ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

要約

ここでは、ホールマウント蛍光を記述その場でハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル、キイロショウジョウバエ。

要約

遺伝子の発現パターンだけでなく、その転写されたRNAの細胞内局在化特性を評価、開発中にその生物学的機能を理解するために重要な機能です。 in situハイブリダイゼーション 、RNA（RNA ISH）は、生物の、細胞または細胞内のレベル¹でそれである、RNAの分布特性を可視化するために使用される強力な方法です。 RNA-ISHはmRNAまたは関心²の非コーディングRNA標的の配列に相補的な標識核酸プローブ（ 例えば、アンチセンスRNA、オリゴヌクレオチド）のハイブリダイゼーションに基づいています。手順は配列特異的なプローブを生成するために単独で一次配列情報を必要として、それは普遍的に生物や組織標本³の広い範囲に適用することができます。実際、大規模なISHの多くの研究がにつながっている様々なモデル生物における遺伝子発現とRNA局在化ダイナミクスを文書化するために実装されています重要な地域資源の確立^4-11プローブのラベリングと検出、様々な戦略が長年にわたって開発されてきたが、蛍光標識された検出試薬と酵素信号増幅ステップの併用は、手順¹²の感度と分解能の大幅な機能強化を提供します。ここでは、段階的なショウジョウバエ胚におけるRNAの発現と局在の動態を可視化するためにチラミドシグナル増幅（TSA）を用いるin situハイブリダイゼーション法（FISH） に最適化された蛍光を記述します。手続きが大幅に多数のサンプルの同時処理を容易にする96ウェルPCRプレート形式で行われる。

プロトコル

1。 RNAプローブの調製

概要：次のセクションでは、魚に適したジゴキシゲニン（DIG）標識RNAプローブを作るために必要な手順を説明します。最初のステップは、クローニングや配列特異的なプローブを生成するために使用され、目的の遺伝子の転写領域に対応する配列を増幅するPCRを伴います。これは、複数のクローニング部位は、その後のプロモーター配列を組み込む隣接するプライマーを用いたPCRのテンプレートとして使用することができますバクテリオファージプロモーターエレメント（T7、T3またはSP6）が隣接したプラスミドへの最初のクローニング遺伝子セグメントによって達成することができる、このように各端で異なるプロモーター配列（ 図1A）と線形PCR産物を生成する。あるいは、クローニングステップを回避するために、1つはまた、T7、T3またはSP6配列が、5 '端で（ 例えば T7を含むオリゴヌクレオチドを用いて、ゲノムDNAまたはcDNAからPCR増幅を行うことができます。5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3：5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; SP6：5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '）。リニアPCR産物をランオフ適切なポリメラーゼ（ 図1B）を用いた in vitro 転写によりDIG標識センスまたはアンチセンスRNAプローブを作るためのテンプレートとして使用されます。特定の遺伝子に対するプローブを作るとき、私たちは魚のシグナル特異性（ すなわち 、目的の遺伝子をアンチセンス方向に転写されていない限り、評価するための参考になると明確なポリメラーゼを用いて、センスおよびアンチセンスRNAプローブの両方の準備をお勧めし、センスRNAプローブは、明らかにする背景信号のレベル）。次のすべての手順では、1は、（ 例えば 、水、最初の70％エタノールまたは商業アーゼ除染ソリューションをすべてベンチエリアや機器を洗浄することにより、RNaseフリー用品を使用することによって汚染リボヌクレアーゼ（RNaseが）することにより、潜在的な劣化を避けるために細心の注意を払うべきであるヒント、マイクロチューブ）。

マterials

• 1.5 mlのマイクロチューブ、（Abgene、ロチェスター、NY、アメリカカタログ番号0900）
• ゲル抽出キット（QIAGEN、ミシサガ、ON、カナダ;カタログ番号28706）。
• アーゼフリー水（ヴィセント株式会社カタログ番号809から115-CL）
• RNAポリメラーゼ（T7、T3、またはSP6）。 （20 U /μlで、フェルメンタスBiosciences社。カタログ番号EP0101、EP0111、EP0131）。
• アーゼ-OUTリボヌクレアーゼ阻害剤（40 U /μl）を、（インビトロジェン、バーリントン。Canada.Cat号10777から019 ON）です。
• ジゴキシゲニン（DIG）ヌクレオチドミックス（DIG-11-UTP、ロシュ·アプライド·サイエンス、ラヴァル、QC、カナダ。猫。No.11209256910）。

