El uso de quimiostatos en Microbiana Biología de Sistemas

Resumen

Tasa de crecimiento celular es un proceso regulado y un determinante principal de la fisiología celular. Cultivo continuo usando quimiostatos permite el control extrínseca de la tasa de crecimiento de las células por la limitación de nutrientes facilitar el estudio de las redes moleculares que controlan el crecimiento celular y cómo estas redes evolucionan para optimizar el crecimiento celular.

Resumen

Las células regulan su tasa de crecimiento en respuesta a señales desde el mundo exterior. A medida que la célula crece, diversos procesos celulares deben estar coordinados incluyendo la síntesis macromolecular, metabolismo y en última instancia, el compromiso con el ciclo de división celular. El quimiostato, un método de controlar experimentalmente tasa de crecimiento celular, proporciona un medio poderoso para estudiar sistemáticamente cómo afecta la tasa de crecimiento de los procesos celulares - incluyendo la expresión génica y el metabolismo - y las redes reguladoras que controlan la tasa de crecimiento de las células. Cuando mantenido por cientos de generaciones quimiostatos se puede utilizar para estudiar la evolución de adaptación de microbios en las condiciones ambientales que limitan el crecimiento celular. Se describe el principio de las culturas chemostat, demostrar su funcionamiento y ofrecer ejemplos de sus diversas aplicaciones. Tras un período de inactividad después de su introducción en el medio del siglo XX, la convergencia de las metodologías a escala del genoma con un renovado enterés en la regulación del crecimiento celular y la base molecular de la evolución adaptativa es estimular un renacimiento en el uso de quimiostatos en la investigación biológica.

Introducción

El crecimiento de las células está regulada por complejas redes de interacción de factores genéticos y ambientales ^1,2. La regulación multifactorial del crecimiento celular requiere un enfoque a nivel de sistema para su estudio. Sin embargo, el estudio riguroso de crecimiento celular regulada se ve desafiada por la dificultad de controlar experimentalmente la velocidad a la que crecen las células. Por otra parte, incluso en los experimentos simples condiciones extracelulares son con frecuencia dinámico y complejo como células alteran continuamente su entorno ya que proliferan. Una solución a estos problemas es proporcionada por el quimiostato: un método de cultivo de células que permite el control experimental de las tasas de crecimiento de células en entornos definidos, invariantes y controlados.

El método de cultivo continuo utilizando un quimiostato fue descrita independientemente por Monod ³ y Novick y Szilard ⁴ en 1950. Tal como se concibió originalmente, las células se cultivan en un volumen fijo de los medios de comunicación que es CONcontinuamente se diluye mediante la adición de los nuevos medios y la eliminación simultánea de los viejos medios de comunicación y las células (Figura 1). Acoplados ecuaciones diferenciales ordinarias (Figura 2) describen la tasa de cambio en la densidad de células (x) y la concentración de un nutriente (s) que limita el crecimiento en el recipiente de quimiostato. Es importante destacar que este sistema de ecuaciones predice un único (distinto de cero) estable en estado estacionario (Figura 3) con la notable implicación de que en el estado estacionario, la tasa de crecimiento específico de las células (es decir, la constante de velocidad de crecimiento exponencial) es igual a la tasa en el que el cultivo se diluye (D). Mediante la variación de la tasa de dilución es posible establecer poblaciones en estado estacionario de las células a diferentes tasas de crecimiento y en diferentes condiciones de limitación de nutrientes.

El control experimental de la tasa de crecimiento utilizando quimiostatos fue fundamental para el desarrollo de una comprensión de cómo los cambios de la fisiología celularcon tasas de crecimiento de ^5,6. Sin embargo, este antiguo pilar de métodos microbiológicos hizo cada vez más oscura durante la explosión en la investigación de la biología molecular a finales del siglo XX. Hoy en día, el renovado interés en el control de crecimiento en ambos microbios y organismos multicelulares y el advenimiento de los métodos a escala del genoma de análisis a nivel de sistemas, ha renovado la motivación para el uso de quimiostatos. A continuación, describimos tres aplicaciones que aprovechan el control preciso de las tasas de crecimiento de células y el medio externo que son únicamente posibles con quimiostatos. En primer lugar, se describe el uso de quimiostatos para investigar cómo la abundancia de miles de biomoléculas - tales como transcripciones y metabolitos - están regulados coordinadamente con la tasa de crecimiento. En segundo lugar, se describe la forma quimiostatos pueden utilizarse para obtener estimaciones precisas de las diferencias de tasas de crecimiento entre los diferentes genotipos en ambientes con nutrientes limitados utilizando experimentos de competición. En tercer lugar, se describe cómo se puede quimiostatosser utilizado para estudiar la evolución adaptativa de las células que crecen en entornos pobres en nutrientes constantes. Estos ejemplos ilustran la forma en que quimiostatos están permitiendo a las investigaciones a nivel de los sistemas de regulación del crecimiento celular, génica mediante interacciones ambientales y la evolución adaptativa.

