הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Summary

כאן אנו מתארים שלם הר ניאון באתר הכלאת פרוטוקול (דגים) לקביעת מאפייני הביטוי ולוקליזציה של RNAs הביעו במהלך ההתפתחות עוברת בזבוב הפרות, דרוזופילה melanogaster.

Abstract

הערכת דפוסי הביטוי של גן, כמו גם את תכונות לוקליזציה subcellular של רנ"א התעתיקים שלה, הן תכונות מרכזיות להבנת התפקוד הביולוגי שלה במהלך פיתוח. רנ"א כלאה באתר (RNA-ish) הוא שיטה חזקה המשמשת להמחשת מאפייני הפצת RNA, יהיה זה ברמת האורגניזם, סלולרית או subcellular ^1. RNA-ish מבוסס על הכלאה של חללית שכותרתו חומצות גרעין (למשל antisense RNA, oligonucleotides) משלימה הרצף של mRNA או יעד שאינו קידוד-RNA של עניין ^2. כנוהל מחייב מידע רצף ראשוני בלבד כדי ליצור רצף בדיקות ספציפיות, זה יכול להיות מיושם באופן אוניברסלי למגוון רחב של יצורים ודגימות רקמה ^3. ואכן, מספר מחקרי איש בקנה מידה גדול יושם לתעד ביטוי גנים ודינמיקת RNA לוקליזציה באורגניזם מודל שונה, מה שהוביל להקמת משאבי קהילה חשובים ^4-11. בעוד מגוון של תיוג בדיקה וזיהוי אסטרטגיות פותח לאורך השנים, השימוש בשילוב של חומרים כימיים זיהוי כותרת-fluorescently וצעדי הגברת אותות אנזימטית מציע שיפורים משמעותיים ברגישות וברזולוציה של ההליך ^12. כאן, אנו מתארים ניאון מותאם בשיטת כלאה באתר (FISH) העסקת הגברת אות tyramide (TSA) לדמיין ביטוי RNA ודינמיקת לוקליזציה בעוברי תסיסנית מבוימת. ההליך מתבצע ב96-PCR צלחת פורמט היטב, שמאוד מקל על העיבוד בו הזמני של מספר גדול של דגימות.

Protocol

1. הכנת RNA Probe

סקירה: הסעיף הבא מתאר את הצעדים הנדרשים כדי להפוך את בדיקות Digoxigenin (Dig) שכותרתו-RNA מתאימות לדגים. השלב הראשון כרוך בשיבוט או מחזק את רצף מקביל לאזור תמלל של גן של עניין שניתן להשתמש כדי ליצור חללית רצף ספציפית PCR. זו יכולה להיות מושגת על ידי השיבוט הראשון במגזר הגן לתוך פלסמיד שבו אתר השיבוט המרובה מוקף באלמנטי bacteriophage אמרגן (T7, T3 או SP6), אז מה שיכול לשמש כתבנית לשימוש PCR primers איגוף הכולל את רצפי פרומוטר , ובכך לייצר מוצר PCR ליניארי עם רצפי פרומוטר שונים בכל גפיים (איור 1 א). לחלופין, כדי למנוע את צעד השיבוט, אפשר גם לבצע הגברת PCR מהדנ"א הגנומי או cDNA באמצעות oligonucleotides הכולל T7, T3 או SP6 רצפים בגפיהם 5 '(למשל T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; SP6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). מוצרי PCR יניארי לאחר מכן משמשים כתבניות כדי להפוך את בדיקות antisense RNA תחושה או Dig מתויג על ידי ניגר בשעתוק מבחנה עם פולימראז המתאים (1B איור). בעת ביצוע בדיקות עבור גנים ספציפיים, אנו ממליצים להכין שתי בדיקות antisense RNA תחושה והשימוש polymerases נפרד, שיהיה מועיל להערכה סגולי אות דגים (כלומר, אלא אם כן הגן של עניין הוא עבד באורינטצית antisense, תחושת רנ"א הבדיקה תגלה רמת אות רקע). בכל השלבים הבאים, אחד צריך לקחת בזהירות רבה, כדי למנוע הידרדרות אפשרית על ידי ribonucleases המזהם (RNAses) על ידי ניקוי כל תחומי הספסל והציוד הראשון עם פתרוני טיהור RNase מסחריים אתנול או 70% ובאמצעות אספקת RNAse חינם (למשל מים, טיפים, צינורות microcentrifuge).