機器

• 卓上マイクロ遠心
• ゲル電気泳動装置

1. PCRは、バクテリオファージT7、T3またはSP6プロモーター配列が隣接線形PCR産物を生成するためにゲノムDNA、cDNA、またはプラスミドDNAから遺伝子特異的な配列を増幅する。 PCR条件については、製造元の推奨に従ってください。
2. 品質とsi​​を確認しますアガロースゲル電気泳動によるPCR産物のぜ。消費税​​及び勧告を製造し、緩衝液50μl中に生成物を溶出によると、標準ゲル抽出キットを用いてPCR産物を精製する。
3. 3M酢酸ナトリウム（pH5.2）と氷冷100％エタノールを150μlの5μlを添加してPCR産物を沈殿させ、-70℃で一晩チューブを配置します。 4℃で10分間13000×gで遠心すると沈殿を70％エタノールで洗浄してください。再びスピン、エタノールと空気ペレットを乾燥のすべてのトレースを削除します。 RNaseフリー水の25〜50μlに再懸濁する。
4. 10X T7転写緩衝液（Invitrogen）を2μl、RNaseインヒビター、2μlのDIG-NTPのミックスを1μl（20 U /μl）を次のように20μlの反応液で200から500 ngの精製したPCR産物を用いてDIGラベルされたプローブを書き写す、、2μlのT7 RNAポリメラーゼ（20 U /μl）を。 RNaseフリー水で20μlに最終的なボリュームを持ってきて。 3〜4時間、37℃で転写反応をインキュベートする。
5. transcを調整RNaseフリー水で50μlにriptionミックスとは、ステップ4で説明DIG標識RNAプローブを沈殿させた。 RNaseフリー水100μlで洗浄し、RNAペレットを再懸濁します。 -70℃で再懸濁したサンプルを保存
6. 光度計、分光光度計を用いてプローブを定量化する。プローブの品質を確認するには、エチジウムブロマイドで染色した1から2パーセントアガロースゲル上で1から2μlのサンプルを実行します。

2。 ショウジョウバエの胚の収集および固定

概要：このセクションでは、段階的なショウジョウバエの胚を収穫し、処理するための手順を説明します。必要とされる胚の数に応じて、ハエは様々なサイズの人口ケージに維持することができる。コレクションは100ミリメートルリンゴジュースコレクションプレートを用いて900センチメートル³円筒形のケージを使用して実行するため、次のステップは次のとおりです。適切な固定は胚を囲む2つの保護層の除去を必要とする：外側と内側の絨毛膜ビテリン電子膜^13。一度収穫し、胚を第一絨毛膜を除去するために、50％漂白剤溶液に浸され、次にそれらをヘプタン（卵黄膜をpermeabilizes）と、3.7％ホルムアルデヒドを含むPBSを含む二相溶液中で混合する。卵黄膜は、その後、ヘプタンとメタノールの混合物中に二相性の胚を転送することにより、ひび割れや削除されます。適切な胚の固定と卵黄膜の除去は、下流FISHの手順の成功のために重要である。

材料

• ダイムサイズの酵母ペースト（パン酵母、バターの一貫性に水と混合）とアップルジュース寒天プレート（40％りんご果汁、4％スクロース、3.5％寒天、0.3％メチルパラベン）
• 粉末状のパラホルムアルデヒド（電子顕微鏡学、ハットフィールド、ペンシルバニア州、アメリカ合衆国;。カタログ番号19208）
• ヘプタン
• メタノール
• 3％漂白剤溶液
• 20ミリリットルガラスシンチレーションバイアル（ON、カナダサーモフィッシャーサイエンティフィック、オタワ、;カタログ番号03から337-15）。

機器

• 人口ケージ
• コレクションバスケット（Nitexメッシュと穴が蓋にカットされたカット50mlポリプロピレンチューブの上部を使用して作られる）。
• 小さなペイントブラシ
• テーブルトップの渦