Protocolo

El principio de cultivo continuo utilizando un quimiostato se puede realizar en una variedad de implementaciones. En todos quimiostatos que es esencial contar con 1) los métodos para mantener la esterilidad de todos los componentes, 2) una cultura bien mezclado, 3) la aireación adecuada del recipiente de cultivo y 4) un medio fiable de adición de los medios y la cultura de eliminación. Aquí, se describe el uso de un biorreactor Sixfors (Infors Inc) como un quimiostato usando métodos que se pueden adaptar fácilmente a configuraciones alternativas.

1. Montaje de los buques Chemostat

1. Encienda los Sixfors utilizando el interruptor principal.
2. Enjuague bien el recipiente quimiostato, montaje agitador y tubo conectado con agua desionizada (DI). Compruebe todos los tubos y las juntas tóricas y reemplace cualquier pieza desgastada buscando.
3. Asegúrese de que la base de soporte del eje de accionamiento está mirando hacia arriba en el recipiente de vidrio y que la parte superior del eje de accionamiento se encaja a presión en su alojamiento en el montaje de agitador. Ajuste el stirreconjunto de r en el recipiente de vidrio asegurar la parte inferior del árbol de accionamiento se asienta en el soporte del eje de accionamiento. Utilice la abrazadera para asegurar el conjunto agitador al recipiente de cristal.
4. Llenar el depósito con alrededor de 300 ml de agua DI.
5. Retire las tapas de un oxígeno disuelto (OD ₂₎ sonda y controlar el nivel del electrolito desenroscando la carcasa inferior y asegurándose de que la carcasa inferior se llena hasta la mitad con la solución electrolítica. Atornillar la carcasa inferior y se insertan en el puerto en el buque quimiostato. Atornille hasta que quede apretado dedo.
6. Tome una sonda de pH y de sacarlo de su tampón de almacenamiento (3 M KCl). Retire la tapa de la sonda de pH y adjuntar a fermentador 1. El uso de la pantalla de control Sixfors, navegue hasta el menú de parámetros fermentador y seleccione "Calibrar pH". Coloque la sonda de pH en un tampón estándar de pH 7 y registrar la lectura como Sumo Read. Repita con el tampón de pH 4 y registrar la lectura tan bajo Leer. Desconecte la sonda de pH del fermentador, lavar con agua DI e inserte la sonda into el puerto en el buque quimiostato. Atornille hasta que quede apretado dedo.
7. Colocar el recipiente quimiostato en el bastidor. Nota sobre el buque que fermentador (1-6) la sonda de pH fue conectado y calibrado. Coloque la tapa de la sonda de pH en la sonda de pH. El uso de papel de aluminio herméticamente cubre la parte superior del sensor de oxígeno _2.
8. Doble lámina sobre los extremos de la tubería conectada al recipiente de quimiostato.
9. Repita los pasos 1.2 a 1.8 para todos los buques.
10. Esterilizar los recipientes en autoclave durante 15 min en un ciclo de líquido.

2. Preparación de los Medios de Comunicación

1. Establecer el rango límite de las concentraciones de nutrientes por el crecimiento de cultivos de lotes en diferentes concentraciones de nutrientes. El nutriente es limitante en el rango donde la densidad celular final es una función lineal de la concentración inicial de nutrientes (Figura 4). Seleccionar una concentración de nutrientes dentro del rango limitante. Ejemplos de composición de medios estándar para los estudios con Saccharomycess cerevisiae están disponibles en ^7-11.
2. Autoclave una bombona vacía que se tapó con un tapón de goma que contiene una entrada de aire y la salida de los medios de comunicación después de asegurarse primero de que el extremo del tubo de los medios de comunicación está cubierta en papel de aluminio.
3. En un recipiente separado preparar 10 l de medio.
4. Coloque una taza de filtro 500 ml de una botella 100 ml de medio. Quite el filtro de algodón con pinzas esterilizadas en etanol y adjuntar inmediatamente al puerto de filtración en la bombona de medios.
5. Coloque la bombona medios a una fuente de vacío y filtro de esterilización de los medios de comunicación mediante la adición a la copa del filtro.
6. Cuando la filtración de los medios de comunicación se ha completado, cierre la terminal portuaria de filtración con una abrazadera de metal.

