Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Resumen

Aquí se describe un fluorescente de todo el montaje In situ Hibridación (FISH) protocolo para determinar las propiedades de expresión y localización de ARN expresados ​​durante la embriogénesis en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster.

Resumen

Evaluar el patrón de expresión de un gen, así como las propiedades de localización subcelular de sus ARN transcrito, son características clave para la comprensión de su función biológica durante el desarrollo. ARN hibridación in situ (ISH-RNA) es un poderoso método utilizado para la visualización de las propiedades de ARN de distribución, ya sea a nivel organismal, celular o subcelular ^1. ARN-ISH se basa en la hibridación de una sonda de ácido nucleico marcada (por ejemplo, ARN antisentido, oligonucleótidos) complementaria a la secuencia de un ARNm o un objetivo no codificante de ARN de interés ^2. A medida que el procedimiento requiere información de la secuencia primaria por sí sola para generar sondas específicas de secuencia, que puede aplicarse universalmente a una amplia gama de organismos y muestras de tejido ^3. De hecho, un número de estudios a gran escala ISH se han implementado para documentar la expresión génica y ARN dinámica de localización en diversos organismos modelo, que ha llevado a laestablecimiento de recursos comunitarios importantes ^4-11. Mientras que una variedad de la sonda de etiquetado y estrategias de detección se han desarrollado a lo largo de los años, el uso combinado de los reactivos de detección marcadas con fluorescencia y enzimáticas pasos de amplificación de señal ofrecen mejoras significativas en la sensibilidad y la resolución del procedimiento ^12. A continuación, describimos un fluorescente optimizado método de hibridación in situ (FISH) utilizando amplificación de la señal tiramida (TSA) para visualizar la expresión del ARN y la dinámica de localización en una puesta de embriones de Drosophila. El procedimiento se lleva a cabo en 96-y formato de placa de PCR, lo que facilita en gran medida el procesamiento simultáneo de grandes números de muestras.

Protocolo

1. Sonda de ARN Preparación

Resumen: En la siguiente sección se describen los pasos necesarios para hacer digoxigenina (DIG)-etiquetados sondas de ARN para el pescado. El primer paso implica la clonación o la PCR de la secuencia correspondiente a la región transcrita de un gen de interés que se utilizará para generar una sonda específica de secuencia. Esto se puede lograr por clonación primero el segmento de gen en un plásmido en el que está flanqueado el sitio de clonación múltiple por elementos promotores de bacteriófagos (T7, T3 o SP6), que puede entonces servir como una plantilla para PCR usando cebadores flanqueantes que incorporan las secuencias del promotor , generando así un producto de la PCR lineal con secuencias promotoras diferentes en cada extremidad (Figura 1A). Alternativamente, para evitar el paso de clonación, también se puede realizar la amplificación por PCR a partir de ADN genómico o ADNc usando oligonucleótidos que incluyen T7, T3 o SP6 secuencias en sus 5 'extremidades (por ejemplo, T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3: 5' AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3 '; Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3'). Los productos de PCR lineales se utilizan entonces como plantillas para hacer sentido marcada con DIG o sondas de ARN antisentido por escorrentía transcripción in vitro con la polimerasa apropiada (Figura 1B). Al hacer sondas para genes específicos, se recomienda la preparación de tanto sentido y antisentido sondas de ARN usando polimerasas diferentes, que serán útiles para evaluar la especificidad FISH señal (es decir, a menos que el gen de interés se transcribe en la orientación antisentido, la sonda de ARN sentido revelará la nivel de señal de fondo). En todos estos pasos, se debe tener mucho cuidado para evitar la degradación potencial de contaminantes ribonucleasas (RNasas) por la primera limpieza todas las áreas del banco y el equipo con el 70% de etanol o soluciones comerciales de descontaminación RNAsa y usando RNasa libre de los suministros (agua, puntas, tubos de microcentrífuga).

Mamáriales

• Tubos de 1,5 ml de centrífuga, (Abgene, Rochester, NY, EE.UU. cat. No 0900)
• Extracción de gel kits (Qiagen, Mississauga, ON, Canadá. Cat. No. 28.706).
• RNasa libre de agua (Wisent, Cat Inc.. º 809-115-CL)
• ARN polimerasas (T7, T3 o SP6). (20 U / l, Fermentas Biosciences. Cat. No. EP0101, EP0111, EP0131).
• RNAsa-OUT inhibidores de ribonucleasas (40 U / l), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. No. 10777-019).
• Digoxigenina (DIG) mezclas de nucleótidos (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Canadá. Cat. No.11209256910).

