Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

Resumen

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Resumen

La enfermedad cardiovascular sigue siendo la causa principal de muerte en todo el mundo ^1. Ingeniería de tejidos cardíacos es muy prometedora para entregar los descubrimientos médicos innovadores con los objetivos de desarrollo de tejidos funcionales para la regeneración cardiaca, así como ensayos de cribado in vitro. Sin embargo, la capacidad de crear modelos de alta fidelidad de tejido del corazón ha demostrado ser difícil. Matriz extracelular del corazón (ECM) es una estructura compleja que consta de dos señales bioquímicas y biomecánicas que van desde la micro-a la escala del nanómetro ^2. Local condiciones de carga mecánica y las interacciones célula-ECM han sido recientemente reconocida como componentes vitales en la ingeniería de tejido cardíaco ^3-5.

Una gran parte de la MEC cardiaca se compone de fibras de colágeno alineados con diámetros de nano-escala que influye significativamente en la arquitectura del tejido y el acoplamiento electromecánico ^2. Por desgracia, algunos métodos VHAe sido capaz de imitar la organización de las fibras de ECM a la escala nanométrica. Los recientes avances en las técnicas de nanofabricación, sin embargo, han permitido el diseño y la fabricación de andamios escalables que imitan las señales in vivo de rigidez estructural y del sustrato en del ECM en el corazón ^{de 6-9.}

Aquí se presenta el desarrollo de dos reproducible, procesos nanoestampación escalables para la alineación funcional de las células cardiacas utilizando el poli biocompatible de polímero (láctico-co-glicólico) (PLGA) ⁸ y una de poliuretano (PU) de polímero a base rentable y. Estos sustratos anisotrópicamente nanofabricados (ANF) imitan el ECM subyacente de tejidos, alineados bien organizadas y se puede utilizar para investigar el papel de nanotopografía sobre la morfología celular y la función ^10-14.

El uso de un nanoestructurada (NP) maestro de silicio como una plantilla, un acrilato de poliuretano (PUA) de molde se fabrica. Este molde PUA se utiliza entonces para PAttern hidrogel PU o PLGA mediante UV-asistida o fuerza capilar litografía-solvente mediada (CFL), respectivamente ^15,16. Brevemente, PU o PLGA de pre-polímero es gota dispensado sobre un cubreobjetos de vidrio y el molde PUA se coloca en la parte superior. Para CFL UV asistida, la PU se expone entonces a la radiación UV (λ = 250-400 nm) para el curado. Para disolvente mediada CFL, el PLGA se graba en relieve el uso de calor (120 ° C) y presión (100 kPa). Después del curado, el molde PUA se despega, dejando atrás un ANF para el cultivo celular. Las células primarias, como los miocitos ventriculares de rata neonatal, así como los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes humanas, se pueden mantener en la ANF ^2.

Introducción

La enfermedad cardiovascular es la principal causa de morbilidad y mortalidad en el mundo y presenta una carga socioeconómica de peso en un ^1,17 sistema mundial de salud ya tensas. Ingeniería de tejidos cardíacos tiene dos objetivos distintos: (1) para regenerar el miocardio dañado después de la enfermedad isquémica o miocardiopatía o (2) para crear un modelo de alta fidelidad del corazón para la detección in vitro de drogas o la modelización de enfermedades.

El corazón es un órgano complejo que se debe trabajar constantemente para suministrar sangre al cuerpo. Estructuras laminares densamente poblado de cardiomiocitos y tejidos de soporte están dispuestos en patrones helicoidales a lo largo de la pared del corazón ^18,19. El corazón también se acopla electromecánicamente ²⁰ de una manera muy coordinada para expulsar de manera eficiente la sangre al cuerpo ^21. Varios obstáculos importantes siguen pendientes de resolución, sin embargo, antes de que el intrincado diseño de la naturaleza de forma fiable puede ser recapitulado in vitro.En primer lugar, aunque los métodos de diferenciación de los cardiomiocitos robustos siguen elaborando ^22, HPSC-CM, aún subsisten algunos fenotipos más inmaduros. Sus propiedades electromecánicas y morfología coincide más estrechamente los niveles fetales ^23. En segundo lugar, cuando se mantienen en condiciones de cultivo tradicionales, tanto derivado de células madre y cardiomiocitos primarios logran ensamblarse en estructuras como tejidos nativos. Por el contrario, las células se vuelven orientados al azar y no presentan la apariencia en forma de barra con banda de miocardio adulto ^24.