3. Calibración de haces ₂ Sondas y configuración quimiostato

1. Después de los vasos chemostat se han sometido a autoclave y se dejó enfriar lugar el buque en su chaqueta de calor correspondiente. Conecte la sonda de temperatura, sonda de pH y DO ₂ de la sonda. Deje que elbuque se sientan con el poder durante al menos 6 horas para permitir que la DO ₂ sondas para polarizar.
2. Coloque el extremo de cada tubo de efluente en un recipiente de recolección separada. Conecte el suministro de aire a través de un filtro esterilizado en autoclave y encienda el flujo de aire. El agua en cada recipiente debe fluir fuera de los tubos de efluentes, lo que indica que todas las juntas se forman correctamente.
3. Ajuste la altura del tubo de efluente de acuerdo con el volumen de trabajo deseada (por ejemplo 300 ml). Nosotros usamos una regla que está marcado con la colocación de tubos calibrados para diferentes volúmenes de trabajo.
4. Conecte la bombona media de la embarcación quimiostato. Utilice el etanol con el fin de mantener el tubo termina tan estéril como sea posible. Pase el tubo de la bomba a través de la bomba y la pinza abierta. Presione manualmente la bomba hasta que los medios de comunicación comienza a fluir dentro del recipiente de quimiostato. Soltar la tubería de la bomba, los medios de comunicación deben fluir libremente en el recipiente quimiostato. Cuando los medios de comunicación llega al tubo de efluente, vuelva a conectar la tubería a la bomba y la abrazadera.
5. Comience running el programa básico con el conjunto impulsor de 400 rpm y la temperatura ajustada a 30 ° C.
6. Para calibrar hacer ₂ sondas, corte el suministro de aire y cambiar a gas nitrógeno. Espere al menos una hora y registro de valor medida como "bajo de lectura". Cambie de nuevo al suministro de aire (es decir, que contiene la concentración de oxígeno del ambiente), espere por lo menos una hora adicional y medición expediente como "de lectura es alto".
7. Iniciar el registro de datos utilizando el software Iris.

4. Inoculación

1. Utilice etanol al 70% para esterilizar la parte superior del recipiente de cultivo.
2. Retire el tornillo en la parte superior del vaso y de la pipeta 1 ml de un cultivo de una noche en el vaso quimiostato. Vuelva a apretar el tornillo.
3. Indique el momento de la inoculación en Iris.
4. Espere aproximadamente 24 horas para que las culturas alcanzan la fase estacionaria temprana. A medida que la cultura crece, el oxígeno disuelto y pH disminuirá. En el caso de los medios de comunicación limitantes de glucosa, oxígeno disuelto volverá a ~ 100% en PHA estacionariaSE. Para otras limitaciones de nutrientes de oxígeno disuelto se mantendrá <100% en la fase estacionaria.