Equipo

• Tablero micro-centrífuga
• La electroforesis en gel aparato

1. Amplificar por PCR de genes específicos de secuencia de ADN genómico, ADNc o ADN de plásmido lineal para generar un producto de PCR flanqueado por el bacteriófago T7, secuencias promotoras T3 o SP6. Seguir las recomendaciones del fabricante para las condiciones de PCR.
2. Verificar la calidad y size del producto de PCR por electroforesis en gel de agarosa. Impuestos Especiales y purificar el producto de PCR usando un patrón de gel-kit de extracción de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y eluir el producto en 50 l de tampón.
3. Se precipita el producto de la PCR mediante la adición de 5 l de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 150 l de etanol enfriado con hielo 100%, y se colocan los tubos a -70 ° C durante la noche. Centrifugar los tubos a 13.000 xg durante 10 min a 4 ° C y se lava el precipitado con etanol al 70%. Girar de nuevo, quite todos los restos de etanol y secar la pastilla. Resuspender en 25-50 l de RNasa libre de agua.
4. Transcribir marcada con DIG sonda usando 200-500 ng producto de PCR purificado en una reacción de 20 l de la siguiente manera: 2 l de tampón 10X de la transcripción T7 (Invitrogen), 1 l (20 U / l) de inhibidor de RNasa, 2 l Dig-NTP mix , y 2 l T7 RNA polimerasa (20 U / l). Llevar el volumen final a 20 ml con agua libre de RNasa. Incubar la reacción de transcripción a 37 ° C durante 3-4 horas.
5. Ajuste transcription mezcla a 50 ml con RNasa libre de agua y precipitar la Dig-etiquetados sonda de ARN, como se describe en el Paso 4. Resuspender el sedimento lavado de ARN en 100 l de RNasa libre de agua. Almacenar las muestras se resuspendieron a -70 ° C.
6. Cuantificar la sonda usando un espectrofotómetro NanoDrop. Para verificar la calidad de la sonda, ejecutar un ejemplo de 1-2 l en un gel teñido con 1-2% de agarosa con bromuro de etidio.

2. Obtención y fijación de embriones de Drosophila

Resumen: En este apartado se describen los pasos para la recolección y procesamiento de escena embrión de Drosophila. Dependiendo del número de embriones necesarios, las moscas pueden ser mantenidos en jaulas de población de diversos tamaños. Los pasos siguientes son para las colecciones realizó con 900 cm ³ jaulas cilíndricas de 100 mm con placas de recolección de manzanas jugo. La fijación correcta requiere la eliminación de dos capas protectoras que rodean el embrión: el corion exterior y el interior vitelinae membrana ^13. Una vez recogidas, los embriones son primero bañado en una solución de lejía al 50% para eliminar el corion, a continuación, se mezclan en una solución bifásica que contiene heptano (permeabiliza la membrana vitelina), y PBS que contenía 3,7% de formaldehído. La membrana vitelina es entonces agrietado y eliminado mediante la transferencia de los embriones en una mezcla bifásica de heptano y metanol. Fijación embrión apropiado y la eliminación de la membrana vitelina es crítico para el éxito del procedimiento FISH aguas abajo.

Materiales

• Zumo de manzana placas de agar (40% de zumo de manzana, 4% de sacarosa, 3,5% de agar, 0,3% de metil parabeno) con pasta de levadura tamaño de una moneda (levadura de panadería se mezcla con agua a la consistencia de mantequilla)
• Paraformaldehído en polvo (Microscopía Electrónica de Ciencias, Hatfield, PA, USA,. Cat. N º 19208)
• Heptano
• Metanol
• 3% de lejía solución
• 20 ml de cristal de centelleo viales (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canadá. Cat. No. 03-337-15).

Equipo

• Jaulas de población
• Cestas de la colección (hecha utilizando una malla Nitex y la parte superior de un corte 50 ml en tubo de polipropileno que ha sido un agujero practicado en la tapa).
• Pincel pequeño
• Tablero vórtice

