Gene reventado Usando Gal4 en pez cebra

Resumen

Este protocolo describe el método de trampa de genes inserción mutagénesis usando Gal4-VP16 como el reportero principal y GFP / RFP como reporteros secundarias en el pez cebra. Aproximadamente uno de cada diez-alta expresión de genes rendimiento pesquero F0 trampa progenie co-expresión de las buenas prácticas agrarias y RFP. El procedimiento de detección se puede escalar fácilmente para adaptarse al tamaño de la pantalla de laboratorio que realice la mutagénesis de inserción.

Resumen

Tamaño de la nidada grande exterior y el desarrollo de los embriones ópticamente transparentes hacen que el pez cebra un modelo de sistema de vertebrados excepcional para in vivo mediante mutagénesis de inserción reporteros fluorescentes para etiquetar la expresión de los genes mutados. Varios laboratorios han construido y probado vectores potenciador-y gen-trampa en el pez cebra, el uso de proteínas fluorescentes, activadores transcripcionales basados ​​en lexA Gal4-y como reporteros ^1-7. Estos vectores tienen dos inconvenientes potenciales: rigurosidad subóptima (por ejemplo, la falta de capacidad para diferenciar entre eventos potenciador-y gen-trampa) y bajo la mutagenicidad (por ejemplo, las integraciones en genes raramente producidos alelos nulos). Gene Breaking Transposón (GBTS) fueron desarrollados para hacer frente a estos inconvenientes ^8-10. Hemos modificado uno de los primeros vectores GBT, GBT-R15, para uso con Gal4-VP16 como el reportero trampa de genes primaria y UAS añadido: eGFP como el reportero secundaria para la detección directa de eventos de genes trampa. Laplicación de Gal4-VP16 como la trampa del gen indicador primario proporciona dos ventajas principales. En primer lugar, aumenta la sensibilidad de los genes expresados ​​en los niveles de expresión bajos. En segundo lugar, permite a los investigadores utilizar líneas de trampas génicas como conductores Gal4 a la expresión directa de otros transgenes en los tejidos muy específicos. Esto es especialmente pertinente para los genes con funciones no esenciales o redundantes, donde la integración trampa de genes puede no dar lugar a fenotipos manifiestos. La desventaja de usar Gal4-VP16 como la trampa de genes reportero primaria es que los genes que codifican para proteínas con secuencias de señal N-terminal no son susceptibles de atrapar, como son poco probable que sea capaz de entrar en el núcleo de las proteínas de fusión de Gal4-VP16 resultantes y activan la transcripción. Es importante destacar que el uso de Gal4-VP16 no preseleccionar para las proteínas nucleares: recuperamos mutaciones de genes trampa en los genes que codifican las proteínas que funcionan en el núcleo, el citoplasma y la membrana plasmática.

Introducción

Mutagénesis insercional ha demostrado ser un enfoque poderoso para la disección de la función de genes en diversos sistemas modelo a partir de organismos unicelulares como las bacterias y levaduras para los organismos multicelulares tales como los ratones y las plantas. Cualquier ADN exógeno (virus, plásmido o transposón) puede servir como un mutágeno mediante la interrupción de los elementos esenciales de los genes tales como exones o promotores. El objetivo efectivo de tales enfoques simples es extremadamente pequeña en grandes genomas complejos, ya que los exones representan sólo el 1-3% de un genoma típico de los vertebrados. Tamaño de destino efectivo pequeño puede ser superada por las tasas de integración muy alto por vectores, como lo demuestra el tremendo éxito de la mutagénesis de inserción retroviral en el pez cebra ^11,12. Por el contrario, los intrones comprenden aproximadamente el 20-30% de los genomas de vertebrados. En el pez cebra, vectores de mutagénesis de inserción basado en transposón que introducen efectivamente nulo o hypomorphic mutaciones severas sobre la integración en los intrones se han llamado "gen romper transposons "(GBTS) ^8-10. Para la integración eficiente trampa de genes, que utilizan un transposón mínima Tol2 ^13,14. Mutagenicidad de GBTS se basa en peces derivados de aceptor de empalme y secuencias de terminación / poliadenilación de la transcripción. Los elementos responsables de GBT mutagenicidad están flanqueadas por sitios loxP directos para la escisión por la recombinasa Cre. Por lo tanto, la inyección de ARNm de Cre conduce a la reversión eficiente de mutaciones inducidas por GBT, a pesar de que algunas secuencias de transposones permanecen en el locus de integración ^{de 9,10.}