La matriz (ECM) entorno extracelular con la que interactúan las células juega un papel importante en numerosos procesos celulares ^11,13,25. El ECM consiste en señales moleculares y topográficas complejas, bien definidos que influyen significativamente en la estructura y función de las células ^6,26. Dentro del corazón, alineación celular sigue de cerca las fibras de ECM escala nanométrica subyacente ^2. El impacto de estos nanotopographseñales iCal en la célula y la función del tejido, sin embargo, está lejos de ser completamente entendido. Los estudios preliminares de la interacción célula-biomaterial escala nanométrica indican la importancia potencial y el impacto de sub-micrones señales topográficas para la señalización celular ^27, la adhesión ^28-30, un crecimiento del ^31, y la diferenciación ^32,33. Sin embargo, debido a la dificultad en el desarrollo de sustratos nanofabricados reproducibles y escalables, tales estudios podrían no reproducir los efectos celulares a escala múltiple del complejo ambiente de ECM en vivo. En este protocolo, una técnica de nanofabricación sencillo y rentable para producir andamios de cultivo de células que imitan la alineación de la fibra nativa ECM cardiaca se describe, lo que permite una amplia gama de nuevas investigaciones de las interacciones-cardiomiocitos biomaterial. La comprensión de cómo los cardiomiocitos interactúan con el ambiente de ECM nanoescala podría permitir la capacidad de controlar el comportamiento celular para reproducir con mayor fidelidad función tejido nativoción. Por otra parte, las monocapas celulares son un sistema experimental simplificado en comparación con las estructuras en 3D, pero todavía exhiben un comportamiento multicelular complejo para investigaciones profundas y selección funcional ^2,34-36. Finalmente, tales andamios se podrían utilizar para mejorar la función celular del injerto cuando se implanta en el corazón para propósitos de regeneración ^37.

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Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente (~ 23 ° C) a menos que se indique lo contrario.

1. Fabricación de Silicon Maestro

1. Limpio oblea de silicio con etanol al 100% o xileno y se seca a O ₂ / N ₂ de gas.
2. Coloque oblea de silicio en Spin-revestidor a velocidades de rotación de 2.000-4.000 rpm para producir una película de espesor de 0,3-0,5 micras.
3. Patrón de la película fotorresistente con las dimensiones correctas mediante el uso de un sistema de fotolitografía
4. Sumergir completamente las obleas de silicio fotorresistentes recubiertos con dibujos en un volumen apropiado de solución fotosensible en desarrollo.
5. Enjuague las obleas de silicio recubiertas de resina fotosensible desarrollados con agua desionizada.
6. Para formar conjuntos de crestas escala inferior a la micra con paredes laterales casi verticales, profundidad de grabado iónico reactivo del silicio expuesta mediante un sistema de grabado.
7. Retire el fotoprotector restante mediante la colocación de la oblea de silicio en un sistema de Asher de plasma.
8. Cortar el silicio wAfers con un cortador de punta de diamante en los amos de silicio de tamaño adecuado para el moldeo réplica posterior.

2. Fabricación de PUA Molde de Silicon Maestro

Nota: Volumen para ser añadido a maestro de silicio para la nanofabricación variará dependiendo de la zona del maestro nanoestructurada a ser replicado, así como la viscosidad de la solución de acrilato de poliuretano (PUA).

1. Limpie la superficie de maestro de silicio con 100% de etanol o xileno y seco bajo O ₂ / N ₂ gas.
2. Coloque el lado patrón maestro de silicio en una placa de Petri.
3. Para un maestro de silicio con unos 2 cm x 2 cm de superficie, patrón de la pipeta 40 l de PUA a la superficie de diseño.
4. Coloque una hoja de 4 cm x 4 cm de poliéster (PET) de la película transparente sobre la PUA dispensado.
5. Presione hacia abajo sobre la lámina de PET y se extendió la PUA debajo de la hoja a través de la cara patrón usando un rodillo o una superficie plana filo (tal como una tarjeta) de modo que la totalidadpatrón está cubierto por el prepolímero PUA.
6. Coloque maestro de silicio, prepolímero, y PET de aproximadamente 10 cm por debajo de una luz de 20 vatios (115 V) UV (λ = 365 nm) durante 50 seg. Para ser efectiva, la longitud de onda de la luz UV puede ser en cualquier lugar entre 310-400 nm. La intensidad de la luz es de 10-15 mW / cm ² en la superficie del sustrato.
7. Después del curado, retire la película de PET lentamente con fórceps. PUA debe adjuntar a la película de PET con un negativo de la maestra nanopattern silicio.
8. Curar nanopatterns PUA / PET bajo UV durante al menos 12 horas antes de su uso. La exposición excesiva no es un problema.
9. Para limpiar los maestros de silicio, coloque otra película de PET en la parte superior del maestro sin la adición de PUA y exponer a la luz UV (λ = 365 nm) durante 50 segundos y retirar la película de PET. Esto eliminará cualquier monómero sin reaccionar.
10. Enjuague maestro de silicio con 100% de etanol o xileno y seco bajo O ₂ / N ₂ gas.

