Джин Захват Использование Gal4 в данио рерио

Резюме

Этот протокол описывает метод генной ловушки инсерционного мутагенеза с использованием Gal4-VP16 в качестве основного репортера и GFP / RFP качестве вторичного журналистами в рыбок данио. Примерно один из десяти высокого выражения F0 гена выход рыбы ловушки потомство коэкспрессирующей GFP и RFP. Процедура скрининга могут быть легко масштабируется для адаптации к размеру лабораторией, проводящей инсерционного мутагенеза экран.

Аннотация

Большой размер сцепления и внешний развитие оптически прозрачных эмбрионах сделать данио исключительную позвоночных модельную систему для инсерционного мутагенеза в естественных условиях с использованием флуоресцентных журналистам помечать выражение мутировавших генов. Несколько лабораторий изготовлены и испытаны энхансерные-и ген-ловушки векторы у рыбок данио, используя флуоресцентные белки, Gal4-и Лекса основе активаторы транскрипции как репортеров ^1-7. Эти векторы было два потенциальных недостатка: субоптимальный строгость (например, отсутствие способности различать энхансерных-и ген-ловушки событий) и низкой мутагенность (например, интеграции в генах редко производимых нулевые аллели). Джин Главные транспозонов (ГБЦ) были разработаны для удовлетворения этих недостатков ^8-10. Мы модифицировали один из первых векторов ББТ, GBT-R15, для использования с GAL4-VP16 в качестве основного гена-репортера ловушки и добавили UAS: EGFP в качестве вторичного репортера прямого обнаружения генной ловушки событий.РИМЕНЕНИЕ из Gal4-VP16 в качестве основного гена ловушки репортер предоставляет два основных преимущества. Во-первых, это повышает чувствительность генов, выраженных при низких уровней экспрессии. Во-вторых, это позволяет использовать исследователей генной ловушки линии, как Gal4 драйверов в непосредственной экспрессии трансгенов в других очень специфических тканей. Это особенно актуально для генов с несущественных или избыточных функций, где интеграция гена ловушка не может привести к явных фенотипов. Недостатком использования GAL4-VP16 в качестве основного гена ловушки репортера в том, что гены, кодирующие белки с сигнальных последовательностей N-концевых не поддаются захвата, так как в результате слитые белки GAL4-VP16, вряд ли будут способны проникать в ядро ​​и активировать транскрипция. Важно отметить, что использование Gal4-VP16 не заранее выбрать для ядерных белков: мы выздоровел генной ловушки мутации в генах, кодирующих белки, которые функционируют в ядре, цитоплазме и мембране.

Введение

Инсерционного мутагенеза оказалась мощным подход к рассекает функции генов в различных модельных системах от одноклеточных организмов, таких как бактерии и дрожжи, чтобы многоклеточных организмов, таких как мыши и растений. Любой экзогенный DNA (вирус, транспозона или плазмида) может служить в качестве мутагена, прерывая основные элементы генов, таких как экзонов или промоторов. Эффективная цель таких простых подходов чрезвычайно мала в больших сложных геномов, так как экзоны составляют лишь 1-3% от типичной позвоночных геном. Малый эффективный размер мишени могут быть преодолены очень высокая векторных ставок интеграции, о чем свидетельствует огромный успех ретровирусов инсерционного мутагенеза в данио ^11,12. В противоположность этому, интроны включают приблизительно 20-30% геномах позвоночных. У рыбок данио транспозонов основе инсерционных мутагенеза векторов, которые эффективно ввести нуль-или серьезные гипоморфных мутации при интегрировании в интронов были названы "ген нарушая transposoнс "(ГБЦ) ^8-10. Для эффективной интеграции ген ловушки, они используют минимальное Tol2 транспозон ^13,14. Мутагенность ГБЦ полагается на рыб, полученных сращивания акцептора и транскрипционных последовательностей прекращение / полиаденилирования. Элементы, ответственные за ББТ мутагенность фланкированы на прямых участках LoxP для удаления по Cre рекомбиназы. Таким образом, инъекции Cre мРНК приводит к эффективному реверсии GBT-индуцированных мутаций, хотя некоторые транспозонов последовательности остаются в локусе интеграции ^9,10.