5. Iniciando Bombas y alcance del estado continuo

1. La velocidad de dilución se calcula dividiendo la velocidad de flujo (la cantidad de medios de comunicación fluye en el recipiente por hora) por el volumen de cultivo. Por ejemplo, con un volumen de 300 ml de una tasa de dilución de 0,1 significa que se añaden 30 ml de medio de cultivo cada hora. Debido a que el sistema está bajo presión positiva el mismo volumen se retira del recipiente asegurando que el cultivo se diluye continuamente. Una gama de tasas de dilución (D) se puede utilizar que no excedan la tasa máxima de crecimiento (μ _max) de las células, por encima del cual las células se lavan fuera de la quimiostato.
2. Elija la configuración de la bomba, que especifican el número de segundos que la bomba esté encendido y apagado, para establecer el caudal deseado. La bomba suministra los medios de comunicación a una velocidad de ~ 0,11 ml / seg.
3. Definir un programa utilizando la int Sixforserface que especifica la sincronización de la bomba, la temperatura y la velocidad del impulsor. Inicie el programa.
4. Vacíe los recipientes de recolección de líquidos y registrar el tiempo.
5. Después de por lo menos dos horas, utilice un cilindro graduado para medir la cantidad de medios de comunicación ha sido retirado de la embarcación. Esta será igual el volumen que ha sido añadido al recipiente de quimiostato. Calcular la tasa de dilución (D = V _efluentes / V _cultura / tiempo). Ajuste la configuración de la bomba si la tasa de dilución calculada no coincide con la tasa de dilución deseado.
6. En el estado estacionario, la densidad celular en el quimiostato no cambia con el tiempo. Esto se puede medir sin perturbar la cultura mediante el muestreo de la salida. Nos operacionalmente definimos consecución de estado estacionario como mediciones de la densidad de células idénticas que están separadas por al menos una duplicación de la población. Alcanzar el estado de equilibrio tendrá una duración aproximada de ocho generaciones de cultivo después de la iniciación de la dilución de la cultura. En el estado estacionario, las células crecen de manera exponencial (es decire. tasa de crecimiento constante en el tiempo) en condiciones de nutrientes limitados. El tiempo de duplicación de la población (tiempo de generación) es ln (2) / D.
7. Continuar para medir periódicamente los volúmenes de efluentes durante la duración del experimento para asegurar que se mantiene una tasa de dilución constante.

6. Aplicación 1: El estudio de las células que crecen a ritmos diferentes en condiciones de estado estacionario

1. En el estado estacionario en el quimiostato, la tasa de crecimiento de la población de células es igual a la tasa de dilución. Al alterar sistemáticamente la tasa de dilución que es posible cultivar células a diferentes velocidades. Esto permite que el estudio sistemático de los parámetros fisiológicos que varían con la tasa de crecimiento como el volumen celular, la fase del ciclo celular y la resistencia al estrés. Además, los perfiles en estado estacionario de ARNm global, la proteína y los niveles de metabolitos se pueden ensayar en células que crecen a tasas diferentes. Hay dos maneras de adquirir muestras:
2. Muestras pequeñas pueden ser pasivamente obcontenida colocando el extremo del tubo de efluente en un tubo de 1,5 ml o 15 ml. Una muestra de 1-5 ml se puede conseguir en unos pocos minutos (dependiendo de la tasa de flujo). Muchos de los parámetros fisiológicos pueden ser medidos de estas muestras.
3. La expresión de genes, o metabolitos análisis requieren muestras más grandes que se deben obtener lo más rápidamente posible. Coloque el extremo del tubo de efluente en un tubo cónico de 15 ml. Suelte el tornillo que sujeta el extremo metálico del tubo de efluentes y empuje suavemente hacia abajo. A ~ 10 ml de muestra será rápidamente llenar el tubo. Tenga en cuenta que el volumen en el recipiente quimiostato ha cambiado. Si se toman muchas muestras consecutivas puede ser necesario para reducir el flujo para mantener una tasa de dilución constante.

7. Aplicación 2: Medición precisa de diferencias en desarrollo las tasas entre los genotipos en ambientes controlados utilizando los ensayos de la competencia basada en Citometría de Flujo