Los vectores GBT recientemente publicados utilizan mRFP como el reportero ^9,10 trampa de genes, dando lugar a dos posibles deficiencias. En primer lugar, no se sabe qué fracción de los genes de pez cebra se expresa a un nivel lo suficientemente alto para ser detectados por las proteínas de fusión reportero directos fluorescentes. En segundo lugar, se espera que sólo un pequeño subconjunto de los genes que tienen funciones esenciales. Se ha estimado que sólo hay 1,400-2,400 genes necesarios para desarroll pez cebrant ^15,16. No se espera que la mayoría de los mutantes de genes trampa para mostrar fenotipos abiertas y por lo tanto tendrá una utilidad limitada. Para superar estas dos limitaciones, hemos modificado GBT-R15 ^9,10 a utilizar con Gal4-VP16 como el reportero trampa de genes primaria (Balciuniene et al. En preparación). Al igual que en agosto, menos mRFP en GBT-R15, el sitio de inicio de la traducción fue retirado de Gal4-VP16. Para la detección directa de eventos de trampa de genes, nuestros vectores contienen un reportero EGFP bajo el control de 14x Gal4 UAS ^17,18.

Varias características adicionales se han diseñado en nuestra bipartito trampa de genes del vector. Los UAS casete eGFP está flanqueado por sitios FRT directos (chevrons grises en la Figura 1). La inyección de la recombinasa Flp mRNA lleva a la escisión de los UAS: Casete eGFP, dejando a la mutación de genes trampa desmarcado por eGFP fluorescencia. Entonces puede ser utilizado en las líneas transgénicas que marcan los tejidos específicos o eventos de desarrollo de la fluorescencia de GFP. Al igual que en otraGBTS, todo el casete de trampa de genes está flanqueado por sitios loxP directos (pentágonos abiertos en la Figura 1). Esto hace que los eventos de genes trampa reversible mediante la expresión de la recombinasa Cre, se establece fácilmente una prueba de relación de causalidad entre una integración específica de trampa de genes y fenotipo observado (Figura 2). Finalmente, la casete de trampa de genes está flanqueado por sitios de meganucleasa I-SceI invertidas (triángulos negros en la Figura 1). En Drosophila, integraciones transposón a menudo se convierten a deleciones (deficiencias) por escisión imprecisa del elemento P. No hay evidencia de que la escisión del transposón Tol2 (o cualquier otro transposón activo en los vertebrados, como la Bella Durmiente, PiggyBac o Ac / Ds) puede dar lugar a supresiones. Por lo tanto, se incluyeron sitios de I-SceI como un método sustituto potencial para la inducción de deleciones, a pesar de que no hay evidencia de que la I-SceI puede inducir deleciones en el pez cebra. Cabe señalar que mientras que la I-SceI Meganucleasa se ​​puede utilizar para facilitar la transgénesis en el pez cebra, la escisión de ADN por meganucleasa I-SCE se usa para estudiar los mecanismos de reparación del ADN, incluyendo propenso a errores de extremos no homólogos de unión, en la levadura y células de mamíferos ^19-22.

La integración de nuestra trampa gen vector puede dar lugar a la expresión de eGFP por dos mecanismos diferentes. El primero es un verdadero acontecimiento trampa de genes (Figura 1 C): el vector se integra en un gen (IMG para insertionally gen mutado), una transcripción de la fusión entre el 5 'del transcrito endógeno IMG y la Gal4-VP16 se hace y se tradujo en una proteína de fusión que contiene el N-terminal de la proteína codificada por IMG y Gal4-VP16. Esta proteína de fusión se une a los 14x UAS y activa la transcripción de EGFP. El segundo evento, menos deseable es un potenciador trampa (Figura 1D): el promotor mínimo delante de eGFP cae bajo el control de un promotor de cerca del sitio de integración, que conduce a la producción de EGFP en el ABsencia de producción Gal4-VP16. En nuestra estimación, el 30-50% de los eventos EGFP expresión se deben a una trampa potenciador y un 50-70% se debe a una trampa gen ²³ (Balciuniene et al., En preparación). Para distinguir entre estas dos clases de eventos, hemos hecho una 14xUAS: mRFP línea transgénica (Figura 1B), por conveniencia marcada por la lente específica γCry: (. Balciuniene et al, en preparación) GFP. Eventos trampa de genes se verifican por la co-expresión de GFP y RFP (comparar C y D en la Figura 2).

