Capillaire de travail lithographie pour l'ingénierie tissulaire cardiaque

Résumé

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Résumé

Les maladies cardiovasculaires demeurent la principale cause de décès dans le monde ^1. L'ingénierie tissulaire cardiaque est très prometteur pour livrer découvertes médicales révolutionnaires avec les objectifs de développement de tissus fonctionnels pour la régénération cardiaque ainsi que des tests de dépistage in vitro. Cependant, la capacité de créer des modèles haute-fidélité de tissu cardiaque s'est avéré difficile. Matrice extracellulaire du cœur (ECM) est une structure complexe composée de deux signaux biochimiques et biomécaniques allant de la micro à l'échelle du nanomètre ^2. Les conditions locales de chargement mécanique et les interactions cellule-ECM ont été récemment reconnus comme des composantes essentielles de l'ingénierie du tissu cardiaque ^3-5.

Une grande partie de l'ECM cardiaque est composé de fibres de collagène alignées avec des diamètres à l'échelle nanométrique, qui influe de manière significative l'architecture tissulaire et de couplage électromécanique ^2. Malheureusement, peu de méthodes VHAe été capable d'imiter l'organisation des fibres de l'ECM vers le bas à l'échelle du nanomètre. Les récents progrès dans les techniques de nanofabrication, cependant, ont permis la conception et la fabrication d'échafaudages évolutifs qui imitent les indices de rigidité vivo dans structurelles et substrat de l'ECM dans le coeur ^6-9.

Nous présentons ici le développement de deux reproductible, les processus de nanostructuration évolutives pour l'alignement fonctionnel des cellules cardiaques en utilisant le poly biocompatible de polymère (lactide-co-glycolide) (PLGA) ⁸ et un polyuréthane (PU) polymère à base de coût-efficacité, et. Ces substrats anisotrope nanofabricated (ANF) imitent l'ECM sous-jacente de bien organisées, tissus alignés et peut être utilisé pour étudier le rôle de nanotopographie sur la morphologie et la fonction cellulaire ^10-14.

L'utilisation d'un nanostructurés (NP) maître de silicium comme un modèle, un acrylate de polyuréthane (PUA) moule est fabriqué. Ce moule de PUA est ensuite utilisé pour pattern l'hydrogel PU ou PLGA via, assistée UV ou force capillaire solvant médiation lithographie (CFL), respectivement ^15,16. En bref, PU ou PLGA pré-polymère est goutte distribuée sur une lamelle de verre et le moule PUA est placé sur le dessus. Pour assistée par UV LCF, l'unité centrale est ensuite exposée à un rayonnement UV (λ = 250 à 400 nm) pour le durcissement. Pour solvant médiation de la LCF, la PLGA est gravé en utilisant la chaleur (120 ° C) et de pression (100 kPa). Après durcissement, le moule PUA est décollée, laissant derrière lui un ANF pour la culture cellulaire. Les cellules primaires, tels que néonatales myocytes ventriculaires de rats, ainsi que les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines, peuvent être maintenus sur le ANF ^2.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde et de présenter un fardeau socio-économique de poids sur un ^1,17 de système de santé mondial déjà tendu. L'ingénierie tissulaire cardiaque a deux objectifs distincts: (1) pour régénérer le myocarde endommagé après une maladie ischémique ou d'une cardiomyopathie ou (2) pour créer un modèle de haute fidélité de cœur pour criblage in vitro de la drogue ou de la modélisation de la maladie.

Le cœur est un organe complexe qui doit travailler constamment à fournir sang dans le corps. Structures laminaires denses de cardiomyocytes et de tissus de soutien sont disposés dans les modèles hélicoïdaux tout au long de la paroi du coeur ^18,19. Le cœur est également électromécanique couplé ²⁰ de manière très coordonnée pour éjecter efficacement le sang dans le corps ^21. Plusieurs obstacles majeurs restent à relever, cependant, avant la conception complexe de la nature peut être récapitulé de manière fiable in vitro.Tout d'abord, bien que les méthodes de différenciation des cardiomyocytes solides continuent à être développés ^22, HPSC-CM exposer encore phénotypes plutôt immatures. Leurs propriétés électromécaniques et morphologie correspondent plus étroitement les niveaux foetus ^23. Deuxièmement, lorsqu'il est conservé dans des conditions de culture traditionnelle, à la fois des cellules souches dérivées et cardiomyocytes primaires ne parviennent pas à monter dans les structures indigènes, tissus, etc. Au contraire, les cellules deviennent orientés de façon aléatoire et ne présentent pas l'aspect en forme de tige bandes de myocarde adulte ^24.