1. 25℃で1時間のために新鮮なリンゴジュース/酵母プレートと栄養の十分な人口ケージ事前クリア℃に
2. 初期段階の胚を収穫するためにケージに新しいりんごジュース/酵母プレートを追加します。 25℃で4時間のためにケージをインキュベート℃（収集時間は、所望の段階に応じて調整することができることに注意してください）​​。
3. 3.7グラムのパラホルムアルデヒド粉末、2NのKOH70μlの、化学ボンネットの下にガラスシンチレーションバイアル中のミリQ水7.3ミリリットルを組み合わせることにより、新鮮な37％ホルムアルデヒド溶液を調製します。パラホルムアルデヒド粉末が完全に溶解するまで新しいシンチレーションバイアルに入れ、室温およびフィルタへのその後涼しい、溶液を沸騰。
4. 相性によって固定液を調製その後ヘプタンの7.5 mlを加え、シンチレーションバイアル中の37％ホルムアルデヒド250ミリリットルでの1X PBS 2.25ミリリットルを組み合わせる。
5. ケージからリンゴジュースプレートを収穫し、室温の水道水のビットを追加し、微妙にペイントブラシでプレートから胚をブラッシングすることによって胚を収集します。バスケットに再懸濁させた胚を移し、ぬるま湯の水道水で洗い流してください。
6. 漂白剤溶液中でコレクションバスケットの入浴で90秒間Dechorionate胚は、その後ぬるま湯水道水（漂白剤の臭いがなくなるまで）で十分にすすいでください。
7. コレクションバスケットを分解し、優しく絵筆を使って胚を収集し、二相性の固定液にそれらを転送します。胚は、PBSおよびヘプタン層との間の界面に蓄積されます。
8. シールシンチレーションバイアル、ボルテックスミキサーに固定します。最低設定で20分間振とうする。
9. 取り外し、下PBSとパスツールピペットを用いて上部ヘプタン相の大部分を捨てる。吸引する残りのPBS /ヘプタン/胚ピペットへの混合物。滴下方式で、胚を排除しないように注意しながら、ピペットから下のPBS相を捨てる。 500μlのヘプタン（上相）の二相溶液を含む1.5 mlチューブに胚を堆積し、500μlのメタノール（下相）。
10. 卵黄膜をクラックするために30から45秒間手で激しく振ら。一度割れた、胚はメタノールにシンクします。
11. ヘプタン/メタノール相間上部ヘプタン相と未分解胚を破棄し、メタノール500μlを添加する。 5秒間振る。
12. メタノールで3回洗浄し、-20℃で胚を保存する（この時点で胚が週/月のために保存することができます）。

3。後固定処理、ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後の洗浄

概要：魚にこのセクションの詳細胚透過処理のための処理ステップの前に、プレハイブリダイゼーション、RNAプローブとハイブリダイゼーション後の洗浄とのハイブリダイゼーション。初期透過処理手順については胚は、単一のチューブ（下記の手順1-9、定住胚/サンプルの10〜15μLを目指す）のプールとして扱われていますが、96ウェルPCRプレートの各ウェルに分注しアールプレハイブリダイゼーション工程（下記手順10）に進む前に。これは実験の初期段階にあるすべての胚さえ治療を確保するために役立ちます。 FISH実験をセットアップするとき、それは個々の実験におけるバックグラウンド信号のレベルを決定するためにネガティブコントロールを含めることが重要です。このため、我々は 'no-プローブ'サンプルと、第1節で述べたように、 '意味'は一般的に 'no-プローブ'条件に匹敵する信号を与えるRNAプローブとハイブリダイズしたサンプルを含めることをお勧めします。

材料：

• メタノール
• リン酸塩は、0.1％のTween-20（PBT）で緩衝化生理食塩水
• プロテイナーゼK 1 mg / mlのストック溶液（シグマアルドリッチ、オークビル、オン、カナダ。商品番号P2308）
• グリシン（20 mg / mlの原液）
• ハイブリダイゼーション溶液：50％ホルムアミド、5×SSC、0.1％Tween-20を、剪断サケ精子DNAの100グラム/ミリリットル、100μg/ mlのヘパリン。
• 0.2ミリリットル、96ウェルPCRプレート、Abgene、ロチェスター、NY、アメリカの猫halfskirted。なし0900ありません）

機器

• ハイブリダイゼーションオーブン、56に調整可能なデジタル加熱ブロックまたはウォーターバス℃、80℃または100℃、またはPCRマシン。
• マルチチャンネルピペッター（洗浄工程を簡略化するために推奨）
• Nutatingミキサー