1. Pre-claras bien alimentados jaulas de población con una manzana fresca zumo / levadura placa durante 1 hora a 25 ° C.
2. Añadir un nuevo zumo de manzana / levadura placa a la caja para recolectar embriones prematuros. Incubar la jaula durante 4 horas a 25 ° C (nota que los tiempos de recogida se puede ajustar en función de las etapas deseadas).
3. Preparar una nueva solución de formaldehído al 37% mediante la combinación de polvo de 3,7 g de paraformaldehído, 70 l de KOH 2N, y 7,3 ml de agua MilliQ en un vial de centelleo de vidrio bajo una campana química. Hervir la solución hasta que el polvo de paraformaldehído se disuelve completamente, luego se enfría a temperatura ambiente y se filtra en un vial de centelleo de nuevo.
4. Prepare una solución de fijación bifásica porcombinando 2,25 ml de 1X PBS con 250 ml de formaldehído al 37% en un vial de centelleo, y luego la adición de 7,5 ml de heptano.
5. Se recoge el jugo de manzana placa de la jaula y recoger los embriones mediante la adición de un poco de agua del grifo a temperatura ambiente y delicadamente cepillado de los embriones de la placa con el pincel. Transferir los embriones resuspendidas en una cesta y enjuagar con agua corriente tibia.
6. Dechorionate embriones durante 90 segundos por bañando las cestas de recolección en una solución de lejía, luego enjuague bien con agua corriente tibia (hasta que el olor a blanqueador desaparezca).
7. Desmontar la canasta de la colecta, recoger embriones suavemente con un pincel y transferirlos a la solución de fijación bifásica. Los embriones se acumulan en la interfase entre el PBS y las capas de heptano.
8. Seal viales de centelleo y se fije a un mezclador de vórtice. Agitar durante 20 min en el ajuste más bajo.
9. Retirar y desechar la mayoría de las fases inferiores PBS y superior heptano utilizando una pipeta Pasteur. Aspirarel restante PBS / heptano / embriones mezcla en la pipeta. Gota a gota, desechar la fase inferior PBS de la pipeta, teniendo cuidado de no eliminar los embriones. Depositar los embriones en un tubo de 1,5 ml que contiene una solución bifásica de 500 l de heptano (fase superior) y 500 l de metanol (fase inferior).
10. Agitar los tubos vigorosamente a mano durante 30-45 segundos para romper las membranas vitelina. Una vez roto, los embriones se hundirá en el metanol.
11. Descartar la fase superior heptano y embriones no agrietados en la interfase heptano / metanol, y se añaden 500 l de metanol. Agitar durante 5 seg.
12. Lavar 3 veces con metanol y almacenar los embriones a -20 º C (en este punto los embriones pueden ser almacenados por semana / mes).

3. Fijación post-proceso, la hibridación y Post-hibridación lavados

Resumen: Esta sección detalla los pasos de proceso de permeabilización embrión antes de FISH, pre-hibridación,la hibridación con las sondas de ARN y lavados post-hibridación. Para los pasos iniciales de permeabilización de los embriones se tratan como una piscina en un solo tubo (pasos 1-9 a continuación, con el objetivo de 10-15 l de embriones asentados / muestra), pero se dividieron en alícuotas en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos PCR antes de proceder con la etapa de pre-hibridación (paso 10 a continuación). Esto ayuda a asegurar incluso el tratamiento de todos los embriones en las fases iniciales del experimento. Al configurar un experimento FISH, es importante incluir controles negativos para determinar el nivel de señal de fondo en los experimentos individuales. Para ello, se recomienda incluir una muestra de 'no-sonda "y, como se señaló en la sección 1, la muestra se hibridó con el" sentido "de la sonda de ARN, que por lo general le dará una señal comparable a la condición de« no-sonda ".

Materiales:

• Metanol
• Salina tamponada con fosfato con 0,1% de Tween-20 (PBT)
• Proteinasa-K 1 mg / ml de solución madre (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canadá. N º de catálogo P2308)
• Glicina (20 mg / ml de solución madre)
• Solución de hibridación: 50% formamida, 5 x SSC, 0,1% de Tween-20, 100 g / ml de ADN de esperma de salmón, 100 ug / ml de heparina.
• 0,2 ml halfskirted 96-y placas PCR, ABgene, Rochester, NY, Gato EE.UU.. No 0900)

Equipo

• Baño de horno de hibridación, bloque de calentamiento de agua digital o ajustable a 56 ° C, 80 ° C o 100 ° C, o una máquina de PCR.
• Pipetas multicanal (recomendado para simplificar los procesos de lavado)
• Mezclador oscilante