La matrice (ECM) environnement extracellulaire avec laquelle les cellules interagissent joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires ^11,13,25. L'ECM est constitué de signaux moléculaires et topographiques complexes, bien définis qui influencent de manière significative la structure et la fonction des cellules ^6,26. Dans le coeur, l'alignement cellulaire suit de près les fibres d'ECM à l'échelle du nanomètre sous-jacente ^2. L'impact de ces nanotopographindices iCal sur la fonction cellulaire et tissulaire, cependant, est loin d'être entièrement comprise. Des études préliminaires de l'interaction cellule-biomatériau échelle nanométrique indiquent l'importance et l'impact potentiel de sous-micron repères topographiques pour la signalisation ²⁷ cellulaire, l'adhérence ^28-30, une croissance de ^31, et la différenciation ^32,33. Toutefois, en raison de la difficulté à développer des substrats nanofabricated reproductibles et évolutives, ces études n'ont pas pu reproduire les effets cellulaires multi-échelle du complexe dans un environnement ECM vivo. Dans ce protocole, une technique de nano-fabrication simple et rentable à produire des échafaudages de culture cellulaire mimant l'alignement des fibres de l'ECM cardiaque native est décrite, ce qui permet une large gamme de nouvelles recherches sur les interactions des cardiomyocytes biomatériau. Comprendre comment les cardiomyocytes interagissent avec l'environnement ECM à l'échelle nanométrique pourrait permettre la possibilité de contrôler le comportement cellulaire de plus simulent étroitement la fonction de tissu natiftion. En outre, des monocouches de cellules sont un système expérimental simplifié par rapport à des structures 3D, mais encore ont un comportement multi-cellulaire complexe pour les enquêtes pertinentes et criblage fonctionnel ^2,34-36. Enfin, ces échafaudages pourraient être utilisés pour améliorer la fonction du greffon cellulaire lorsqu'ils sont implantés dans le cœur des fins de régénération ^37.

Protocole

Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante (~ 23 ° C) sauf indication contraire.

1. Fabrication de la Silicon Maître

1. Tranche de silicium propre avec 100% d'éthanol ou le xylène et sèche sous O ₂ / N ₂ gazeux.
2. Placez la tranche de silicium en spin-coucheuse à des vitesses de rotation de 2,000-4,000 rpm pour produire un film épais de 0,3-0,5 um.
3. Motif de la pellicule de résine photosensible avec les bonnes dimensions en utilisant un système de photolithographie
4. Immerger complètement les tranches de silicium revêtues de résine photosensible à motifs dans un volume approprié de solution de résine photosensible en développement.
5. Rincer les tranches de silicium revêtues de résine photosensible développé avec de l'eau désionisée.
6. À former des réseaux de sous-micron avec des crêtes d'échelle près des parois latérales verticales, profondeur de gravure par ions réactifs, le silicium exposé en utilisant un système de gravure.
7. Retirer la résine photosensible restante en plaçant la tranche de silicium dans un système de calcinateur à plasma.
8. Couper le silicium wAfers avec un couteau dans les maîtres de silicium de taille appropriée diamanté pour réplique ultérieure moulage.

2. Fabrication de PUA moule de la Silicon Maître

NOTE: Volume à ajouter au maître de silicium pour nanofabrication sera variable en fonction de la zone du maître nanostructurés à répliquer aussi bien que la viscosité de l'acrylate de polyuréthane (PUA) de solution.

1. Nettoyer la surface principale de silicium avec 100% d'éthanol ou le xylène et sèche sous O ₂ / N ₂ gazeux.
2. Placer le côté maître de modèle de silicium dans une boîte de Pétri.
3. Pour un maître de silicium avec un 2 cm x 2 cm de motif de surface, la pipette 40 ul de PUA à la surface du motif.
4. Placez une feuille de 4 cm x 4 cm transparent polyester (PET) sur la PUA distribué.
5. Appuyez sur la feuille de PET et de propager la PUA dessous de la feuille sur la face de motif en utilisant un rouleau ou une surface plane tranchant (par exemple une carte) de sorte que l'ensemble demotif est couvert par le prépolymère PUA.
6. Placez maître de silicium, prépolymère, et PET environ 10 cm au-dessous d'une lumière de 20 watts (115 V) UV (λ = 365 nm) pendant 50 sec. Pour être efficace, la longueur d'onde de la lumière UV peut être n'importe où entre 310-400 nm. L'intensité de la lumière est de 10 à 15 mW / cm ² à la surface du substrat.
7. Après durcissement, retirer le film PET lentement avec une pince. PUA doit être fixé au film de PET avec un négatif du maître nanopattern de silicium.
8. Cure nanomotifs PUA / PET sous UV pendant au moins 12 heures avant de l'utiliser. Surexposition n'est pas un problème.
9. Pour nettoyer maîtres de silicium, placez un autre film de PET sur le dessus du maître sans l'ajout de PUA et exposer à la lumière UV (λ = 365 nm) pendant 50 sec et retirer le film PET. Cela permettra d'éliminer tous les monomères n'ayant pas réagi.
10. Rincer maître de silicium avec 100% d'éthanol ou le xylène et sèche sous O ₂ / N ₂ gazeux.