Недавно опубликованные векторы ББТ использовать MRFP как ген ловушки репортера ^9,10, что приводит к двух потенциальных недостатков. Во-первых, не известно, какая часть данио генов экспрессируются на достаточно высоком уровне, чтобы быть обнаружены путем прямых флуоресцентных белков репортер синтеза. Во-вторых, только небольшое подмножество генов, как ожидается, имеют существенные функции. Было подсчитано, что есть только 1,400-2,400 гены, необходимые для рыбок данио Developmeнт ^15,16. Большинство генов ловушки мутанты не ожидается проявляют явных фенотипы и поэтому будет иметь ограниченное применение. Чтобы преодолеть эти два ограничения, мы изменили GBT-R15 ^9,10 для использования с Gal4-VP16 в качестве основного гена ловушки репортера (Balciuniene и соавт. В стадии подготовки). Как и АВГ-менее MRFP в ББТ-R15, начало перевод сайта был удален из Gal4-VP16. Для прямого обнаружения гена ловушки событий, наши векторы содержат корреспонденту EGFP под контролем 14x Gal4 БАС ^17,18.

Несколько дополнительных функций разработаны в нашей двустороннего вектора генной ловушки. УАС: EGFP кассета в окружении прямых участках FRT (серые стрелки на рисунке 1). Инъекция Flp рекомбиназы мРНК приводит к удалению из БАС: EGFP кассеты, оставив генной ловушки мутацию Снята по флуоресценции EGFP. Затем он может быть использован в трансгенных линий, которые обозначают конкретные ткани или события в развитии от флуоресценции GFP. Как и в другихГБЦ, весь ген ловушка кассета в окружении прямых участках LoxP (открытые пятиугольники на рисунке 1). Это делает ген ловушки события обратимы экспрессией Cre рекомбиназы, легко установить доказательство причинности отношений между определенной интеграции ген ловушки и наблюдается фенотип (рис. 2). Наконец, ген ловушка кассета окружении перевернутых Я-SCEI meganuclease сайтов (черные треугольники на рисунке 1). У дрозофилы транспозонов интеграции часто превращается в удалений (недостатков) по неточной иссечения P элемента. Там нет никаких доказательств, что иссечение Tol2 транспозон (или любой другой транспозон активного у позвоночных, таких как Спящая красавица, PiggyBac или AC / DS) может привести к удалений. Поэтому мы включены I-SCEI сайтов как потенциальной суррогатной метод индукции удалений, хотя нет никаких доказательств, что я-SCEI может вызвать удаление у рыбок данио. Следует отметить, что в то время как I-SCEI мегануклеазы могут быть использованы для облегчения трансгенеза у рыбок данио, расщепление ДНК I-SCEI meganuclease используется для изучения механизмов репарации ДНК, в том числе подверженных ошибкам негомологичными конец присоединения, в дрожжах и клетках млекопитающих ^19-22.

Интеграция нашей генной ловушки вектора может привести к выражению EGFP двумя различными механизмами. Первым из них является истинным событием ген ловушка (рис. 1C): вектор интегрируется в геном (IMG для Insertionally мутантный ген), слияние транскриптов между 5 'эндогенного IMG стенограммы и Gal4-VP16 производится и переведены на Слитый белок, содержащий N-конец белка, кодируемого IMG и GAL4-VP16. Это гибридный белок связывается с 14x БАС и активирует транскрипцию EGFP. Второй, менее желательно событие является усилитель ловушка (рис. 1D): минимальный промотор перед EGFP падает под контролем энхансера вблизи сайта интеграции, что приводит к производству EGFP в АВствие Gal4-VP16 производства. По нашим оценкам, 30-50% событий экспрессии EGFP обусловлены усиливающего ловушку и 50-70% обусловлены геном ловушку ²³ (Balciuniene соавт. В стадии подготовки). Чтобы различать эти два класса событий, мы сделали 14xUAS: MRFP трансгенной линии (рис. 1В), для удобства отмечены объектива конкретных γCry: (. Balciuniene др. в стадии подготовки) GFP. Генной ловушки события проверяется коэкспрессией GFP и RFP (ср. С и D на рисунке 2).