1. Enjuagar los embriones en metanol, a continuación, en una mezcla 1:1 de metanol: PBT, y luego dos veces en PBT.
2. Fijar los embriones durante 20 minutos en 1 ml de PBT que contiene 3,7% de formaldehído (recién preparado como se describe en el paso 11) con agitación constante en un Nutator.
3. Lavar los embriones durante 3 veces durante 2 min en PBT mientras se balancea.
4. Preparar una solución de 3 mg / ml de proteinasa K (PK) diluido en PBT y añadir500 l de solución a las muestras. Incubar las muestras durante 10 min a temperatura ambiente sin agitación. Mezclar embriones cada 2 min por chorro con una pipeta o invirtiendo suavemente los tubos.
5. Transferir las muestras embriones en hielo durante 1 hr.
6. Mover las muestras a temperatura ambiente y eliminar la solución PK. Lavar 2 veces durante 2 min con 1 ml de PBT + 2 mg / ml de glicina.
7. Fijar las muestras de 20 min en 1 ml de formaldehído PBT + 3,7% con agitación. Enjuague embriones 5 veces en PBT.
8. Enjuague embriones con 1 ml de una mezcla 1:1 de PBT y solución Hyb. Reemplazar con 0.5-1 ml de 100% de solución de hibridación (en este paso los embriones se pueden almacenar durante varios días / semana a -20 ° C).
9. Embriones alícuotas en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos (objetivo de ~ 10-15 l de embriones asentados / pocillo, tenga cuidado de utilizar puntas de gran apertura para evitar dañar los embriones).
10. Hervir 100 l / muestra de la solución de hibridación durante 5 minutos y luego se enfría en hielo durante 5 min. Esta solución se utiliza para la muestra de pre-hibridación (Pre-Hyb).
11. Añadir 100 l / muestra de Pre-Hyb solución e incubar durante al menos 2 horas a 56 ° C.
12. Para cada muestra, diluir ~ 100 ng de la sonda en 100 l de solución de hibridación. Se calienta a 80 ° C durante 3 min, a continuación, enfriar en hielo durante 5 min (sondas calentadas se pueden mantener en hielo durante varias horas).
13. Retire la solución de pre-hibridación de los embriones y reemplazarla con la solución de la sonda de ARN.
14. Hibridar a 56 º C durante 12-16 h.
15. Calentar las soluciones de lavado siguientes a 56 ° C: (A) 200 l / muestra de la solución de hibridación; (B) 100 l / muestra de una mezcla 3:1 de Hyb: PBT; (C) 100 l / muestra de un mezcla 1:1 de Hyb: PBT; (D) 100 l / muestra de una mezcla 1:3 de Hyb: PBT; (E) 400 l / muestra de PBT.
16. Enjuague muestras con 100 l de solución de lavado A, a continuación, realizar la etapa de lavado con 100 l / muestra de AD soluciones a 56 ° C durante 15 min cada uno. A continuación, lavar las muestras 4 veces durante 5 min con 100 l / muestra de la solución E a 56 ° C.
17. Enfriar las muestras a temperatura ambiente.

4. Sonda de Detección

Información general: Esta sección describe los anticuerpos y reactivos de detección utilizados para detectar y visualizar la distribución de la señal de hibridación sonda de ARN siguiente. Estos pasos se describen esquemáticamente en la Figura 2. Aquí sólo se presentan los reactivos de detección estándar que utilizamos para la amplificación de la señal robusta, pero existe una variedad reactivos comercialmente disponibles que pueden ser utilizados como alternativas, especialmente cuando se realizan experimentos de FISH de doble para co-detectar RNAs diferentes al mismo tiempo para la proteína-ARN de doble tinción. Ejemplos de resultados obtenidos con este protocolo se muestran en el patrón de expresión mRNA mosaico / localización en la Figura 3.

Materiales

• HRP-conjugado monoclonal de ratón anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. No. 200-032-156)
• Biotina conjugada con anticuerpo monoclonal de ratón anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratorios Cat Inc.. N º 200-062-156)
• Estreptavidina-HRP conjugado (Molecular Probes, Eugene, USA, cat. No.S991)
• Cy3-tiramida conjugados (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, EE.UU., cat. No. SAT704A)
• DABCO solución de montaje: En un tubo de 50 ml, diluir 1,25 gramos de DABCO (1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano; Sigma D-2522) en 15 ml de 1X PBS, a continuación, añadir 35 ml de glicerol y se mezcla hasta que esté totalmente homogénea. Mezclando previamente con PBS, el polvo de DABCO se disuelve muy rápidamente. Tienda de montaje solución a -20 ° C.
• Portaobjetos de vidrio, cubreobjetos