אמאterials

• 1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל, (Abgene, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב חתול. לא 0900)
• ערכות ג'ל חילוץ (Qiagen, Mississauga, ON, קנדה;. מק"ט 28706).
• RNAse חופשי מים (Wisent, חתול בע"מ. מספר 809-115-CL)
• polymerases RNA (T7, T3, או SP6). (20 U / μl, Fermentas Biosciences. חתול. מספר EP0101, EP0111, EP0131).
• RNAse-Out מעכבי Ribonuclease (40 U / μl), (Invitrogen, ברלינגטון ON. Canada.Cat. מספר 10777-019).
• Digoxigenin (DIG) תערובות נוקלאוטיד (DIG-11-UTP, רוש יישומית Biosciences, Laval, QC, קנדה. חתול. No.11209256910).

ציוד

• בראש טבלת מייקרו צנטריפוגה
• מנגנון ג'ל אלקטרופורזה-

1. PCR להגביר רצף הגן ספציפי מ-DNA גנומי, cDNA, או DNA פלסמיד כדי לייצר מוצר PCR יניארי המוקף bacteriophage T7, רצפי פרומוטר T3 או SP6. בצע את המלצות היצרן לתנאי PCR.
2. ודא את האיכות וsiZE של ​​מוצר PCR ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל. בלו ומוצר PCR לטהר בעזרת ערכה סטנדרטית ג'ל שאיבה בהתאם להמלצות ומייצרות elute המוצר ב 50 μl של חיץ.
3. תזרז את מוצר PCR על ידי הוספת 5 μl יצטט 3M נתרן (pH 5.2) ו 150 μl של 100% אתנול קר כקרח, ולמקם את הצינורות ב -70 מעלות צלזיוס למשך הלילה. צנטריפוגה צינורות ב13000 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C ולשטוף גלולה עם אתנול 70%. מסתחרר שוב, להסיר כל העקבות של אתנול ואוויר יבש הגלול. Resuspend ב25-50 μl מי RNAse חינם.
4. לתמלל חללית לחפור-תווית באמצעות מוצר 200-500 ng מטוהרי PCR בתגובת 20 μl כדלקמן: 2 μl של חיץ שעתוק T7 10X (Invitrogen), μl 1 (20 U / μl) של RNAse מעכב, 2 μl Dig-NTP התמהיל , ו 2 RNA פולימראז T7 μl (20 / μl U). להביא את הנפח הסופי עד 20 μl עם מי RNAse חינם. דגירת תגובת השעתוק על 37 מעלות צלזיוס למשך שעות 3-4.
5. התאם transcתמהיל ription עד 50 μl עם מי RNAse חינם ויזרז את Dig מתויג-RNA הבדיקה כפי שמתוארת בשלב 4. Resuspend רנ"א הגלולה השטופה ב100 μl מי RNAse חינם. אחסן את דגימות resuspended ב -70 ° C.
6. לכמת את החללית באמצעות ספקטרופוטומטר nanodrop. כדי לוודא את איכות הבדיקה, הפעל מדגם μl 1-2 בג'ל צבעוני 1-2% agarose עם רומיד ethidium.

2. איסוף וקיבוע של עוברי תסיסנית

סקירה: סעיף זה מתאר את השלבים לקצירה ועיבוד עובר דרוזופילה מבוימת. בהתאם לכך, מספר העוברים הדרושים, זבובים יכולים להישמר בכלובי אוכלוסיות בגדלים שונים. השלבים הבאים הם לאוספים בוצעו באמצעות 900 ³ כלובים גליליים סנטימטר באמצעות פלטות איסוף מיץ תפוחי 100mm. קיבעון נאות מחייב את הסרתם של שתי שכבות הגנה המקיפות את העובר: הסיסי החיצוני והפנימי vitellinקרום הדואר ^13. שנקטף ברגע, את העוברים הם התרחצו ב50% תמיסת כלור להסיר הסיסי, אז הם מעורבבים בתמיסה המכילה פאזית heptane (permeabilizes קרום vitelline), וPBS המכיל פורמלדהיד 3.7%. אז קרום vitelline סדוק והוסר על ידי העברת העוברים לתערובת פאזית לheptane ומתנול. קיבעון עובר תקין והסרה של קרום vitelline הוא קריטי להצלחה של הליך הדגים במורד הזרם.

