נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

Summary

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Abstract

מחלות לב וכלי דם נשארת הגורם המוביל למוות בכל העולם ^1. הנדסת רקמות לב טומנת בחובו הבטחה רבה כדי לספק תגליות רפואיות פורצות עם המטרות של פיתוח רקמות פונקציונליות להתחדשות לב, כמו גם מבחני מיון במבחנה. עם זאת, את היכולת ליצור מודלים באיכות גבוהה של רקמת לב הוכיחה קשה. של הלב מטריצה ​​תאית (ECM) היא מבנה מורכב בהיקף של שני האותות ביוכימיים ויומכנית החל מיקרו לקנה המידה ננומטרי ^2. לאחרונה מקומי תנאי העמסה מכאנית ואינטראקציות התא-ECM הוכרו כמרכיב חיוני בהנדסת רקמות לב ^3-5.

חלק גדול מECM הלב מורכב של סיבי קולגן מיושרים עם קטרים ​​בקנה מידה ננו שמשפיע על מבנה רקמה וצימוד אלקטרו ² באופן משמעותי. למרבה הצער, כמה שיטות havהיה דואר מסוגל לחקות את הארגון של סיבי ECM עד לקנה המידה ננומטרי. הפיתוחים אחרונים בטכניקות nanofabrication, לעומת זאת, מאפשרים לעיצוב וייצור של פיגומי מדרגי המחקים את in vivo רמזי קשיחות מבניים ומצע של ECM בלב ^6-9.

כאן אנו מציגים את הפיתוח של שני לשחזור, חסכוני, ותהליכי nanopatterning להרחבה עבור היישור התפקודי של תאי לב באמצעות פולי ביולוגית הפולימר (lactide-co-glycolide) (PLGA) ⁸ ופוליאוריטן (PU) פולימר מבוסס. מצע nanofabricated anisotropically אלה (ANFS) לחקות את ECM הבסיסי של רקמות מאורגנות היטב, מיושרות והוא יכול לשמש כדי לחקור את תפקידה של nanotopography על מורפולוגיה תא ותפקודו ^10-14.

באמצעות אב סיליקון nanopatterned (NP) כתבנית, עובש acrylate פוליאוריטן (רשות החשמל) הוא מפוברק. עובש רשות החשמל זה משמש לאחר מכן לרשותttern הידרוג'ל PU או PLGA באמצעות סיוע UV או ליתוגרפיה בתיווך ממס כוח הנימים (CFL), בהתאמה ^15,16. בקצרה, PU או PLGA מראש פולימר הוא טיפה לוותר על coverslip זכוכית ועובש רשות החשמל מונח על גבי. לCFL בסיוע UV, PU מכן נחשף לקרינת UV (λ = 250-400 ננומטר) לריפוי. לCFL בתיווך ממס, PLGA מוטבע באמצעות חום (120 מעלות צלזיוס) ולחץ (100 kPa). לאחר הריפוי, עובש רשות החשמל הוא קילף, והשאיר מאחורי ANFS לתרבית תאים. תאים ראשוניים, כגון myocytes ילוד חדרית העכברוש, כמו גם שריר לב שמקורם בתאים אנושי pluripotent גזע, יכולים להישמר בANFS ^2.

Introduction

מחלות לב וכלי דם היא הסיבה המובילה לתחלואה ותמותה בעולם ולהציג את נטל כלכלי וחברתי כבדות משקל על ^1,17 מערכת הבריאות העולמי מתוח כבר. יש הנדסת רקמות לב שתי מטרות נפרדות: (1) כדי להתחדש שריר הלב פגוע לאחר מחלה או קרדיומיופתיה איסכמית או (2) ליצור מודל נאמנות גבוה של הלב במבחנת הקרנת סמים או דוגמנות מחלה.