В нашем пилотном экран, мы восстановлены более 40 генов ловушки события после проверки 270 F0 рыбу вводят смесью транспозонов ДНК и транспозазы мРНК. Двое из наших генов ловушки интеграции произошли в гены с ранее опубликованными химически индуцированных мутантов: NSF и FLr. Фенотипы нашей инсерционные мутантов NSF ^tpl6 и FLr ^tpl24 внешне неотличимы от фенотипас соответствующих химически индуцированных мутантов. Мы также отметили, что ген ловушки события появляются нужной интронов вблизи 5 'конца генов, тем самым увеличивая вероятность нулевых аллелей. Мы делаем наблюдать некоторую степень UAS глушителей (пестрота) во всех наших ген ловушки линий, и некоторые локусы явно более восприимчивы к пестроте, чем другие. Мы не верим, что БАС молчание является серьезной проблемой для распространения гена ловушки линий, как мы были в состоянии легко распространяются все наши ген ловушки линий по крайней мере пяти поколений, выбрав для выражения GFP в одиночку.

протокол

1. Производство F0 поколения микроинъекцией гена Trap.

Мы обнаружили, что эмбрионы различных генетических фонов отображать различные допуски к этой процедуре, с домашними магазине дикого типа и Тюбинген - Длинные Фин (TLF) является наиболее терпимая а AB и Тюбинген штаммы имеют более низкий уровень выживания.

1. Подготовка транспозонов ДНК. Подготовка GBT-B1 (pDB783, Balciuniene соавт. В стадии подготовки) ДНК плазмиды с использованием стандартного QIAprep минипрепаративного набора (Qiagen 27106). Важно, чтобы включать в себя стадию стирки Pb (который является необязательным в процедуре Qiaprep), в противном случае ДНК минипрепаративную будут загрязнены РНКазы А, что приводит к деградации мРНК транспозазы. Перед инъекцией, разбавить ДНК в РНКазы свободной воды (Ambion AM9937) до 10 нг / мкл.
2. Подготовка транспозазы мРНК. Линеаризуем pT3TS/Tol2 (pDB600) ¹³ с помощью XbaI и транскрибировать линеаризованную ДНК с использованием mMessage машина T3(Ambion AM1348) в пробирке комплекте транскрипции. Мы модифицировали реакцию в пробирке транскрипции, добавив 0,5 мкл ингибитора RiboLock РНКазы (ThermoFisher Fermentas EO0381). После стадии обработки ДНКазой, очистить мРНК с использованием набора RNeasy MinElute (Qiagen 74204). Оценка качества в пробирке транскрибируется мРНК путем электрофореза в агарозном геле. Развести мРНК в РНКазы свободной воды до 40 нг / мкл, и хранить как 2 мкл аликвоты при -80 ° С.
3. Подготовка микроинъекции смеси. Перед инъекцией, добавить 8 мкл разведенной транспозонов ДНК к 2 мкл аликвоты транспозазы мРНК.
4. Микроинъекция. Введите 3 нл ДНК / РНК смеси в желток 1 эмбрионов данио клеток с использованием стандартных методов микроинъекции, направленный для интерфейса желток / бластомеров. Сбор эмбрионов каждые 20 минут, чтобы обеспечить инъекции на 1 этапе клетки. По нашему опыту, искусный человек может легко вводить 1000 эмбрионов в 1-1,5 часа.
5. После инъекции, запустить 5 мкл слеванад инъекционного раствора на 1% агарозном геле для контроля качества, чтобы гарантировать, что транспозаза мРНК не ухудшается.
6. Введенный уход эмбрион. В конце дня, удалить неоплодотворенные и аномальные эмбрионы и распространять эмбрионов до 60-80 на 100 мм чашки Петри. Аномальные и мертвые эмбрионы удаляются на 1 день после оплодотворения (DPF), 2 денье и 3 денье.
7. Скрининг выражения GFP. Эмбрионы экран без явных дефектов для GFP флуоресценции при 3 DPF (рис. 3). Скрининг может быть сделано либо на стереомикроскопа, снабженного флуоресценции (мы используем Nikon SMZ1500) или на прямой микроскоп (мы используем Zeiss AxioImager с целью 5X Fluar). Низкий выражение GFP указывает на неудачную инъекцию или деградации транспозазы РНК из-за загрязнения РНКазы (рис. 3а). Выбрать около 30% наиболее ярких эмбрионов, которые либо имеют выражение GFP во многих тканях или в высоком проценте клеток специфической ткани (сравните Figures 3В и 3С). От инъекции 1000 эмбрионов, мы обычно имеем до 100 умственно-Normal, High-GFP-экспрессирующих эмбрионов.
8. Поднять выбранные эмбрионы F0, используя стандартные процедуры данио воспитания. Разумно ожидать, что 20-30% из введенных эмбрионов, отобранных для выращивания доживет до совершеннолетия.