1. PBTで二回、PBT、および：メタノールの1:1混合物でその後、メタノール中で胚を洗浄します。
2. PBTはnutator上の一定ロッキングで3.7％ホルムアルデヒドを（ステップ11で説​​明したように新たに調製した）を含む1mlの20分間胚を固定します。
3. 揺らしながらPBTで2分間、3回の胚を洗浄します。
4. PBTとアドインで希釈したプロテイナーゼK（PK​​）の3μg/ mlの溶液を調製試料に溶液50​​0μl。振とうせずに室温で10分間、サンプルをインキュベートする。チューブやピペットで静かに反転させて噴射することにより胚ごとに2分を混ぜる。
5. 1時間氷上で胚サンプルを転送します。
6. 室温にサンプルを動かすとPK液を除去する。 PBT + 2 mg / mlのグリシン1mlで2分間2回洗浄する。
7. 揺らしながらPBT + 3.7％ホルムアルデヒド1mlのサンプルを20分を修正しました。胚のPBTで5回すすいでください。
8. PBTとHyb溶液の1:1混合物1mlで胚を洗浄します。 100パーセントHyb溶液（この段階で胚は-20℃で数日間/週間保存することができます）0.5〜1 mlと交換してください。
9. 96ウェルプレートの各ウェルに分注し胚（胚決済/ウェルの約10から15μLを目指し、胚の損傷を防ぐために、広い開口のヒントを使用するように注意してください）​​。
10. 5分間氷上でクールその後5分間Hybを溶液100μl/サンプルを沸騰させ。この溶液は、（プリHYB）サンプルプレハイブリダイゼーションのために使用さ。
11. プリHybを溶液100μl/サンプルを追加し、56℃で少なくとも2時間インキュベート℃、
12. 各サンプルについて、Hyb溶液100μlにプローブ〜100 ngを希釈します。 80℃熱℃で3分間インキュベート、5分（加熱プローブは数時間氷上に維持することができます）のために氷の上で涼しい。
13. 胚からプリHybに溶液を除去したRNAプローブ溶液と交換してください。
14. 12〜16時間、56℃でハイブリダイズする。
15. 56℃以下の洗浄溶液プリ暖かい℃：Hyb溶液の（）を200μl/サンプルHybを3:1の混合物（B）を100μl/サンプル：PBT、（C）の100μlのサンプル/ Hybを1:1の混合：PBT樹脂、（D）Hybを1:3の混合液100μl/サンプル：PBT、（E）PBTの400μL/サンプル。
16. 洗浄液100μlで試料をすすぎ、その後15分ごとに56のソリューション·ADの100μl/サンプルと、洗浄工程°Cを実行します。その後、56℃で溶液Eを100μl/サンプルで5分間のサンプルを4回洗浄
17. 室温まで冷却するサンプル。

4。プローブ検出

概要：このセクションでは、ハイブリダイゼーション後のRNAプローブ信号の分布を検出し、視覚化するために使用する抗体および検出試薬について説明します。これらの手順は、 図2に模式的に概説されています。ここで我々は強固な信号増幅のために使用する標準的な検出試薬のみを提示したが、タンパク質-RNA二重のために同時に異なるRNAを共同検出するためにダブルFISH実験を実行する場合は特に、様々な代替手段として使用することができ、市販の試薬を、存在染色。このプロトコルで得られた結果の例を図3のmRNA発現/局在パターンモザイクで表示されます。

材料

• HRP標識マウスモノクローナル抗DIG（ジャクソンイムノリサーチ·ラボラトリーズ社のカタログ番号200-032-156）
• ビオチン結合マウスモノクローナル抗DIG（ジャクソン-3269oResearchラボラトリーズ猫。番号200-062-156）
• ストレプトアビジン-H​​RPコンジュゲート（Molecular Probes社、ユージーン、OR、アメリカ合衆国、猫。No.S991）
• Cy3標識チラミド複合体（パーキンエルマーライフサイエンス、ボストン、MA、アメリカ合衆国、カタログ番号SAT704A）
• ダブコは、ソリューションを実装：50 mlチューブでは、DABCOの1.25グラム（1,4 - ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン、シグマD-2522）を希釈するの1X PBS 15mlにし、完全になるまで、グリセロールとミックスの35ミリリットルを追加均質。 PBSで予備混合することによって、DABCO粉末は非常に迅速に溶解する。 -20℃で保存してマウントソリューション
• スライドガラス、カバーガラス