Equipo

• Mezclador oscilante
• Multichannel pipeta
• Microscopio de fluorescencia

1. Preparar la solución de PBTB, que contiene PBT + 1% de leche sin grasa seca (normalmente 50-100 ml es suficiente para toda la incubación del reactivo de detección y los pasos de lavado).
2. Bloquear las muestras durante 10 min a temperatura ambiente en 100 PBTB mu l / muestra, mientras que el balanceo en Nutator.
3. Retirar la solución de bloqueo a partir de embriones y las muestras se incuban durante 1.5-2 horas a temperatura ambiente con 100 l / muestra de la solución de anticuerpo monoclonal anti-biotina DIG (diluido 1/400 en stock en PBTB) con agitación.
4. Lavar las muestras de 6 veces durante 5 minutos cada uno con 100 PBTB l / muestra con balanceo.
5. Incubar 1,5 hr a temperatura ambiente con 75 ml / muestra de estreptavidina-HRP solución (diluido 1/100 de almacén, en PBTB, 10 mg / ml de concentración final) con agitación.
6. Lavar las muestras de 6 veces durante 5 min cada uno. PBTB 100 l / muestra con balanceo (para la contratinción ADN, DAPI diluir a 1X concentración de trabajo en PBTB y usar esta solución en la primera etapa de lavado)
7. Enjuague embriones con PBT, luego lavar 2 veces durante 5 min con PBS.
8. Incubar las muestras durante 2 horas a temperatura ambiente en la Nutator con 50 l / muestra de Cy3-tiramida solución (diluido 1/50 en tampón de amplificación tiramida). Partir de este paso, asegúrese de mantener las muestras en un recipiente ligero blindado.
9. Lavar las muestras de 6 veces durante 5 minutos cada uno con 100 l de PBS / muestra en Nutator.
10. Retirar PBS y añadir 100-125 l / muestra de la solución de montaje que contiene 70% de glicerol y 2,5% (DABCO). Almacene las muestras a 4 ° C. Estas muestras se pueden almacenar durante varios años.
11. Utilizando una punta de gran calibre, resuspender los embriones pipeteando con suavidad las muestras y transferir 25 l de embriones en un portaobjetos de vidrio, coloque un cubreobjetos sobre los embriones y el sello en la diapositiva con esmalte de uñas.
12. Analizar las muestras de embriones utilizando un microscopio de fluorescencia.

Resultados

Si se realiza con éxito, este procedimiento ofrece un nivel notablemente mejorada de detalle en el análisis espacio-temporal de la expresión génica y la dinámica de localización de mRNA a principios de la embriogénesis de Drosophila. En efecto, como se ilustra en la Figura 3 para el más pequeño de genes clásico par-rule (pista), se puede usar este protocolo para observar eventos de expresión génica a través de la detección de focos de transcripci...

Discusión

Para ver los pasos de síntesis de la sonda, que suelen generar escorrentía antisentido sondas de ARN por transcripción in vitro de larga duración cDNAs amplificados a partir de plásmidos de Drosophila se encuentran en la Colección de Drosophila Gene (DGC), un recurso detalla en la siguiente dirección: http:// .fruitfly.org / DGC / index.html ^14,15. Este enfoque ha sido utilizado ampliamente en estud...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
T7, la ARN polimerasa T3 o SP6	Fermentas Ciencias de la Vida	EP0101, EP0111, EP0131	Los kits contienen tampón de reacción.
DIG RNA Labeling Mix	Roche Applied Science	11 277 073 910
RNAguard	Amersham Biosciences	27-0816-01
Acetato sódico 3 M
Etanol frío al 100%.
Etanol frío al 70%.
Solución de lejía diluida 1:1 con agua.
Heptano
Metanol
proteinasa K	Sigma Aldrich Oakville, ON, Canadá	N º de catálogo P2308
40% solución de formaldehído, recién preparado
PBS-Tween solución (PBT)		1xPBS, 0,1% de Tween-20
Glicina solución		2 mg / ml de glicina en PBT
HRP-conjugado monoclonal de ratón anti-DIG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc	200-032 - 156	(1/400 de dilución de un 1 mg / ml de solución madre en PBTB
HRP de oveja conjugado monoclonal anti-DIG	Roche Applied Science, Laval, QC	1 207 733	Dilución 1/500 de la solución madre en PBTB
Biotina conjugada con anticuerpo monoclonal de ratón anti-DIG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, EE.UU.	200-062-156	(1/400 de dilución de un 1 mg / ml de solución madre en PBTB
Estreptavidina-HRP conjugado	Molecular Probes, Eugene OR, EE.UU.	S991	(1/100 de dilución de un 1 mg / ml de solución madre