2. Уход за БАС: MRFP тестер линии.

Мы сформировали 14xUAS: MRFP линия отмечена объектива конкретных γCry: GFP. С БАС подлежит глушителей через метилирование ДНК, важно, чтобы выбрать рыбу с низким уровнем глушителей для распространения акций.

1. Установите отдельный UAS: MRFP гомозигот по спаривания с одним из наших самых надежных Gal4 ген ловушки линий, NSF ^tpl6 (Balciuniene др. в стадии подготовки.).
2. На следующий день, передавать UAS: MRFP рыбы, которые давали эмбрионов отдельных стационарных цистерн, в то время как эмбрионы собраныи очистить.
3. Эмбрионы сетчатые для GFP и RFP флуоресценции на 1 DPF и 3 DPF.
4. Интеркросс рыба, которая дала эмбрионов с высокой экспрессией MRFP установить следующее поколение БАС: MRFP линии.

3. Скрининг F0 рыбы.

1. Крест индивидуальный F0 с гомозиготной БАС: MRFP рыбы (рис. 4). Мы обычно вводят наши ГБЦ в линиях с дикого типа или леопарда пигментации моделей, и наши гомозиготные БАС: MRFP линия находится в латунной фоне. Поэтому ББТ впрыском F0 рыба может быть легко отличить от БАС: MRFP рыбы, что исключает необходимость для записи, был ли F0 проходит проверку мужчина или женщина, а также потенциальные ошибки, возникающие в результате ошибок в записи и / или определяющих пол каждая рыба. Персонал с очень ограниченным опытом, таких нас студентов, поэтому в состоянии установить и сломать рыбы вязки. Этот подход имеет тот недостаток, что два разных генетических фонов являютсяиспользуется, потенциально осложняет интерпретацию потери функциональных фенотипов.
2. На следующий день, вернуться медные UAS: MRFP рыбу их танк. Поместите F0 рыбу, которая дала эмбрионов в отдельных стационарных цистерн (мы используем Hagen Exo Terra Faunarium Маленький, но любой небольшой резервуар может быть использован для этой цели), а эмбрионы были собраны и экранированы.
3. Чистые и передачи собранных эмбрионов в новые чашки Петри (<100 за блюдо) во второй половине дня в день 0.
4. Эмбрионы сетчатые для GFP и RFP флуоресценции на 1 денье, 2 денье и 3 DPF. Потяните эмбрионов положительные как для GFP и RFP вне, сортировать их по GFP / RFP паттерна экспрессии (если более одного картина наблюдается в кладке) и поднять их установить F1 поколения.
5. Усыпить F0 рыбу, которая производится только отрицательные эмбрионов (из общего числа 50-100 эмбрионов).
6. Крест F0 рыбу, которая производится GFP / RFP-положительных потомство снова, чтобы получить вторую партию срабатываний.