3a. Polímero de poliuretano nanoestampación

1. Preparar 25 mm de diámetro portaobjetos de vidrio circulares colocando en una cámara de tratamiento de ozono durante 10 min.
2. Coloque los portaobjetos de vidrio tratadas con ozono a un pequeño bloque de PDMS para un fácil manejo.
3. Aplique una capa delgada de la superficie de promotor de adhesión con la brocha a portaobjetos de vidrio. Aire portaobjetos de vidrio seco durante 30 min.
4. Coloque la placa de vidrio sobre un pedazo de papel de la impresora.
5. Gota dispensar 10 l de poliuretano (PU) de pre-polímero (NOA 76) hacia el centro de portaobjetos de vidrio. Asegúrese de que no hay burbujas después de la adición.
6. Molde Place PUA, patrón boca abajo, sobre el portaobjetos de vidrio. Dispersar la PU de manera uniforme en toda la superficie de la lámina de vidrio rodando un rodillo de cilindro de caucho a lo largo del molde PUA. Papel de impresora absorberá desbordamiento polímero.
7. Lámpara UV Watt. El tiempo de polimerización de la PU es dependiente de la energía de la fuente de UV.
8. Retire la muestra de la fuente de luz UV y pelar cuidadosamente el molde PUA de portaobjetos de vidrio con revestimiento de poliuretano. La polimerización de la PU se considera completa cuando el molde cáscaras PUA limpiamente lejos de la muestra y el portaobjetos de vidrio de la PU tiene un aspecto iridiscente.
9. Coloque las muestras de acabados en desecador para almacenarlo durante todo el tiempo como un mes.

3b. Nanoestampación poli (lactida-co-glicolida) Hidrogel

1. Crear un molde de PDMS plana mezclando vigorosamente base de elastómero de silicona y silicona agente de curado de elastómero en una proporción de 10:1.
2. Pour PDMS mixtos precursor de solución en una placa de Petri de modo que el precursor de PDMS llega a 5 mm hasta el borde del plato (es decir, de modo que el PDMS es 5 mm de espesor).
3. Coloque el plato de Petri y PDMS precursor en un desecador durante 1 hora para desgasificar.
4. Mueva placa de Petri y PDMS precursor en un horno de 65 ° C durante al menos 2 horas para curar.
5. Después de PDMS es curado, utilizar una navaja de afeitar para cortar el PDMS planas en 3 cm x 3 cm secciones cuadradas. Estos serán los moldes de PDMS planas utilizadas más adelante en el proceso de modelado.
6. Clean diámetro 25 mm portaobjetos de vidrio circular por plsobresalir en alcohol isopropílico durante 30 minutos en un sonicador de agua.
7. Diapositivas lavados en seco de vidrio bajo O ₂ / N ₂ gas.
8. Gota dispensar 100 l de solución de PLGA (15% w / v de PLGA en cloroformo) en portaobjetos de vidrio.
9. Coloque un molde de PDMS plana en la parte superior de la dispensado de PLGA para absorber el disolvente y obtener una superficie plana de PLGA. Aplique una ligera presión (~ 10 kPa) mediante la colocación de un peso de 200 g en la parte superior de los PDMS durante 5 min.
10. Lentamente retire del molde de PDMS plana y colocar el vidrio de cubierta en una placa precalentado (120 ° C) durante 5 min para eliminar el disolvente residual y aumentar la adhesión entre el PLGA y el vidrio de cubierta.
11. Coloque el molde NP PUA en la parte superior de la plana de PLGA y aplicar presión constante (~ 100 kPa) y calor (120 ° C) mediante la colocación de un peso de 1 kg en la parte superior del molde PUA, mientras que en la placa de calentamiento durante 15 min.
12. Retire el peso de PLGA tapa deslizante y deje que el sustrato se enfríe a temperatura ambiente. No quitar el moho PUA hasta los sustratos han sidoenfriado.
13. Una vez que los sustratos se hayan enfriado lo suficiente, cuidado, retire el molde NP PUA, revelando el sustrato NP PLGA. El sustrato NP PLGA debe tener un aspecto iridiscente.
14. Coloque las muestras de acabados en desecador para almacenarlo durante todo el tiempo como un mes.

4. Siembra de células y Cultura

NOTA: Este protocolo describe la cultura de los miocitos ventriculares de rata neonatal (NRVMs) y cardiomiocitos H7 humanos madre embrionarias de células derivadas de células madre (CMS), pero otras fuentes de células puede ser utilizado.