חומרים

• אפל מיץ צלחות אגרו (40% מיץ תפוחים, סוכרוז 4%, אגר 3.5%, 0.3% מהתיל paraben) עם רסק שמרים בגודל מטבע (שמרי האופה מעורבב עם מים לעקביות חמאה)
• paraformaldehyde אבקה (מדעי אלקטרונים מיקרוסקופים, הטפילד, פנסילבניה, ארה"ב;. חתול מספר 19208)
• Heptane
• מתנול
• 3% פתרון אקונומיקה
• 20 מיליליטר זכוכית בקבוקוני נצנץ (תרם הפישר סיינטיפיק, אוטווה, ON, קנדה;. מק"ט 03-337-15).

ציוד

• כלובי אוכלוסייה
• סלי אוסף (המתבצע באמצעות רשת Nitex ואת החלק העליון של צינור חתוך 50 מ"ל פוליפרופילן שבבור נחתך במכסה).
• מברשת צבע קטנה
• מערבולת בראש הטבלה

1. היטב האכיל כלובים מראש ברורי אוכלוסייה עם צלחת מיץ / שמרי תפוחים טריה לשעת 1 בשעת 25 ° C.
2. הוסף צלחת חדשה מיץ תפוחים / שמרים לכלוב כדי לקצור עוברים בשלבים מוקדמים. דגירת הכלוב במשך 4 שעות ב 25 ° C (שים לב שזמני איסוף יכולים להיות מותאמים בהתאם לשלבים הרצויים).
3. הכן 37% פתרון פורמלדהיד טרי על ידי שילוב של אבקת 3.7 גרם paraformaldehyde, 70 μl של 2N KOH ו -7.3 מיליליטר מי milliQ בבקבוקון זכוכית נצנץ מתחת לברדס כימי. מרתיחים את הפתרון עד שאבקת paraformaldehyde הוא נמס לגמרי, אז מגניב לטמפרטורת חדר ומסנן לתוך בקבוקון נצנץ חדש.
4. הכן את פתרון קיבעון פאזית ידישילוב 2.25 מ"ל של 1X PBS עם 250 מ"ל של פורמלין 37% בבקבוקון נצנץ, ואז מוסיף 7.5 מ"ל של heptane.
5. לקצור את צלחת מיץ התפוחים מהכלוב ולאסוף את העוברים על ידי הוספה מעט מים ברז טמפרטורת חדר ועדינות מברישה את העוברים מחוץ לצלחת עם המכחול. להעביר את עוברי resuspended לסל ולשטוף במים ברז פושרים.
6. עוברי Dechorionate עבור 90 שניות על ידי רחיצת סלי האיסוף בפתרון אקונומיקה, ולאחר מכן לשטוף היטב במים ברז פושר (עד ריח אקונומיקה נעלם).
7. לפרק את סל האיסוף, לאסוף עוברים בעדינות באמצעות מכחול ולהעביר אותם לפתרון הקיבעון פאזית. העוברים יצטברו בממשק שבין PBS ושכבות heptane.
8. בקבוקוני חותם נצנץ ויתחבר למיקסר מערבולת. Shake במשך 20 דקות על הגדרה הנמוכה ביותר.
9. להסיר ולסלק את רוב שלבי PBS והעליון הנמוכים heptane באמצעות פסטר פיפטה. לשאוב/ עוברי PBS / heptane התערובת שנותרה לתוך פיפטה. באופנת dropwise, להשליך את שלב PBS הנמוך מפיפטה, נזהר שלא לחסל את העוברים. להפקיד את העוברים לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל פתרון פאזית לheptane μl 500 (שלב העליון) ומתנול μl 500 (שלב נמוך יותר).
10. Shake צינורות נמרצות ביד במשך 30-45 שניות לפצח את קרומי vitelline. נסדק ברגע, את העוברים ישקעו במתנול.
11. השלך את השלב העליון heptane ועוברי uncracked בשלבי ביניים / מתנול heptane, ולהוסיף 500 μl של מתנול. Shake למשך 5 שניות.
12. לשטוף 3 פעמים עם מתנול ולאחסן את העוברים ב -20 ° C (בשלב זה ניתן לאחסן את העוברים במשך שבועות / חודשים).