En la pantalla de nuestro piloto, hemos recuperado más de 40 eventos de genes trampa después de cribado 270 F0 peces inyectados con una mezcla de ADN transposón y mRNA transposasa. Dos de nuestras integraciones genes trampa se han producido en los genes con los publicados anteriormente mutantes inducidos químicamente: NSF y la RPF. Los fenotipos de los mutantes de inserción nuestra ^tpl6 nsf y ^tpl24 flr son superficialmente indistinguible del fenotipos de los correspondientes mutantes inducidos químicamente. También tomamos nota de que los acontecimientos de genes trampa aparecen sesgados hacia los intrones cerca del extremo 5 'de los genes, lo que aumenta la probabilidad de alelos nulos. Hacemos observar algún grado de UAS silenciamiento (variegación) en todas nuestras líneas de genes trampa, y algunos loci son claramente más susceptibles al abigarramiento que otros. No creemos que la UAS silenciamiento es un problema importante para la propagación de las líneas de genes trampa, ya que hemos sido capaces de propagarse fácilmente todas nuestras líneas de trampa de genes a través de al menos cinco generaciones mediante la selección de la expresión de GFP sola.

Protocolo

1. La producción de la generación F0 por microinyección de la Trampa de Gene.

Hemos encontrado que los embriones de diferentes orígenes genéticos muestran diferentes tolerancias a este procedimiento, con el tipo salvaje basado pet-store-and Tubinga - Long Fin (TLF) el más tolerante mientras que las cepas AB y Tubinga tienen peor supervivencia.

1. Preparación de ADN transposón. Preparar GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al., En preparación) ADN plásmido utilizando el kit QIAprep miniprep estándar (Qiagen 27106). Es esencial incluir la etapa de lavado PB (que es opcional en el procedimiento QIAprep), de lo contrario el ADN miniprep se contaminará por la RNasa A, que conduce a la degradación del ARNm de la transposasa. Antes de la inyección, se diluye la DNA en agua libre de RNasa (Ambion AM9937) a 10 ng / l.
2. Preparación de ARNm de transposasa. Linealizar pT3TS/Tol2 (pDB600) ¹³ utilizando XbaI y transcribir el ADN linearizado utilizando una máquina T3 mMessage(Ambion AM1348) en el kit de transcripción in vitro. Hemos modificado la reacción de transcripción in vitro por la adición de 0,5 l de inhibidor de RNasa RiboLock (ThermoFisher Fermentas EO0381). Después de la etapa de tratamiento DNasa, purificar mRNA utilizando un kit RNeasy MinElute (Qiagen 74204). Evaluar la calidad de la vitro ARNm transcrito por electroforesis en gel de agarosa. Diluir el mRNA en RNasa libre de agua a 40 ng / l, y almacena como 2 alícuotas a -80 ° C.
3. Preparación de la mezcla de microinyección. Antes de la inyección, añada 8 l de ADN transposón diluido a una alícuota de 2 l de mRNA transposasa.
4. La microinyección. Inyectar 3 nl de mezcla de ADN / ARN en la yema de 1 embriones de pez cebra celular utilizando técnicas de microinyección estándar, con el objetivo para el interfaz yema / blastómeros. Recoger los embriones cada 20 minutos para asegurar la inyección en la etapa celular 1. En nuestra experiencia, una persona hábil puede inyectar fácilmente 1.000 embriones en 1-1.5 horas.
5. Después de la inyección, ejecute 5 l de izquierdamás de la solución de inyección en un gel de agarosa al 1% para el control de calidad, para asegurar que el ARNm de la transposasa no se ha degradado.
6. Cuidado embrión inyectado. En la tarde, eliminar embriones fecundados y anormales y distribuir embriones de 60 a 80 por cada 100 mm placa de Petri. Embriones anormales y muertas se eliminan después de la fecundación en 1 día (dpf), 2 dpf y 3 dpf.
7. La detección de la expresión de GFP. Embriones pantalla sin defectos manifiestos de la fluorescencia de GFP en 3 fdd (Figura 3). La detección puede hacerse ya sea en un microscopio estereoscópico equipado con fluorescencia (Nikon usamos un SMZ1500) o en un microscopio vertical (usamos un Zeiss AxioImager con un objetivo de 5X Fluar). Bajo la expresión de GFP indica la inyección sin éxito o la degradación de ARN transposasa debido a la contaminación de RNasa (Figura 3A). Seleccionar aproximadamente el 30% de los embriones más brillantes que, o bien tienen la expresión de GFP en varios tejidos o en un alto porcentaje de células de un tejido específico (comparar Figuras 3B y 3C). Desde una inyección de 1.000 embriones, por lo general tienen un máximo de 100 altas que expresan GFP embriones de desarrollo normales,.
8. Levante embriones F0 seleccionados mediante procedimientos de cría de peces cebra normales. Es razonable esperar que el 20-30% de los embriones inyectados seleccionados para la cría va a sobrevivir hasta la edad adulta.