4.Скрининг F1 рыбы.

Рыба F1, проверяются установить F2 семьи, к документу генной ловушки паттерн экспрессии и заморозить партии эмбрионов для молекулярной идентификации гена ловушки локусов на 5 'RACE и обратной ПЦР.

1. Крест отдельных рыб F1 с гомозиготной БАС: MRFP рыбы (рис. 4).
2. На следующий день, поместите рыбу F1, который дал эмбрионов в отдельных стационарных цистерн в то время как эмбрионы собирают и просеивают.
3. Эмбрионы сетчатые для GFP и RFP флуоресценции на 1 денье, 2 денье и 3 DPF. Отдельные и сфотографировать эмбрионы положительные как для GFP и RFP ^24.
4. В 5 DPF, заморозить партии 20 GFP / RFP-положительных и 20 GFP / RFP-отрицательных эмбрионов для идентификации insertionally мутировавших генов с помощью обратной ПЦР и 5 'RACE ^9,10. Поднимите оставшиеся GFP / RFP-положительных эмбрионов установить F2 поколения.

Результаты

В успешной инъекции, по крайней мере, 80% эмбрионов вводили в ген ловушки ДНК / Tol2 транспозазы мРНК смеси отображать определенную степень флуоресценции GFP (рис. 3). Когда самые яркие GFP-положительных эмбрионы (рис. 3C) выбраны так, чтобы установить F0 бассейн, примерно один из 10 экранированных F0 рыбы даст генной ловушки потомство. Среди F0 рыбы, из которой ген ловушки события восстанавливаются, наиболее передавать одно событие генной ловушки в дополнение к нескольким, не выражающих транспозонов интеграции. Тем не менее, мы установили до четырех генов ловушки линий от одной F0 личности. GFP / RFP паттерны экспрессии в генной ловушки линий в диапазоне от крайне тканеспецифическую (например, в обонятельных луковиц) до довольно вездесущий.

Рисунок 1. Тон Gal4 содержащих двудольный ген ловушка вектор ББТ-B1 и ее приложения. А. Компоненты Gal4 содержащего ген ловушки вектора: Tol2 5 'и Tol2 3', минимальная Tol2 транспозонов заканчивается ^13; CSA, Карп β-актин сращивания акцептор ^8; ^ Gal4-VP16, АВГ-менее Gal4-VP16; ZP ( A), данио β-актина UTR 3 'и поли (А) элементы из GBT-R15 ^9,10. 14XUAS, EGFP и SV40 р (А) являются компонентами БАС: EGFP выражение кассета ^17,18. Стрелка указывает активацию БАС: EGFP по Gal4-VP16 производится гена ловушку В. 14XUAS:. MRFP трансген отмечен объектива конкретных γCry: GFP кассеты. Стрелка указывает активацию БАС: MRFP по Gal4-VP16 в транс ловушки случае С. гена.. Синие коробки экзоны. Сращивание обозначено пунктирной линией. Ловушка событий D. Enhancer. Интеграция вектора ближайшее усилителя (коричневый коробка) может разместить минимальный EGFP промотор под контролем этого усилителя (коричневая стрелка). Это приведет к ткане-специфической экспрессии EGFP, но так как GAL4-VP16 не производится, выражение MRFP не будет активирован.

Рисунок 2. Реверсия ген ловушки событий, используя Cre рекомбиназу. , B. Схема генной ловушки мутации (А) и Cre-ловушки возвращенной ген аллеля (B). C, D. Совместная экспрессия GFP (С) и RFP (D) в нервной системе NSF гена ^tpl6 ловушка линии. E, F. Инъекция Cre РНК в NSF эмбрионов ^tpl6 приводит к потере GFP (E) и RFP (F) выражения. Следует отметить, что не существует снижение экспрессии GFP в линзе, как и ожидалось.