3. לאחר קיבוע עיבוד, הכלאה ולאחר ההכלאה שוטפת

סקירה: סעיף זה מפרט את צעדי העיבוד לpermeabilization עובר לפני הדגים, הכלאה-מראש,הכלאה עם בדיקות RNA ושטיפות לאחר הכלאה. לקבלת השלבים הראשוניים permeabilization עוברי מטופלים כברכה בצינור יחיד (שלבים 1-9 להלן, מכוון עבור 10-15 μl של עוברים / מדגם התיישבו), אבל הם aliquoted לתוך בארות בודדות של צלחת 96-PCR גם לפני שימשיך בשלב טרום הכלאה (שלב 10 להלן). פעולה זו מסייעת להבטיח אפילו טיפול של כל העוברים בשלבים הראשוניים של הניסוי. בעת הגדרת ניסוי דגים, חשוב לכלול פקדים שליליים כדי לקבוע את רמת אות רקע בניסויים נפרדים. לשם כך, אנו ממליצים בכלל המדגם 'ללא בדיקה ", וכפי שציין בסעיף 1, מדגם הכלאה עם' החוש 'רנ"א החללית, אשר בדרך כלל תיתן איתות דומה למצב' ללא הבדיקה".

חומרים:

• מתנול
• פוספט נאגר מלוח עם 0.1% Tween-20 (PBT)
• Proteinase K-1 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות (סיגמה אולדריץ, Oakville, ON, קנדה. מספר P2308)
• גליצין (20 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות)
• פתרון הכלאה: פוראמיד 50%, SSC 5X, 0.1% Tween-20, 100 / מיליליטר גרם של DNA זרע סלמון טעון, 100 הפארין מיקרוגרם / מ"ל.
• 0.2 מ"ל halfskirted 96-PCR גם צלחות, Abgene, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב חתולים. לא 0900)

ציוד

• אמבטית תנור הכלאת בלוק, דיגיטלי או חימום מי מתכוונן עד 56 ° C, 80 ° C או 100 ° C, או מכונת ה-PCR.
• פיפטורים רב (מומלץ לפשט את פעולות כביסה)
• Nutating מיקסר

1. יש לשטוף את העוברים במתנול, ולאחר מכן בתערובת ביחס 1:1 של מתנול: PBT, ולאחר מכן פעמים בPBT.
2. תקן את העוברים במשך 20 דקות ב1 מ"ל של PBT המכיל פורמלדהיד 3.7% (המוכן טרי כמתואר בשלב 11) עם נדנדה מתמדת בnutator.
3. שטוף את העוברים במשך 3 פעמים עבור 2 דקות בPBT תוך נדנדה.
4. הכן את הפתרון של 3 מיקרוגרם / מ"ל ​​של proteinase K (קי) בדילול PBT ולהוסיף500 μl של פתרון לדגימות. דגירת דגימות למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר בלי לרעוד. מערבב עוברים כל 2 דקות על ידי jetting עם פיפטה או על ידי ההיפוך בעדינות את הצינורות.
5. העברת דגימות עוברים על קרח ל1 שעות.
6. להעביר דגימות לטמפרטורת חדר ולהסיר פתרון PK. לשטוף 2 פעמים עבור 2 דקות עם 1 מ"ל של PBT + 2 מ"ג / המ"ל גליצין.
7. תקן דגימות 20 דקות ב1 מ"ל של PBT + פורמלדהיד 3.7% עם נדנדה. יש לשטוף את העוברים 5 פעמים ב PBT.
8. יש לשטוף את עוברים עם 1 מ"ל של תערובת ביחס 1:1 של PBT ופתרון היב. חלף עם 0.5-1 מ"ל של 100% פתרון היב (בשלב זה את העוברים יכולים להיות מאוחסנים במשך כמה ימים / שבועות ב -20 ° C).
9. עוברי aliquot לתוך בארות בודדות של צלחת 96-היטב (למטרה ~ 10-15 μl של עוברים התיישבו / היטב, לטפל להשתמש טיפי צוהר רחבים כדי למנוע פגיעה בעוברים).
10. מרתיח 100 μl / מדגם של פתרון היב למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנן על קרח למשך 5 דקות. פתרון זה משמש לטרום הכלאת מדגם (טרום היב) .
11. הוסיפו 100 μl / מדגם של פתרון טרום היב ודגירה של לפחות 2 שעות על 56 ° C.
12. עבור כל מדגם, לדלל ~ 100 ננוגרם של חללית ב 100 μl של פתרון היב. חום ב 80 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, ואז מגניבות על קרח למשך 5 דקות (בדיקות מחוממות יכולות להישמר על קרח לכמה שעות).
13. הסר את הפתרון טרום היב מהעוברים ולהחליף עם פתרון בדיקת רנ"א.
14. להכליא על 56 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות.
15. לשטוף את הפתרונים הבאים מראש, חמים, ב56 ° C: () 200 μl / מדגם של פתרון היב; (ב) 100 μl / מדגם של תמהיל 3:01 של היב: PBT; (ג) 100 μl / מדגם של 01:01 שילוב של היב: PBT; (ד ') 100 μl / מדגם של תמהיל 1:03 של היב: PBT; (E) 400 μl / מדגם של PBT.
16. שטוף עם 100 דגימות של פתרון μl לשטוף, ואז לבצע את שלב השטיפה עם 100 μl / מדגם של ספירת פתרונות על 56 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כל אחד. לאחר מכן, לשטוף דגימות 4 פעמים למשך 5 דקות עם 100 μl / מדגם E פתרון על 56 ° C.
17. דגימות להתקרר לטמפרטורת חדר.