2. Mantenimiento de los UAS: mRFP Tester Line.

Hemos generado un 14xUAS: Línea mRFP marcado por γCry-lente específica: las buenas prácticas agrarias. Desde UAS está sujeta a silenciar a través de la metilación del ADN, es importante seleccionar el pescado con niveles bajos de silenciamiento para propagar la acción.

1. Configure UAS individuo: homocigotos mRFP para aparearse con uno de nuestros más confiables Gal4 trampa líneas gene, ^tpl6 nsf (Balciuniene y otros en preparación.).
2. En el día siguiente, transferir la UAS: peces mRFP que dieron los embriones a los tanques estáticos individuales, mientras que se recogen los embrionesy limpiado.
3. Embriones de malla para las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia a 1 dpf y 3 dpf.
4. Peces Intercross que dio embriones con alta expresión mRFP para establecer la próxima generación de UAS: Línea mRFP.

3. Proyección de la F0 Fish.

1. Cruce F0 individual con la UAS homocigotos: peces mRFP (Figura 4). Por lo general, inyectamos nuestros GBTS en líneas con patrones de tipo salvaje o de pigmentación de leopardo, y nuestros UAS homocigotos: Línea mRFP es en latón. Por lo tanto los peces inyectados F0-GBT puede diferenciarse fácilmente de los UAS: peces mRFP, eliminando la necesidad de registrar si el F0 estar estudiadas era un hombre o una mujer, así como los posibles errores resultantes de errores en el registro y / o que determinan el sexo de cada pez. Por lo tanto, personal con experiencia muy limitada, tales somos estudiantes universitarios, son capaces de crear y romper los apareamientos de pescado. Este enfoque tiene la desventaja de que dos fondos genéticos diferentes sonsiendo utilizado, complicando potencialmente la interpretación de la pérdida de función de fenotipos.
2. Al día siguiente, devolver los UAS de latón: peces mRFP a su tanque. Coloque el pescado F0 que dio embriones en tanques estáticos individuales (usamos Hagen Exo Terra Faunarium Pequeño, pero cualquier pequeño tanque se puede utilizar para este propósito), mientras que los embriones son recogidos y examinados.
3. Limpie y transferencia de embriones recolectados en nuevas placas de Petri (<100 por placa) en la tarde del día 0.
4. Embriones de malla para las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia a 1 dpf, 2 y 3 fdd fdd. Tire de embriones positivos tanto para las buenas prácticas agrarias y RFP, ordenarlas por patrón de expresión de GFP / RFP (si más de un patrón se observa en un embrague) y criarlos para establecer la generación F1.
5. La eutanasia a los peces F0 que produjo sólo los embriones negativos (de un total de 50 a 100 embriones).
6. Cruce el pescado F0 que produjo GFP / progenie RFP-positivo de nuevo para obtener una segunda tanda de positivos.