הלב הוא איבר מורכב שחייבים לעבוד כדי לספק דם לגוף כל הזמן. מבני מינרית בצפיפות של שריר לב ורקמות התומכות מסודרים בדפוסי סליל לאורך קיר לב ^18,19. הלב הוא גם בשילוב Electromechanically ²⁰ באופן מתואם מאוד כדי להוציא דם בצורה יעילה לגוף ^21. כמה מכשולים עיקריים יישארו לטפל, עם זאת, לפני העיצוב המורכב של הטבע יכול להיות סכם באופן מהימן במבחנה.ראשית, למרות ששיטות בידול cardiomyocyte חזקות תמשיך להיות מפותחות ^22, hPSC-CMS עדיין תערוכת פנוטיפים ולא בשלה. מאפייני אלקטרו והמורפולוגיה להתאים באופן הדוק ביותר רמות עובריות ^23. שנית, כאשר כל הזמן בתנאי תרבות מסורתיים, שניהם נגזרים תאי הגזע ושריר לב עיקרי לא יצליחו להרכיב למבני ילידים, כמו רקמות. במקום זאת, התאים הופכים לכיוון אקראי ואינו מציגים את המראה בצורת המוט התאגדו של שריר הלב מבוגר ^24.

הסביבה תאית מטריקס (ECM) שבה תאי אינטראקציה משחקת תפקיד משמעותי בתהליכים תאיים רבים ^11,13,25. ECM מורכב מרמזים מורכבים, מוגדרים היטב מולקולריים וטופוגרפיים המשפיעים על המבנה ותפקוד של תאים ^6,26 באופן משמעותי. בתוך הלב, יישור סלולארי עוקב מקרוב סיבי ECM קנה מידה ננומטרי הבסיסית ^2. ההשפעה של nanotopograph אלהרמזי iCal בתא ותפקוד רקמות, עם זאת, הוא רחוק מלהיות מובן לחלוטין. מחקרים ראשוניים של אינטראקציה תא ביולוגי בקנה מידה ננומטרי לציין את החשיבות הפוטנציאלית ואת ההשפעה של רמזים טופוגרפיים תת מיקרון לתא איתות ^27, הידבקות ^{28-30, 31 בצמיחה,} ובידול ^32,33. עם זאת, בשל הקושי בפיתוח מצעי nanofabricated לשעתק וניתן להרחבה, מחקרים כאלה לא יכולים לשחזר את ההשפעות סלולריות רב היקף של המתחם בסביבת ECM vivo. בפרוטוקול זה, טכניקת nanofabrication פשוטה וחסכונית כדי לייצר פיגומי תרבית תאים מחקה יישור ECM לב סיבי ילידים מתואר, המאפשרת מגוון רחב של חקירות רומן של אינטראקציות cardiomyocyte-ביולוגי. הבנה כיצד שריר לב באינטראקציה עם סביבת ECM ננו עלולה לאפשר את היכולת לשלוט בהתנהגות סלולרית באופן הדוק יותר לחקות תפקוד רקמת ילידtion. יתר על כן, monolayers התא הוא מערכת ניסיונית פשוטה בהשוואה למבני 3D, אך עדיין מפגין התנהגות רב תאית מורכבת לחקירות מעמיקות והקרנה פונקציונלית ^2,34-36. לבסוף, יכולים לשמש פיגומים כאלה כדי לשפר את תפקוד שתל סלולארי כאשר מושתלים לתוך הלב למטרות משובי ^37.

Protocol

כל הפעולות מבוצעות בטמפרטורת חדר (~ 23 ° C) אלא אם צוינו אחרת.

1. ייצור של הסיליקון מאסטר

1. פרוסות סיליקון נקיות עם 100% אתנול או קסילן ויבש תחת O ₂ / N ₂ גז.
2. מניחים פרוסה סיליקון בספין coater במהירויות סיבוב של 2,000-4,000 סל"ד כדי לייצר סרט עבה 0.3-0.5 מיקרומטר.
3. תבנית סרט photoresist עם המידות הנכונות באמצעות מערכת photolithography
4. באופן מלא לטבול את פרוסות סיליקון מצופה photoresist דוגמת בנפח מתאים של פתרון photoresist המתפתח.
5. שוטפים את פרוסות סיליקון מצופה photoresist פיתחו עם מים deionized.
6. ליצירת מערכים של רכסים בקנה מידה תת מיקרון עם צד קירות ליד אנכיים, לחרוט יון תגובה עמוק הסיליקון החשוף באמצעות מערכת תחריט.
7. הסר את photoresist שנותר על ידי הנחת פרוסות סיליקון במערכת אשר פלזמה.
8. חותכים את סיליקון wafers עם חותך יהלום שקצה לאדוני סיליקון בגודל המתאים לדפוס העתק שלאחר מכן.