ילדה = "jove_title"> 4. איתור חללית

סקירה: סעיף זה מתאר את הנוגדנים וריאגנטים זיהוי המשמשים לזיהוי ולהמחיש חלוקת ההכלאה הבאה אות בדיקת רנ"א. צעדים אלו התוו סכמטי באיור 2. כאן אנו מציגים רק את ריאגנטים זיהוי הרגילים שאנו משתמשים להגברת אות יציבה, אך קיים מגוון חומרים כימיים מסחריים קיימים שניתן להשתמש בם כתחליף, במיוחד בעת ביצוע ניסויים-FISH הכפול לשתף לזהות RNAs השונה בו זמנית לחלבון-RNA הכפול מכתים. דוגמאות לתוצאות שהושגו עם פרוטוקול זה מוצגות בפסיפס mRNA ביטוי / לוקליזציה הדפוס באיור 3.

חומרים

• HRP-מצומדות עכבר חד שבטי אנטי DIG (חתול ג'קסון ImmunoResearch מעבדות בע"מ. מספר 200-032-156)
• ביוטין מצומדות עכבר חד שבטי אנטי DIG (ג'קסון Immunחתול בע"מ oResearch מעבדות. מספר 200-062-156)
• Streptavidin-HRP המצומד (בדיקות מולקולריות, יוג'ין ו, ארה"ב, חתול. No.S991)
• conjugates Cy3-tyramide (מדעי פרקין אלמר חיים, בוסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב, קאט. המספר SAT704A)
• DABCO הרכבת פתרון: בצינור מ"ל 50, לדלל 1.25 גרם של DABCO (1,4-diazabicyclo [2.2.2] יוקטן; סיגמא D-2522) ב15 מ"ל של 1X PBS, ואז מוסיף 35 מ"ל של גליצרול ומערבבים עד מלא הומוגנית. על ידי premixing עם PBS, אבקת DABCO נמסה מהר מאוד. פתרון הרכבת חנות ב -20 ° C.
• שקופיות זכוכית, coverslips