1. Quimiostatos se pueden utilizar para cuantificar con precisión el efecto de la concentración de nutrientessobre las diferencias en las tasas de crecimiento (es decir, la aptitud) entre los distintos fondos genéticos. Por cepas co-cultivo de la etiqueta con diferentes proteínas fluorescentes se determina la tasa de cambio en la abundancia relativa durante el crecimiento exponencial. La ejecución de este ensayo a diferentes tasas de dilución (D) permite el estudio de los efectos de la concentración de nutrientes (s) sobre las diferencias de condición física.
2. Establecer cultivos de estado estacionario de las dos cepas en los vasos chemostat separadas con tasas de dilución idénticas y un volumen de 300 ml.
3. Pasivamente muestra de 1 ml de cada buque. Decantar células, volver a suspender en tampón fosfato salino (PBS) y se pone a 4 ° C. Estas muestras contienen muestras de células homogéneas, que son controles para el análisis de citometría de flujo subsiguiente.
4. Colocar el tubo de efluente de un recipiente en un cilindro graduado en autoclave. Suelte el tornillo que sujeta el extremo metálico del tubo de efluentes y empuje suavemente hacia abajo para expulsar a las células del quimiostato. ¿Cuándoel volumen llega a 150 ml, de regreso el extremo metálico del tubo de efluente a su posición original (300 ml). Repita con el segundo recipiente, usando un cilindro graduado diferente.
5. Utilice etanol al 70% para mantener la esterilidad mientras se quita el tornillo en la parte superior del recipiente quimiostato. Coloque el embudo en la abertura y verter 150 ml de la otra cultura en el vaso quimiostato. Vuelva a apretar el tornillo. Repita con el segundo recipiente, usando el segundo embudo. Cada buque quimiostato ahora contiene una mezcla de las dos cepas.
6. Obtener una muestra de 1 ml de cada buque que utilice muestreo pasivo cada 2-6 horas. Centrifugar las células, resuspender en PBS y se almacena a 4 ° C. Siga tomando muestras para el registro de 2-3 días cuidadosamente el tiempo de cada muestra fue tomada.
7. Al final del experimento, se somete a ultrasonidos y diluir las muestras a ~ 2 x 10 ⁶ células / ml. Usando citometría de flujo, medir la proporción de las dos cepas en cada muestra. Como ambas cepas están creciendo de manera exponencial, la diferencia de la tasa de crecimiento relativo esdeterminado por regresión lineal de ln (strain1/strain2) frente al tiempo (medido en generaciones). La pendiente de la regresión es la diferencia proporcional en la tasa de crecimiento (es decir, la ventaja de la aptitud) de una cepa con respecto al otro.
8. A medida que el cultivo mixto puede tomar algún tiempo para alcanzar un nuevo estado de equilibrio, los momentos oportunos pueden adaptarse mal a la regresión. Este problema se resuelve mejor permitiendo 2-3 generaciones que transcurran antes de comenzar el muestreo o eliminar puntos tempranos que son los valores extremos claros. Por el contrario, una vez que una cepa ha outcompeted la otra los datos ya no son útiles y estos puntos deben ser excluidos.

8. Aplicación 3: Evolución Experimental

1. Evolución Experimental realizado en quimiostatos selecciona para los mutantes que se incrementan en la aptitud en el entorno limitado de nutrientes. La selección se realiza generalmente a través de cientos de generaciones.
2. Establecer una cultura quimiostato en estado estacionario utilizando una cepagenotipo conocido (y secuencia del genoma de preferencia se conocen) y un nutriente limitación definida.
3. Para mantener un "registro fósil" de la población que se adapta pasivamente muestrear quimiostato cada 2-3 días y almacenar la muestra en 15% de glicerol a -80 ° C.
4. Supervisar el depósito de medio y reponer con medio fresco como sea necesario.
5. Mantener la cultura de crecimiento exponencial para varios cientos de generaciones.
6. Después de la terminación de la placa de selección de una muestra de células en placas de agar sólido. Después las células se han convertido en colonias, recoger una muestra no sesgada de las colonias utilizando palillos de dientes e inocular clones en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos que contiene 100 l de los medios de comunicación. Permita que las muestras clonales crezcan durante la noche, añadir 100 ml de glicerol al 30% y guárdelo en -80 ° C.
7. Caracterizar los clones mediante secuenciación de todo el genoma y la realización de ensayos fenotípicos, incluyendo la evaluación de la aptitud, utilizando una cepa de referencia marcado con fluorescencia común, tal como se describe en la Solicitud de 2.

Resultados

Una ventaja importante de quimiostatos es la capacidad de controlar la tasa de crecimiento de las células experimentalmente mediante la variación de la tasa de dilución. En la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae, la morfología de una célula es informativo de su fase en el ciclo de división celular. Las poblaciones con tasas de crecimiento más altas contienen una mayor proporción de división activa las células según se determina mediante la medición de la fracción de células unbudded (Fig...