1. Coloque el cubreobjetos ANF (PU o PLGA) a un 35 mm de cultivo de tejidos plato de poliestireno. Pipetear 20 l de Norland Optical Adhesive (NOA83H) a la parte inferior del plato y coloque suavemente el cubreobjetos ANF sobre el NOA. Deje que el pegamento hacia fuera y cubre toda la parte inferior cubreobjetos. Curar NOA exponiendo plato a los rayos UV durante 10 min.
2. Esterilizar ANF mediante aclarado con 2 ml de solución acuosa de etanol al 70% durante 5 minutos, dos veces. Retire eTHANOL por aspiración. Permitir ANF se seque por completo el aire durante aproximadamente 1 hora bajo la lámpara de esterilización UV (λ = 200-290 nm) en la cabina de seguridad biológica.
3. La adhesión celular se ve reforzada por el recubrimiento de la ANF en fibronectina durante la noche. Diluir la fibronectina en agua DI a 5 g / ml. Pipeta 2 ml de solución de fibronectina en el plato. Coloque en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante la noche (por lo menos 6 horas).
4. Obtener NRVMs, hESC-CM, u otras células cardiacas de interés de acuerdo con los protocolos anteriores ^22.
5. Muestra de células Centrifugar a 1000 rpm durante 3 min para sedimentar las células.
6. Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento.
7. Resuspender las células en medios de cultivo apropiados a una concentración de 4,6 x 10 ⁶ células / ml.
8. Cuidadoso pipeteado 200 l de suspensión celular a ANF esterilizados. Asegúrese de que la suspensión de células se mantiene en el cubreobjetos.
9. Coloque las células en una incubadora a 37 ° C y 5%CO ₂ durante 4 horas para permitir que las células se unan a la ANF.
10. Añadir 2 ml de medio de cultivo caliente al plato y reemplazar las células en una incubadora en las mismas condiciones.
11. Después de 24 horas, retirar el medio y lavar con 2 ml de DPBS dos veces para eliminar el exceso de células.
12. Añadir 2 ml de medio de cultivo caliente al plato y reemplazar las células en una incubadora en las mismas condiciones. Cultivar las células hasta confluencia. Vuelva a colocar los medios de comunicación todos los días.

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Resultados

La figura 1 es una vista general esquemática del proceso de producción para los dos métodos de fabricación. Debido a la difracción de la luz causada por la topografía a escala nanométrica, nanoestampación debe resultar en una superficie iridiscente a la ANF. Figura 2 representa esta superficie iridiscente en un 25 mm NP-PU cubreobjetos bien modelada (Figura 2A) con cresta 800 nm y la ranura ancho (Figura 2B). El aspecto iridiscente de la ANF var...

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Discusión

Tejidos cardíacos Funcionalmente maduros carecen de tanto in vivo como in vitro en aplicaciones de ingeniería de tejido cardíaco. Los métodos de nanofabricación CFL descritos aquí son técnicas robustas para lograr la alineación celular e influir en la función del tejido macroscópico debido a la escalabilidad del sistema. Grandes áreas pueden ser fácilmente modelados y se utilizan para el cultivo de células. Alineación celular macroscópico es esencial en la ingeniería de tejido cardiaco con el fi...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin	BD Biosciences	354008
NOA 76	Norland Products, Inc.	7606B
Surface Adhesion Promotor (Glass Primer)	Minuta Tech
PUA	Minuta Tech	MINS-311RM
Soft Rubber Roller	Speedball
Silicon Wafers	NOVA Electronic Materials	FA01-9900
Photoresist	Shipley	SPRT510
Photoresist Developer	Shipley	MF320
Electron-Beam Lithography System	JEOL	JBX-9300FS
Etching System	Surface Technology Systems	NP10 8UJ
Plasma Asher System	BMR Technology Co.	DSF-200
Ozone Cure System	Minuta Tech	MT-UV-O- 08
Fusion Cure System	Minuta Tech	MT-UV-A 11
NOA 83H	Norland Products, Inc.	8301
Spin Coater	Laurel Technology	WS-400-6NPP
Skyrol PET Film	SKC Co., Ltd.	23038-59-9
25 mm Glass Slides	Corning	2948
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	6/5/2553
Poly(D,L-lactide-co-glycolide)	Sigma-Aldrich	P2191-1G
Chloroform	Sigma-Aldrich	372978-1L
500 g Weights	Global Insustrial	T9FB503120
Isopropyl Alcohol	EMD Millipore	PX1835-2
Hot Plate	Corning	PC-420D
Sonicator	Branson	B2510MTH