3a. Polymère polyuréthane Nanopatterning

1. Préparer des lames de verre de 25 mm de diamètre de cercle en plaçant dans une chambre de traitement à l'ozone pendant 10 min.
2. Placez les lames de verre traités à l'ozone sur petit bloc de PDMS pour une manipulation facile.
3. Appliquer une fine couche de surface d'adhérence avec le pinceau sur des lames de verre. Air lames de verre sèches pour 30 min.
4. Placer la lame de verre sur une feuille de papier de l'imprimante.
5. Déposez distribuer 10 ul de polyuréthane (PU) de pré-polymère (NOA 76) au centre de la lame de verre. Assurez-vous qu'aucun des bulles sont présentes après l'addition.
6. Lieu PUA moule, modèle face vers le bas, sur la lame de verre. Disperser uniformément à travers l'unité centrale de la surface de la lame de verre en faisant rouler un rouleau de cylindre de caoutchouc le long du moule PUA. papier de l'imprimante va absorber trop-plein de polymère.
7. Lampe UV Watt. Le temps de polymérisation de l'unité centrale est reliée à la puissance de la source d'UV.
8. Retirer l'échantillon de la source de lumière UV et détachez soigneusement le moule de PUA de lame de verre enduit PU. Polymérisation du PU est considéré cemplissez lorsque les moules pelures PUA proprement loin de l'échantillon et la lame de verre PU a un aspect irisé.
9. Placer les échantillons finis dans le dessiccateur pour le stockage, aussi longtemps que un mois.

3b. Nanopatterning poly (lactide-co-glycolide) Hydrogel

1. Créez un moule PDMS plat en mélangeant vigoureusement silicone base élastomère et d'élastomère de silicone agent de durcissement dans un rapport de 10:1.
2. Verser le mélange PDMS précurseur solution dans une boîte de Petri de sorte que le précurseur PDMS atteint jusqu'à 5 mm du bord de la cuvette (à savoir de telle sorte que le PDMS est de 5 mm d'épaisseur).
3. Placez boîte de Pétri et précurseur PDMS dans un dessiccateur pendant 1 h à dégazer.
4. Déplacez boîte de Pétri et précurseur PDMS dans une étuve à 65 ° C pendant au moins 2 heures pour guérir.
5. Après PDMS est guéri, utiliser un rasoir pour couper les PDMS plat en 3 cm x 3 cm de sections carrés. Ce seront les PDMS plat moules utilisés plus tard dans le processus de structuration.
6. Diamètre 25 mm propre lames de verre circulaire de placing dans de l'alcool isopropylique pendant 30 minutes dans un sonicateur de l'eau.
7. Diapositives nettoyés à sec de verre sous O ₂ / N ₂ gaz.
8. Déposer dispenser 100 pi de solution de PLGA (15% m / v dans du chloroforme PLGA) sur lame de verre.
9. Placez un moule PDMS plat sur le dessus de la PLGA Dispensé d'absorber le solvant et obtenir une surface plane PLGA. Appliquer une légère pression (~ 10 kPa) en plaçant un poids de 200 g au-dessus des PDMS pendant 5 min.
10. Lentement décoller moule PDMS plat et placez le couvercle en verre sur une plaque préchauffé (120 ° C) pendant 5 minutes pour éliminer le solvant résiduel et augmenter l'adhérence entre le PLGA et le couvercle en verre.
11. Placer le moule NP PUA sur le dessus de la plate PLGA et appliquer une pression constante (~ 100 kPa) et la chaleur (120 ° C) en plaçant un poids de 1 kg sur le dessus du moule PUA tandis que sur la plaque chauffante pendant 15 minutes.
12. Retirez le poids de PLGA couvercle coulissant et laisser le substrat refroidir à température ambiante. Ne retirez pas PUA moule jusqu'à ce que les substrats ont étérefroidi.
13. Une fois les substrats ont suffisamment refroidi, soigneusement décoller le moule NP PUA, révélant le substrat NP PLGA. Le substrat NP PLGA doit avoir un aspect irisé.
14. Placer les échantillons finis dans le dessiccateur pour le stockage, aussi longtemps que un mois.

4. L'ensemencement des cellules et de la culture

NOTE: Ce protocole décrit la culture de néonatales myocytes ventriculaires de rat (NRVMs) et cardiomyocytes H7 souches embryonnaires humaines dérivées de cellules (CSEh-CM), mais d'autres sources de cellules peuvent être utilisés.