4.Proyección de la F1 Fish.

El pescado F1 son examinados para establecer familias F2, para documentar el patrón de expresión de genes y la trampa para congelar lotes de embriones para la identificación molecular de trampa de genes loci por 5 'RACE y PCR inversa.

1. Cruce de pescado individual F1 con la UAS homocigotos: peces mRFP (Figura 4).
2. Al día siguiente, coloque el pescado F1 que le dio a los embriones en tanques estáticos individuales, mientras que los embriones son recogidos y examinados.
3. Embriones de malla para las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia a 1 dpf, 2 y 3 fdd fdd. Embriones separados y fotografiar positivos tanto para las buenas prácticas agrarias y RFP ^24.
4. A las 5 dpf, congelar lotes de 20 GFP / RFP-positivo y 20 GFP / embriones-RFP negativo para la identificación de genes mutados insertionally mediante PCR inversa y 5 'RACE ^9,10. Levante restantes GFP / embriones RFP-positivas para establecer la generación F2.

Resultados

En una inyección de éxito, al menos 80% de los embriones inyectados con la trampa de genes de ADN / Tol2 transposasa mezcla ARNm mostrar un cierto grado de fluorescencia de GFP (Figura 3). Cuando se seleccionan las más brillantes embriones GFP-positivas (Figura 3C) para establecer la piscina F0, aproximadamente uno de cada 10 peces examinados F0 rendirá gen trampa progenie. Entre los peces F0 de la que se recuperan eventos de trampa de genes, más transmitir un único evento de trampa de genes, además de varias integraciones transposón no expresan. Sin embargo, hemos establecido hasta cuatro líneas de genes trampa de un solo individuo F0. Los patrones de expresión de GFP / RFP en líneas de trampa de genes van desde muy específico de tejido (por ejemplo, en bulbos olfativos) a bastante ubicua.

Figura 1. Tque contiene GAL4-bipartita vector de trampa de genes-GBT B1 y sus aplicaciones. A. Componentes de la trampa de genes del vector Gal4-que contiene: Tol2 5 'y Tol2 3', minimal transposón Tol2 termina ^13; CSA, Carpa β-actina aceptor de empalme ^8; ^ Gal4-VP16, agosto-Gal4-VP16 menos; zp ( A), β-actina UTR y poli pez cebra 3 '(A) elementos de GBT-R15 ^9,10. 14XUAS, eGFP y SV40 p (A) son componentes de la UAS: caja de expresión eGFP ^17,18. La flecha indica la activación de la UAS: eGFP por Gal4-VP16 producido por la trampa de genes B. El 14XUAS:. MRFP transgén marcado por una γCry-lente específica: Casete GFP. La flecha indica la activación de la UAS: mRFP por Gal4-VP16 en trans evento trampa C. Gene.. Cajas azules son exones. El empalme se indica por la línea de trazos. Evento trampa D. Enhancer. La integración del vector cerca de un promotor (caja marrón) puede colocar el promotor mínimo EGFP bajo el control de este potenciador (flecha marrón). Esto daría lugar a una expresión específica de tejido de eGFP, pero desde Gal4-VP16 no se hace, la expresión mRFP no estaría activado.

Figura 2. Reversión de los acontecimientos de genes trampa utilizando la recombinasa Cre. A, B. Diagrama de una mutación trampa de genes (A) y vuelto-Cre trampa de genes alelo (B). C, D. Co-expresión de GFP (C) y RFP (D) en el sistema nervioso del gen ^tpl6 NSF línea de trampas. E, F. La inyección de Cre ARN en embriones ^tpl6 nsf conduce a la pérdida de las buenas prácticas agrarias (E) y RFP expresión (F). Tenga en cuenta que no hay una reducción de la expresión de GFP en la lente, como se esperaba.