2. ייצור של עובש רשות החשמל מהסיליקון מאסטר

הערה: נפח שיש להוסיף לאדון סיליקון לnanofabrication ישתנה בהתאם לאזור של המאסטר nanopatterned להיות משוכפל כמו גם הצמיגות של acrylate פוליאוריטן הפתרון (רשות החשמל).

1. משטח נקי סיליקון הורים עם 100% אתנול או קסילן ויבש תחת O ₂ / N ₂ גז.
2. הנח בצד דפוס אדון סיליקון בצלחת פטרי.
3. לאדון סיליקון עם 2 ס"מ X 2 סנטימטר משטח דפוס, פיפטה 40 μl של רשות החשמל על פני השטח התבנית.
4. הנח גיליון של 4 סנטימטר סרט X 4 סנטימטר שקוף פוליאסטר (PET) על רשות החשמל חילק.
5. לחץ כלפי מטה על גיליון PET ולהפיץ את הרשות לשירותים הציבורית מתחת לסדין על פני התבנית באמצעות רולר או משטח קצוות שטוח (כגון כרטיס), כך שכלדפוס הוא מכוסה על ידי prepolymer רשות החשמל.
6. הנח מאסטר סיליקון, prepolymer, וPET כ 10 סנטימטר מתחת אור UV 20 ואט (115 V) (λ = 365 ננומטר) ל50 שניות. כדי להיות יעיל, אורך גל אור UV יכול להיות בכל מקום בין 310-400 ננומטר. עוצמת האור היא 10-15 mW / ² סנטימטר על פני השטח של המצע.
7. לאחר הריפוי, להסיר סרט PET לאט עם מלקחיים. רשות לשירותים ציבוריים צריכה לצרף לסרט PET עם שלילי של nanopattern אדון סיליקון.
8. לרפא nanopatterns רשות החשמל / PET תחת UV לפחות 12 שעה לפני השימוש. חשיפה היא לא בעיה.
9. כדי לנקות אדוני סיליקון, למקם סרט נוסף של PET על גבי האדון ללא תוספת של רשות החשמל ולחשוף לאור UV (λ = 365 ננומטר) ל50 שניות ולהסיר סרט PET. זו תסיר את כל מונומרים unreacted.
10. יש לשטוף את אדון סיליקון עם 100% אתנול או קסילן ויבש תחת O ₂ / N ₂ גז.

3 א. פולימר פוליאוריתן Nanopatterning

1. הכן 25 שקופיות זכוכית עגולות בקוטר מ"מ על ידי הנחת בחדר טיפול באוזון ל10 דקות.
2. הנח שקופיות זכוכית שטופלה באוזון על גבי בלוק PDMS קטן לטיפול קל.
3. החל שכבה דקה של אמרגן הידבקות משטח עם מכחול לשקופיות זכוכית. שקופיות זכוכית אוויר יבשות למשך 30 דקות.
4. מניחים את שקף הזכוכית על פיסת נייר במדפסת.
5. זרוק לוותר 10 μl של פוליאוריטן (PU) מראש פולימר (נועה 76) למרכז שקופית זכוכית. ודא שאין בועות נמצאות אחרי כן.
6. עובש רשות החשמל פלייס, דפוס עם הפנים כלפי מטה, לשקופית הזכוכית. לפזר את יחידת השיטור באופן אחיד על פני השטח של שקופית הזכוכית על ידי גלגול הרים גליל גומי לאורך עובש רשות החשמל. נייר מדפסת יספוג הצפת פולימר.
7. מנורת UV ואט. זמן פלמור של יחידת השיטור תלוי בכוחו של מקור קרינה.
8. הסר את הדגימה ממקור אור UV ולקלף בזהירות את תבנית רשות החשמל משקופיות זכוכית PU מצופה. פלמור של פו נחשב גomplete כאשר קליפות רשות החשמל העובש נקי מן המדגם ושקופיות זכוכית PU יש מראה ססגוני.
9. מקום דגימות סיימו בייבוש לאחסון במשך זמן רב ככל חודש.