Discusión

Quimiostatos permiten el cultivo de microbios en condiciones de estado estacionario de crecimiento controlado. Las células crecen continuamente a una velocidad constante que resulta en un ambiente externo invariante. Esto es en contraste con los métodos de cultivo por lotes en el que el entorno externo está cambiando continuamente y la tasa de crecimiento de las células se determina por la interacción compleja de medio ambiente y genotipo. Por lo tanto, una ventaja importante de cultivo de microbios en quimiostatos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infors-HT Sixfors Chemostat	Appropriate Technical Resources, Inc.
Glass Bottle 9.5 L	Fisher Scientific	02-887-1	For Media Vessel and Hosing
Pinchcock	Fisher Scientific	05-867	For Media Vessel and Hosing
Stopper, Size 12, Green Neoprene	Cole-Palmer	EW-62991-42	For Media Vessel and Hosing
Straight Connector	Cole-Palmer	EW-30703-02	For Media Vessel and Hosing
General purpose ties 4 in	Fisher Scientific	NC9557052	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone Rubber	Small Parts	B000FMWTDE	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 3/8 in OD	Fisher Scientific	02-587-1Q	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 7/32 in OD	Fisher Scientific	02-587-1E	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD	McMaster-Carr	6100K164	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD	McMaster-Carr	6100K161	For Media Vessel and Hosing
Hook Connectors	Fisher Scientific	14-66-18Q	For Media Vessel and Hosing
Ratchet Clamp	Cole-Palmer	EW-06403-11	For Media Vessel and Hosing
Luer, Female	Cole-Palmer	EW-45512-34	For Media Vessel and Hosing
Luer, Male	Cole-Palmer	EW-45513-04	For Media Vessel and Hosing
Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm	Fisher Scientific	MTGR05010	For Media Vessel and Hosing
PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm	Fisher Scientific	NC9131037	For Media Vessel and Hosing
Direct-Reading Flowtube for Air	Cole-Palmer	EW-32047-77	For Nitrogen Gas Setup
Direct-Reading Flowtube for Nitrogen	Cole-Palmer	EW-32048-63	For Nitrogen Gas Setup
Gas Proportioner Multitube Frames	Cole-Palmer	EW-03218-50	For Nitrogen Gas Setup
Regulator, Two-Stage Analytical	Airgas	Y12-N145D580	For Nitrogen Gas Setup
Hose Adaptor, Stainless Steel	Airgas	Y99-26450	For Nitrogen Gas Setup
Hose Male Adaptor	Airgas	WES544	For Nitrogen Gas Setup
Norprene Tubing	US Plastics	57280	For Nitrogen Gas Setup
Tripod Base	Cole-Palmer	EW-03218-58	For Nitrogen Gas Setup
Valve Cartridges	Cole-Palmer	EW-03217-92	For Nitrogen Gas Setup
Carboy 10 L	Fisher Scientific	02-963-2A	For Media Preperation
Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size	Fisher Scientific	SCGP-T10-RE	For Media Preperation
Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size	Fisher Scientific	FB-800-100	For Media Preperation
calcium chloride·2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Media Reagents
sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	Media Reagents
magnesium sulfate·7H2O	Sigma Aldrich	230391	Media Reagents
potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	AC424205000	Media Reagents
ammonium sulfate	Fisher Scientific	AC423400010	Media Reagents
potassium chloride	Sigma Aldrich	P9541	Media Reagents
boric acid	Sigma Aldrich	B6768	Media Reagents
copper sulfate·5H2O	Sigma Aldrich	209198	Media Reagents
potassium iodide	Sigma Aldrich	60400	Media Reagents
ferric chloride·6H2O	Fisher Scientific	I88-100	Media Reagents
manganese sulfate·H2O	Sigma Aldrich	230391	Media Reagents
sodium molybdate·2H2O	Sigma Aldrich	M7634	Media Reagents
zinc sulfate·7H2O	Fisher Scientific	Z68-500	Media Reagents
biotin	Fisher Scientific	BP232-1	Media Reagents
calcium pantothenate	Fisher Scientific	AC24330-1000	Media Reagents
folic acid	Sigma Aldrich	F7876	Media Reagents
inositol (aka myo-inositol)	Fisher Scientific	AC12226-1000	Media Reagents
niacin (aka nicotinic acid)	Sigma Aldrich	N4126	Media Reagents
p-aminobenzoic acid	Fisher Scientific	AC14621-2500	Media Reagents
pyridoxine HCl	Sigma Aldrich	P9755	Media Reagents
riboflavin	Sigma Aldrich	R4500-25G	Media Reagents
thiamine HCl	Fisher Scientific	BP892-100	Media Reagents
Leucine	Sigma Aldrich	L8000-100G	Media Reagents
Uracil	Sigma Aldrich	U0750	Media Reagents
Dextrose	Fisher Scientific	DF0155-08-5	Media Reagents