Figura 3. Los embriones inyectados con el GBT-B1 (pDB783) trampa de genes. . A. Los embriones inyectados con pGBT-B1 (pDB783) pantalla solo poca fluorescencia de GFP en el cuerpo B, C. Los embriones inyectados con pGBT-B1 y Tol2 mRNA transposasa: un grupo aleatorio de embriones (B) y de alta expresores seleccionados para la cría (C).

Figura 4. Esquema experimental para el establecimiento de líneas Gal4 trampa de genes. Estructuras rojas / verde Parcialmente superpuestos indican co-expresión de las buenas prácticas agrarias y RFP, mientras que el verde por sí solo indica mosaicismo para eventos de genes trampa o potenciador trampa.

Discusión

Los vectores de genes trampa y la metodología descritos aquí ya están siendo utilizados en varios laboratorios independientes. En nuestra experiencia, hay dos pasos fundamentales en el proceso. El primer paso fundamental es lograr altos índices de integración trampa de genes en embriones inyectados F0. El fracaso en este paso a menudo se puede atribuir a la contaminación de RNasa de los reactivos de inyección, especialmente el ADN miniprep. También es muy importante para inyectar embriones en la etapa de 1 célula para atrapar gen experimentos. En nuestra experiencia, la transgénesis mediada por Tol2 es muy eficiente, por lo que es posible la obtención de líneas transgénicas incluso cuando se inyecta más tarde de la etapa 1 con el ADN celular o de menor calidad. Inyecciones de baja calidad es mucho más problemática cuando se lleva a cabo mutagénesis de trampa de genes, ya que sólo una pequeña fracción de las integraciones vector resulta en eventos efectivos de genes trampa. El segundo paso crítico es determinar los eventos de trampa de genes cruzando a nuestro UAS: Línea mRFP. Ausencia de expresión mRFP escasi siempre indicativa de un evento potenciador trampa. Sin embargo, a veces la falta de expresión mRFP puede indicar el silenciamiento de los 14x UAS. Por tanto, es importante mantener los UAS: Línea mRFP en un estado no silenciada mediante la propagación de la próxima generación utilizando individuos con alta expresión de RFP cuando se cruzan a ^tpl6 nsf.

Podemos prever hacer una serie de mejoras a nuestros vectores de genes trampa y protocolo. El primero es el uso de un UAS menos repetitivas en la trampa de genes constructo. Se ha demostrado que una 5x UAS es suficiente para lograr la activación completa en experimentos de cultivo de células, y que las secuencias UAS menos repetitivas son menos susceptibles a la metilación y el silenciamiento de ^6,25. También puede ser posible diseñar vectores trampa de genes para la mutagénesis totalmente condicional, en analogía a los vectores utilizados por el ratón trampa de genes consorcio internacional y recientemente adaptados para el pez cebra ^2,26,27. Otra mejora sería utilizar un t diferentesistema ransposon, por ejemplo la bella durmiente ^28, para generar un UAS: Línea reportero mRFP. Esto permitiría la inyección de trampas de genes basados ​​en Tol2 directamente en la línea de reportero y el cribado de F0s por incrossing. Además, esto eliminaría el uso de dos fondos genéticos diferentes, por lo que la interpretación de la pérdida de función de los fenotipos más sencillo. Incluso con estas mejoras, el Gal4 trampa de genes protocolo general que se presenta aquí seguiría siendo plenamente aplicables.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miniprep Kit	Qiagen	27104	Optional PB wash step is a must
XbaI restriction enzyme	ThermoFisher	ER0681
mMessage Machine T3	Ambion	AM1348
RiboLock RNase Inhibitor	ThermoFisher	EO0381
RNeasy MinElute	Qiagen	74204	Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl!
Nuclease-free water	Ambion	AM9937	Has to be non-DEPC treated
Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles	World Precision Instruments	1B100F-4
Microcapiliaries for calibration	Drummond Scientific	1-000-0010
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003
Needle puller *	Sutter Instruments	P-87
Stereomicroscope for microinjection *	Nikon	SMZ1500	We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand
Picoinjector *	Harvard Instruments	Pli-90	We also use Pli-100
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *	Zeiss	Zeiss AxioImager	5X Fluar objective has sufficient working distance
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *	Nikon	SMZ1500
* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.