ציוד

• Nutating מיקסר
• pipettor רב ערוצים
• מיקרוסקופ פלואורסצנטי

1. להכין תמיסת PBTB, המכילה PBT 1% + חלב יבש ללא שומן (בדרך כלל 50-100 מ"ל מספיק עבור כל הדגירה מגיבה איתור וצעדי כביסה).
2. חסום את הדגימות למשך 10 דקות בטמפ החדר בPBTB / מדגם μl 100 בעוד מתנדנד על nutator.
3. הסרת חסימה מפתרון עוברים ודגימות דגירה במשך 1.5-2 שעות בטמפרטורת חדר עם μl / מדגם 100 פתרון חד השבטי ביוטין אנטי DIG הנוגדן (בדילול 1/400 ממניות לPBTB) עם נדנדה.
4. לשטוף דגימות 6 פעמים למשך 5 דקות כל אחד עם PBTB 100 μl / מדגם עם נדנדה.
5. דגירת 1.5 שעות בטמפרטורת חדר עם 75 מ"ל / מדגם של streptavidin-HRP פתרון (בדילול 1/100 ממניות בPBTB, 10 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) עם נדנדה.
6. לשטוף דגימות 6 פעמים למשך 5 דקות כל אחד 100 PBTB / מדגם μl עם נדנדה (לcounterstaining-DNA, לדלל DAPI לריכוז עבודת 1X בPBTB ולהשתמש בפתרון זה בשלב השטיפה הראשון).
7. יש לשטוף את עוברים בעלי PBT, לאחר מכן לשטוף 2 פעמים למשך 5 דקות עם PBS.
8. דגירת דגימות עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר בnutator עם 50 μl / מדגם של פתרון Cy3-tyramide (בדילול 1/50 בחיץ ההגברה Tyramide). מהשלב הזה ב, הקפד לשמור דגימות בקיבול מוגן אור.
9. לשטוף דגימות 6 פעמים למשך 5 דקות כל אחד עם / מדגם PBS μl 100 בnutator.
10. הסר PBS ולהוסיף 100-125 μl / מדגם של פתרון גובר המכיל גליצרול 70% ו -2.5% (DABCO). דגימות חנות ב 4 ° C. דגימות אלו יכולות להיות מאוחסנות במשך מספר שנים.
11. שימוש קצה רחב ומשעמם, resuspend את העוברים על ידי pipetting בעדינות את הדגימות ולהעביר 25 μl של עוברים על גבי זכוכית, ואז למקם coverslip על העוברים וכלב הים על גבי השקופית עם לכה לציפורניים.
12. לנתח דגימות עובר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

כאשר בצעו בהצלחה, הליך זה מציע רמה להדהים משופרת של פרטים במרחב ובזמן הניתוח הזמני של ביטוי גנים ודינמיקת לוקליזציה mRNA במהלך ההתפתחות עוברת תסיסנית מוקדם. ואכן, כפי שמודגם באיור 3 א לננס זוג השלטון הגנטי הקלסי (ריצה), ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כד...

Discussion

לצעדי סינתזת בדיקה, אנחנו בדרך כלל לייצר חלליות ניגרו antisense RNA שעתוק במבחנה על ידי מcDNAs תסיסנית באורך מלא מוגבר מפלסמידים נמצאו בדרוזופילה ג'ין האוסף (DGC), משאב המפורט באתר הבא: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html ^14,15. גיש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
T7, RNA פולימראז T3 או SP6	Fermentas מדעי חיים	EP0101, EP0111, EP0131	ערכות מכילות מאגר התגובה.
DIG-RNA תיוג מיקס	רוש יישומי מדע	11 277 073 910
RNAguard	Amersham Biosciences	27-0816-01
יצטט נתרן 3M
100% אתנול קר.
70% אתנול קר.
פתרון אקונומיקה מדוללת במים 01:01.
Heptane
מתנול
proteinase K	סיגמה אולדריץ Oakville, ON, קנדה	המספר P2308
40% תמיסת פורמלדהיד, מוכן טרי
PBS-Tween פתרון (PBT)		1xPBS, 0.1% Tween-20
גליצין פתרון		2 מ"ג / המ"ל גליצין בPBT
עכבר חד שבטי HRP-מצומדות אנטי DIG	ג'קסון ImmunoResearch מעבדות Inc	200-032 - 156	(דילול 1/400 של 1 מ"ג / מיליליטר פתרון המניות בPBTB
כבשי HRP-מצומדות אנטי DIG חד שבטיים	הרוש יישומית Science, Laval, QC	1 207 733	דילול 1/500 של פתרון המניות בPBTB
ביוטין מצומדות עכבר חד שבטי אנטי DIG	ג'קסון ImmunoResearch מעבדות בע"מ, מערב גרוב, פנסילבניה, ארה"ב	200-062-156	(דילול 1/400 של 1 מ"ג / מיליליטר פתרון המניות בPBTB
Streptavidin-HRP הצמוד	בדיקות מולקולריות, יוג'ין או, ארה"ב	S991	(דילול 1/100 של מניות 1 מיקרוגרם / מ"ל