B. immagine DIC di un elaborato, ma non schiuse S.feltiae uovo nematode. L'immagine è di ingrandimento 40X, e la barra della scala rappresenta il 50 pm. Immagine C. DIC di uova isolato da S. feltiae nematodi sotto ingrandimento 10X. Barra di scala è di 100 micron.

Figura 3. Microscopio immagini Esempio di nematode-batterica associazione. A. S. nematodi puntauvense sono stati associati con il loro simbionte batterico, X. bovienii, esprime GFP. L'immagine è un'immagine composita prodotta sovrapponendo un'immagine contrasto di fase con un'immagine fluorescente dallo stesso campo di vista. La freccia indica il simbionte fluorescente batterica all'interno dell'ospite nematode. Barra della scala rappresenta 100 micron. B. Questa immagine mostra una S. carpocapsae nematode giovanile con GFP che esprimono X. nematophila localizzati all'interno dell'intestino nematode.Questa immagine è stata costruita attraverso sovrapporre un'immagine fluorescente su una immagine di contrasto differenziale di interferenza. La barra di scala rappresenta 20 pm.

Tensione	Numero di Nematodi Con acteria	Nematodi Totale contati	Percentuale di Nematodi olonized
S. puntauvense lipidi Agar	30	205	14.60%
S. puntauvense Fegato Rene Agar	72	105	68,60%

Tabella 1. Scoring esempio di una popolazione di nematodi per presenza batterica. In questo esperimento, axeniche S. nematodi puntauvense sono state coltivate con la loro GFP che esprimono simbionte su supporti di crescita diversi (agar agar lipidi e reni fegato ³²⁾ per verificare i difetti di colonizzazione. Un totale di almeno un hundrenematodi d per campione sono state contate e ha ottenuto per la presenza di batteri. Per potenza statistica, tre repliche sperimentali devono essere conteggiati con almeno 30 nematodi che rientrano in ciascuna categoria.

Tabella 2. Plasmidi contenenti proteine ​​fluorescenti. Un elenco di potenziali plasmidi per l'inserimento di una proteina fluorescente nel simbionte batterico è dato elencati per nome del plasmide. Altre informazioni incluse sono la proteina fluorescente codificata, cassette antibiotico utilizzato per la manutenzione plasmide, altre istruzioni per l'uso, l'origine del plasmide. La concentrazione indicato in parentesi è la concentrazione di antibiotico utilizzato per X. nematophila. Ognuno di questi plasmidi è stata utilizzata con successo sia in Xenorhabdus o Photorhabdus. Ulteriori informazioni possono essere ottenute dalle citazioni rilevate. Dipendentesul batterio testato, alcuni plasmidi possono non funzionare in base alla proteina fluorescente, selezione antibiotica, sito di inserzione, o origine di replicazione. I plasmidi di cui sopra contengono diverse caratteristiche che possono consentire l'uso nel batterio di interesse. Per esempio, mini-TN7-KSGFP inserisce nel sito attTn7 del cromosoma, mentre pECM20 inserisce sulla X. nematophila cromosoma per ricombinazione omologa. In alternativa, i plasmidi sono mantenuti pPROBE extrachromosomally, e ogni pPROBE plasmide ha la stessa dorsale e fluoroforo ma hanno differenti marcatori selezionabili o origini di replicazione per consentirne l'impiego in una varietà di contesti tassonomica o mutanti.

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Discussione

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per la rilevazione ottica di batteri all'interno di un host nematode (Figura 1). Questo metodo sfrutta la trasparenza ottica di nematodi e la capacità di etichetta fluorescente batteri, consentendo l'analisi in vivo di batteri all'interno dell'ospite nematode (Figura 3). In particolare, questo approccio identifica localizzazione batterica all'interno del suo ospite. Contando una popolazione di nematodi e scorin...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Lipid Agar (Sterile)			8 grammi di brodo di coltura, 15 grammi di agar, 5 grammi di estratto di lievito, 890 ml di acqua, 10 ml 0,2 g / ml MgCl2. 6H 2 0, 96 ml di sciroppo di mais soluzione *, 4 ml di olio di mais * Mescolare i media versando piastre * Aggiungere ingrediente sterile dopo la sterilizzazione in autoclave
Mais Sciroppo Soluzione (Sterile)			7 ml di sciroppo di mais, 89 ml di acqua mix e autoclave
Egg Solution			16,6 ml di ipoclorito di sodio al 12%, 5 ml KOH 5M, 80 ml di acqua
Lisogenia Brodo (Sterile)			5 grammi di estratto di lievito, 10 triptone grammi, 5 grammi di sale, 1 litro di acqua mix e autoclave
Microcentrifugare	Pescatore	13-100-675	Qualsiasi microcentrifuga che contiene i tubi microcentrifuga funziona
Centrifuga	Beckman	366802	Dimensioni piano centrifuga tabella che contiene 15 ml e 50 ml provette coniche
Sterile 60 mm x 15 millimetri Petri	Pescatore	0875713
50 ml per centrifuga tubi	Pescatore	05-539-6
15 ml per centrifuga tubi	Pescatore	05-531-6
Sterile 100 millimetri x 20 mm Petri	Pescatore	0875711Z	Più profondo rispetto ai normali piastre di Petri
24-pozzetti	Greiner Bio-One	662000-06
Microscopio			Il microscopio ha bisogno di capacità fluorescenti compatibile con il fluoroforo
Paraformaldeide	Scienze della microscopia elettronica	15710
PBS (Sterile)			8 g NaCl 0,2 g KCL 1,44 g di Na 2 HPO 4 0,24 g KH 2 PO 4 1 L di acqua Un pH di 7,4 e acqua a 1 L e autoclave
Provette per microcentrifuga	Pescatore	05-408-138	2 ml o 1.5 ml tubi
Shaker			Qualsiasi shaker che fa sì che il liquido per spostare delicatamente funziona
Acido Diaminopimelic	Sigma	D-1377	Se necessario, integrare i media ad una concentrazione o 1 mM