ב 3. Nanopatterning midi (lactide-Co-Glycolide) Hydrogel

1. צור עובש PDMS שטוח ידי ערבוב נמרץ בסיס אלסטומר סיליקון וסוכן ריפוי אלסטומר סיליקון ביחס 10:1.
2. יוצקים מעורב PDMS מבשר פתרון לתוך צלחת פטרי, כך שמבשר PDMS מגיע 5 מ"מ עד הקצה של המנה (כלומר, כך שPDMS הוא 5 מ"מ עובי).
3. מניחים צלחת פטרי ומבשר PDMS בייבוש במשך שעה 1 לדגה.
4. להעביר צלחת פטרי ומבשר PDMS לתוך תנור 65 מעלות צלזיוס למשך לפחות 2 שעות כדי לרפא.
5. לאחר PDMS נרפא, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את PDMS שטוח לתוך 3 סנטימטר חלקי ריבוע בגודל 3 סנטימטר. אלה יהיו תבניות PDMS השטוח השתמשו מאוחר יותר בתהליך הדפוסים.
6. שקופיות זכוכית עגולה בקוטר 25 מ"מ נקי על ידי placing באלכוהול איזופרופיל ל30 דקות בsonicator מים.
7. מגלשות יבשים ניקו זכוכית תחת O ₂ / N ₂ גז.
8. זרוק לוותר על פתרון PLGA 100 μl (15% w / v PLGA בכלורופורם) על גבי שקופית זכוכית.
9. הנח עובש PDMS שטוח על גבי PLGA לוותר לספוג את הממס ולקבל משטח PLGA שטוח. החל לחץ קל (~ 10 kPa) על ידי הצבת משקל 200 גרם בחלק העליון של PDMS במשך 5 דקות.
10. לאט לאט לקלף עובש PDMS שטוח ומניח את מכסה הזכוכית על צלחת שחומם מראש (120 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות כדי להסיר ממס שיורי ולהגדיל את ההידבקות בין PLGA וכיסוי הזכוכית.
11. מניחים את התבנית בNP רשות החשמל על גבי PLGA השטוח ולהפעיל לחץ קבוע (~ 100 kPa) וחום (120 ° C) על ידי הצבת במשקל 1 קילוגרם על גבי עובש רשות החשמל בעת על צלחת החימום במשך 15 דקות.
12. הסר את המשקל מהשקופית לכסות PLGA ולאפשר לקרקע להתקרר לטמפרטורת חדר. אין להסיר עובש רשות החשמל עד לקרקע הייתהמקורר.
13. ברגע שהמצע התקרר מספיק, לקלף בזהירות את תבנית NP רשות החשמל, חושף את תשתית NP PLGA. תשתית NP PLGA צריכה מראה ססגוני.
14. מקום דגימות סיימו בייבוש לאחסון במשך זמן רב ככל חודש.

4. זריעת תאים ותרבות

הערה: פרוטוקול זה מתאר את התרבות של myocytes ילוד חדרית העכברוש (NRVMs) ושריר לב H7 האנושי גזע עוברי שמקורם בתא (hESC-CMS), אבל מקורות של תאים אחרים עשויים להיות בשימוש.