1. Fixez les lamelles ANF (PU ou PLGA) à une culture de tissus boîte en polystyrène de 35 mm. Pipette 20 ul de Norland Optical Adhesive (NOA83H) au fond de la boîte et placez doucement la lamelle ANF sur le dessus de l'ANP. Laissez la colle étalée et couvrir le fond de la lamelle entière. Cure NOA en exposant plat aux UV pendant 10 min.
2. Stériliser ANF par rinçage avec 2 ml de solution à 70% d'éthanol aqueux pendant 5 minutes, deux fois. Retirez eTHANOL par aspiration. Laisser sécher complètement ANF d'air pour ~ 1 h sous la lampe de stérilisation UV (λ = 200-290 nm) dans l'enceinte de sécurité biologique.
3. L'adhésion cellulaire est renforcée par le revêtement de la ANF dans fibronectine nuit. Diluer la fibronectine dans l'eau DI à 5 pg / ml. Pipette 2 ml de solution de fibronectine dans le plat. Placer dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant la nuit (au moins 6 heures).
4. Obtenir NRVMs, CSEh-GC, ou d'autres cellules cardiaques d'intérêt selon des protocoles précédents ^22.
5. Centrifugeuse échantillon de cellules à 1000 rpm pendant 3 min pour sédimenter les cellules.
6. Retirez délicatement le surnageant par aspiration. Assurez-vous de ne pas perturber le culot.
7. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de culture approprié à une concentration de 4,6 x 10 ⁶ cellules / ml.
8. Pipetage soigneux 200 pi de suspension cellulaire sur ANF stérilisés. Assurez-vous que la suspension cellulaire reste sur la lamelle.
9. Placer les cellules dans l'incubateur à 37 ° C et 5%CO ₂ pendant 4 heures pour permettre aux cellules de se fixer à ANF.
10. Ajouter 2 ml de milieux de culture chaud à plat et remplacer les cellules dans l'incubateur dans les mêmes conditions.
11. Après 24 heures, retirer les supports et les laver avec 2 ml de DPBS deux fois pour éliminer les cellules excédentaires.
12. Ajouter 2 ml de milieux de culture chaud à plat et remplacer les cellules dans l'incubateur dans les mêmes conditions. Culture des cellules à confluence. Remplacer médias tous les jours.

Résultats

La figure 1 est une vue d'ensemble schématique du procédé de production pour les deux procédés de fabrication. En raison de la diffraction de la lumière causée par la topographie à l'échelle nanométrique, la nanostructuration devrait se traduire par une surface irisée au ANF. Figure 2 représente cette surface irisée sur un 25 mm NP-PU lamelle bien modelé (figure 2A) avec crête de 800 nm et la gorge largeur (figure 2B). L'aspec...

Discussion

Tissus cardiaques fonctionnellement matures font défaut à la fois in vivo et in vitro dans des applications de l'ingénierie de tissu cardiaque. Les méthodes de nanofabrication de la LCF décrits ici sont des techniques fiables pour la réalisation de l'alignement cellulaire et d'influencer la fonction des tissus macroscopique en raison de l'évolutivité du système. De vastes zones peuvent être facilement modelé et utilisés pour la culture cellulaire. Alignement cellula...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin	BD Biosciences	354008
NOA 76	Norland Products, Inc.	7606B
Surface Adhesion Promotor (Glass Primer)	Minuta Tech
PUA	Minuta Tech	MINS-311RM
Soft Rubber Roller	Speedball
Silicon Wafers	NOVA Electronic Materials	FA01-9900
Photoresist	Shipley	SPRT510
Photoresist Developer	Shipley	MF320
Electron-Beam Lithography System	JEOL	JBX-9300FS
Etching System	Surface Technology Systems	NP10 8UJ
Plasma Asher System	BMR Technology Co.	DSF-200
Ozone Cure System	Minuta Tech	MT-UV-O- 08
Fusion Cure System	Minuta Tech	MT-UV-A 11
NOA 83H	Norland Products, Inc.	8301
Spin Coater	Laurel Technology	WS-400-6NPP
Skyrol PET Film	SKC Co., Ltd.	23038-59-9
25 mm Glass Slides	Corning	2948
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	6/5/2553
Poly(D,L-lactide-co-glycolide)	Sigma-Aldrich	P2191-1G
Chloroform	Sigma-Aldrich	372978-1L
500 g Weights	Global Insustrial	T9FB503120
Isopropyl Alcohol	EMD Millipore	PX1835-2
Hot Plate	Corning	PC-420D
Sonicator	Branson	B2510MTH