Рисунок 3. Эмбрионы введенные с ББТ-B1 (pDB783) гена ловушку. . А. Эмбрионы вводили pGBT-B1 (pDB783) в одиночку дисплей немного GFP флуоресценции в тело В, С. Эмбрионы вводили pGBT-B1 и Tol2 транспозазы мРНК: случайная группа эмбрионов (В) и высоких Экспрессоры выбранных для выращивания (C).

Рисунок 4. Экспериментальная схема для создания Gal4 ген ловушки линий. Небольшая перекрывающиеся красный / зеленый структуры указывают коэкспрессией GFP и RFP, в то время как зеленый покое указывает мозаицизма для генной ловушки или усилитель ловушки событий.

Обсуждение

В генной ловушки векторы и методология, описанные здесь, уже используются в нескольких независимых лабораториях. По нашему опыту, есть два важных шагов в этом процессе. Первый важный шаг состоит в достижении высоких темпов интеграции ген ловушки в введенных эмбрионов F0. Невыполнение на этом этапе часто можно отнести к РНКазы загрязнения впрыска реагентов, особенно ДНК минипрепаративную. Кроме того, очень важно, чтобы придать эмбрионов на стадии 1 клеток для генной ловушки экспериментов. По нашему опыту, Tol2-опосредованной трансгенез очень эффективно, что делает возможным получение трансгенных линий даже при введении позднее стадии 1 клеток или с более низким качеством ДНК. Нестандартные инъекции намного более проблематичным при проведении генной ловушки мутагенеза, так как только небольшая часть векторных интеграции привести к эффективной событий генной ловушки. Второй критический этап заключается в выяснении генной ловушки событий путем скрещивания в наш БАС: MRFP линии. Отсутствие выражения MRFP являетсяпочти всегда свидетельствует о событии усилитель ловушки. Однако, иногда отсутствие экспрессии MRFP может указывать молчание на 14x БАС. Поэтому важно поддерживать UAS: MRFP линии в не замолчать государства путем распространения нового поколения с использованием лиц с выражением высокого RFP, когда подошел к NSF ^tpl6.

Мы можем предвидеть делая несколько улучшений для наших генов ловушки векторов и протокол. Первый состоит в использовании менее повторяющиеся UAS в генной ловушки конструкции. Было показано, что 5x UAS является достаточным для достижения полной активации в экспериментах культуре клеток, и что менее повторяющиеся последовательности UAS менее восприимчивы к метилирования и глушителей ^6,25. Он также может быть возможно конструировать векторы генной ловушки для полностью условного мутагенеза, по аналогии с векторами, используемых в международной мыши ген ловушки консорциума и недавно приспособленных для данио ^2,26,27. Еще одним усовершенствованием будет использовать другую тransposon система, например Спящая красавица ^28, для создания UAS: MRFP репортер линии. Это позволило бы инъекцию генов ловушек Tol2 основе непосредственно в репортера линии и скрининга F0s по incrossing. Кроме того, это было бы отказаться от использования двух различных генетических предпосылок, что делает толкование потери функциональных фенотипов более простым. Даже с этими улучшения, общая Gal4 ген ловушка Протокол, представленные здесь все равно будет в полной мере применимы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miniprep Kit	Qiagen	27104	Optional PB wash step is a must
XbaI restriction enzyme	ThermoFisher	ER0681
mMessage Machine T3	Ambion	AM1348
RiboLock RNase Inhibitor	ThermoFisher	EO0381
RNeasy MinElute	Qiagen	74204	Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl!
Nuclease-free water	Ambion	AM9937	Has to be non-DEPC treated
Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles	World Precision Instruments	1B100F-4
Microcapiliaries for calibration	Drummond Scientific	1-000-0010
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003
Needle puller *	Sutter Instruments	P-87
Stereomicroscope for microinjection *	Nikon	SMZ1500	We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand
Picoinjector *	Harvard Instruments	Pli-90	We also use Pli-100
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *	Zeiss	Zeiss AxioImager	5X Fluar objective has sufficient working distance
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *	Nikon	SMZ1500
* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.