機器

• Nutatingミキサー
• マルチチャンネルピペッター
• 蛍光顕微鏡

1. PBTBソリューション、（通常50〜100ミリリットルは、すべて検出試薬のインキュベーションおよび洗浄工程のために十分である）PBT + 1％脱脂粉乳を含むを準備します。
2. nutatorに揺らしながら、100μlのPBTB /試料に室温で10分間サンプルをブロックします。
3. 揺らしながら100μlのサンプル/ビオチンモノクローナル抗DIG抗体溶液（PBTBに株式から1/400に希釈）を用いて室温で1.5から2時間インキュベートした胚サンプルからブロッキング溶液を除去します。
4. それぞれが揺らしながら、100μlのPBTB /サンプルと、5分間のサンプルを6回洗浄します。
5. ロッキングとストレプトアビジン-H​​RP溶液（PBTB、10μg/ mlの最終濃度で在庫から1/100に希釈したもの）の75ミリリットル/試料を用いて室温で1.5時間インキュベートします。
6. サンプルを5分間6回揺らしながら100μlずつPBTB /サンプル（DNAの対比のために、PBTBで1X作業濃度にDAPIを希釈し、最初の洗浄工程において、このソリューションを使用）洗います。
7. PBTで胚をすすぎ、その後、PBSで5分間2回洗浄する。
8. Cy3標識チラミド液（チラミド増幅バッファに1/50希釈）50μlのサンプル/とnutator、室温で2時間インキュベートする。上のこのステップから、遮光容器にサンプルを保つようにしてください。
9. サンプルをnutatorに100μlのPBS /サンプルで5分間ずつ6回洗浄する。
10. PBSを除去し、70％グリセロール、2.5％（DABCO）を含むマウントソリューションの100から125 /μLのサンプルを追加します。ストアサンプル4℃これらのサンプルは数年間保存することができます。
11. ワイドボアチップを使って、次に指の爪ポリッシュとスライド上胚およびシールの上にカバースリップを置き、静かにサンプルをピとスライドガラス上に胚の25μlを移すことによって胚を再懸濁します。
12. 蛍光顕微鏡を用いて胚サンプルを分析します。

結果

正常に実行されている場合、このプロシージャは、初期のショウジョウバエの胚発生における遺伝子発現とmRNA局在化ダイナミクスの時空間分析の細部の著しく強化されたレベルを提供しています。古典的なペアルール遺伝子ラント （ ラン ）のために、図3Aに示すように、確かに、1つは核を表現するグループの新生転写産物病巣の検出を介して遺伝子発現の?...

ディスカッション

プローブ合成の手順については、我々は通常、 ショウジョウバエ遺伝子コレクション（DGC）は、次のWebサイトで詳細なリソースで見つかったプラスミドから増幅された完全長cDNAからショウジョウバエのin vitro転写によりランオフアンチセンスRNAプローブを生成： のhttp://www .fruitfly.org / DGC / index.htmlを ^14,15。このアプロ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
T7、T3またはSP6 RNAポリメラーゼ	フェルメンタスライフサイエンス	EP0101、EP0111、EP0131	キットは、反応緩衝液を含んでいます。
DIG RNAラベリングミックス	ロシュ·ダイアグノスティックス	11 277 073 910
RNAguard	アマシャムバイオサイエンス	27-0816-01
3M酢酸ナトリウム
冷たい100％エタノール。
冷70％エタノール。
塩素系漂白剤の溶液を水で1:1に希釈した。
ヘプタン
メタノール
プロテイナーゼK	シグマアルドリッチオークビル、ON、カナダ	商品番号P2308
新たに調製し、40％ホルムアルデヒド溶液、
をPBS-Tween溶液（PBT）		1xPBS、0.1％Tween-20を
グリシン溶液		PBTで2 mg / mlのグリシン
HRP標識マウスモノクローナル抗DIG	ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ株式会社	200から032 - 156	（PBTBで1 mg / mlの原液の400分の1希釈
HRP結合ヒツジモノクローナル抗DIG	ロシュ·アプライド·科学者CE、ラヴァル、QC	1 207 733	PBTBで原液の1/500希釈
ビオチン結合マウスモノクローナル抗DIG	ジャクソンイムノリサーチ·ラボラトリーズ社、ウェストグローブ、ペンシルバニア州、アメリカ合衆国	200-062-156	（PBTBで1 mg / mlの原液の400分の1希釈
ストレプトアビジン-H​​RPコンジュゲート	Molecular Probes社、ユージーン、OR、アメリカ合衆国	S991	（1μg/ mlの株式の1/100希釈