1. צרף את coverslips ANFS (PU או PLGA) לצלחת קלקר 35 מ"מ רקמת תרבות. פיפטה 20 μl של Norland האופטי דבק (NOA83H) לתחתית הצלחת ומניח בעדינות את coverslip ANFS על גבי נועה. לאפשר דבק להתפזר ולכסות את תחתית coverslip כולו. לרפא את נועה על ידי חשיפה למנת UV עבור 10 דקות.
2. לעקר ANFS על ידי שטיפה עם 2 מיליליטר של 70% אתנול פתרון מימיים במשך 5 דקות, פעמיים. הסר דוארthanol ידי שאיפה. לאפשר ANFS לחלוטין אוויר יבש ל~ 1 שעות מתחת למנורת עיקור UV (λ = 200-290 ננומטר) בארון הבטיחות הביולוגית.
3. הידבקות הסלולר היא משופרת על ידי ציפוי ANFS בפיברונקטין הלילה. לדלל פיברונקטין במים די ל5 מיקרוגרם / מיליליטר. פיפטה 2 מיליליטר של תמיסת פיברונקטין לתוך צלחת. הנח חממה ב 37 ° C ו-CO ₂ לילה 5% (לפחות 6 שעות).
4. השג NRVMs, hESC-CMS, או תאי לב אחרים של עניין על פי פרוטוקולים קודמים ^22.
5. מדגם תא צנטריפוגה ב 1,000 סל"ד במשך 3 דקות עד גלולה התאים.
6. מוציא בזהירות את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה.
7. Resuspend תאים בתקשורת והתרבות המתאימה לריכוז של 4.6 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר.
8. זהירות פיפטה 200 μl של השעיה תא על ANFS מעוקר. ודא השעיה תא נשארת על coverslip.
9. מקום תאי חממה ב 37 ° C ו 5%CO ₂ למשך 4 שעות כדי לאפשר לתאים לצרף לANFS.
10. הוסף 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות החמה למנה ולהחליף את תאים בחממה באותם תנאים.
11. לאחר 24 שעות, להסיר את המדיה ולשטוף עם 2 מיליליטר של DPBS פעמיים כדי להסיר תאים עודפים.
12. הוסף 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות החמה למנה ולהחליף את תאים בחממה באותם תנאים. תרבות התאים למפגש. החלף תקשורת בכל יום אחר.

תוצאות

איור 1 הוא סקירה סכמטי של תהליך הייצור לשתי שיטות הייצור. בשל התאבכות של אור הנגרם על ידי הטופוגרפיה ננומטרי, nanopatterning צריך לגרום ססגוני משטח לANFS. איור 2 מתאר ססגוני משטח זה על coverslip דוגמת היטב 25 מ"מ NP-PU (איור 2 א) עם רכס 800 ננומטר וגרוב רוחב

Discussion

רקמות לב תפקודית בוגרות חסרות לשניהם in vivo ו במבחנת יישומים של הנדסת רקמות לב. שיטות nanofabrication CFL שתוארו כאן הן טכניקות חזקות להשגת יישור סלולארי והשפעה על תפקוד רקמות מקרוסקופית עקב יכולת ההרחבה של המערכת. יכולים בקלות להיות בדוגמת שטחים גדולים ומשמשים לתרבי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin	BD Biosciences	354008
NOA 76	Norland Products, Inc.	7606B
Surface Adhesion Promotor (Glass Primer)	Minuta Tech
PUA	Minuta Tech	MINS-311RM
Soft Rubber Roller	Speedball
Silicon Wafers	NOVA Electronic Materials	FA01-9900
Photoresist	Shipley	SPRT510
Photoresist Developer	Shipley	MF320
Electron-Beam Lithography System	JEOL	JBX-9300FS
Etching System	Surface Technology Systems	NP10 8UJ
Plasma Asher System	BMR Technology Co.	DSF-200
Ozone Cure System	Minuta Tech	MT-UV-O- 08
Fusion Cure System	Minuta Tech	MT-UV-A 11
NOA 83H	Norland Products, Inc.	8301
Spin Coater	Laurel Technology	WS-400-6NPP
Skyrol PET Film	SKC Co., Ltd.	23038-59-9
25 mm Glass Slides	Corning	2948
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	6/5/2553
Poly(D,L-lactide-co-glycolide)	Sigma-Aldrich	P2191-1G
Chloroform	Sigma-Aldrich	372978-1L
500 g Weights	Global Insustrial	T9FB503120
Isopropyl Alcohol	EMD Millipore	PX1835-2
Hot Plate	Corning	PC-420D
Sonicator	Branson	B2510MTH