O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas

Resumo

Taxa de crescimento celular é um processo regulado e um dos principais determinantes da fisiologia celular. Cultura contínua usando quimiostatos permite o controle extrínseco da taxa de crescimento celular por limitação de nutrientes facilitar o estudo de redes moleculares que controlam o crescimento celular e como essas redes de evoluir para otimizar o crescimento celular.

Resumo

Células regular sua taxa de crescimento em resposta a sinais do mundo externo. À medida que a célula cresça, diversos processos celulares deve ser coordenado, incluindo a síntese de macromoléculas, o metabolismo e, em última instância, o compromisso com o ciclo de divisão celular. O quimiostato, um método de controlar a taxa de crescimento experimental de células, proporciona um meio poderoso de estudar sistematicamente como os impactos a taxa de crescimento de processos celulares, incluindo a expressão de genes - e metabolismo - e as redes reguladoras que controlam a taxa de crescimento celular. Quando mantido por centenas de gerações quimióstatos podem ser usadas para estudar a evolução adaptativa de micróbios em condições ambientais que limitam o crescimento das células. Descreve-se o princípio de cultivos contínuos, demonstrar seu funcionamento e dar exemplos de suas diversas aplicações. Após um período de desuso após a sua introdução em meados do século XX, a convergência das metodologias genoma escala com uma renovada emteresse na regulação do crescimento celular e as bases moleculares da evolução adaptativa está estimulando um renascimento no uso de quimiostatos na pesquisa biológica.

Introdução

O crescimento das células é regulada por redes complexas de interagir factores genéticos e ambientais ^1,2. O regulamento multifatorial do crescimento celular exige uma abordagem em nível de sistema para seu estudo. No entanto, o estudo rigoroso do crescimento celular regulamentada é desafiado pela dificuldade de controlar experimentalmente a velocidade com que as células crescem. Além disso, até mesmo nas experiências mais simples condições extracelulares são freqüentemente dinâmico e complexo como as células alteram continuamente o seu ambiente à medida que proliferam. Uma solução para estes problemas é fornecido pelo quimiostato: um método de cultura de células que permite o controlo das taxas de crescimento experimental de células em ambientes definidos, invariante e controladas.

O método de cultura contínua usando um quimiostato foi descrito de forma independente por Monod ³ e Novick & Szilard ⁴ em 1950. Como originalmente concebida, as células são cultivadas em um volume fixo de mídia que é connuamente diluída pela adição de novas mídias e remoção simultânea de mídias antigas e células (Figura 1). Acoplado equações diferenciais ordinárias (Figura 2) descrevem a taxa de variação da densidade de células (x) e a concentração de um nutriente limitante do crescimento (s) no recipiente de quimiostato. Importante, este sistema de equações prevê uma única (não-zero) estável no estado estacionário (Figura 3), com a implicação notável que, no estado estacionário, a taxa de crescimento específico das células (ou seja, a constante da taxa de crescimento exponencial) é igual à taxa em que a cultura é diluída (D). Através da variação da taxa de diluição é possível estabelecer populações de estado estacionário de células em diferentes taxas de crescimento e sob diferentes condições de limitação de nutrientes.

O controle experimental da taxa de crescimento usando quimiostatos foi fundamental para o desenvolvimento de uma compreensão de como as mudanças fisiologia celularcom taxas de crescimento ^{de 5,6.} No entanto, este antigo pilar de métodos microbiológicos tornou-se cada vez mais obscuro durante a explosão na investigação em biologia molecular, durante o final do século XX. Hoje, renovou o interesse no controlo do crescimento de ambos os micróbios e organismos multicelulares e o advento de métodos genoma escala para análise de sistemas de nível renovou motivação para a utilização de quimióstatos. Aqui, descrevemos três aplicações que capitalizar sobre o controle preciso das taxas de crescimento das células e para o ambiente externo que são exclusivamente possível usando quimiostatos. Em primeiro lugar, descreve-se o uso de quimióstatos para investigar a forma como a abundância de milhares de biomoléculas - como transcritos e metabolitos - são coordenadamente regulada com a taxa de crescimento. Em segundo lugar, nós descrevemos como quimiostatos pode ser usada para obter estimativas precisas das diferenças de taxas de crescimento entre os diferentes genótipos em ambientes com limitação de nutrientes, utilizando experimentos de competição. Em terceiro lugar, nós descrevemos como quimiostatos podeser usado para estudar evolução adaptativa de células que crescem em ambientes pobres em nutrientes constantes. Estes exemplos exemplificar as formas em que quimiostatos estão permitindo investigações em sistemas de nível de regulação do crescimento celular, gênica por interações ambientais e evolução adaptativa.

Protocolo

O princípio da cultura contínua usando um quimiostato pode ser realizado em uma variedade de implementações. Em todos os quimióstatos é essencial ter um) métodos para manter a esterilidade de todos os componentes, 2) uma cultura bem misturada, 3) arejamento adequado do vaso de cultura e 4) um meio confiável de adição e remoção de meios de cultura. Aqui, descrevemos a utilização de um bioreactor de Sixfors (Infors Inc) como um quimiostato utilizando métodos que podem ser prontamente adaptados para configurações alternativas.

1. Montagem das embarcações chemostat

1. Ligue os Sixfors usando o interruptor principal.
2. Lave bem o recipiente chemostat, montagem agitador, e tubos ligados com deionizada (DI) de água. Confira toda a tubulação e o-rings e substituir quaisquer peças desgastadas procurando.
3. Certifique-se a base de apoio veio de accionamento está virada para cima no recipiente de vidro e que a parte superior do veio de accionamento é encaixado no seu alojamento no conjunto agitador. Defina o stirremontagem r-se no reactor de vidro assegurando a parte inferior do veio de accionamento está encaixado no suporte de eixo rígido. Use o grampo para fixar o conjunto do agitador para o recipiente de vidro.
4. Encher o vaso com cerca de 300 ml de água DI.
5. Retire as tampas de um oxigênio dissolvido (OD ₂₎ sonda e verificar o nível do eletrólito, desapertando a carcaça inferior e certificando-se de que a caixa do fundo está cheio até a metade com solução eletrolítica. Rescrew o revestimento inferior e inserir na porta do navio chemostat. Aperte até dedo apertado.
6. Dê uma sonda de pH e removê-lo de seu buffer de armazenamento (3 M KCl). Retire a tampa da sonda de pH e anexar ao fermentador 1. Usando a tela de controle Sixfors, navegue até o menu de parâmetros de fermentação e selecione "calibrar pH". Coloque a sonda de pH em um buffer padrão pH 7 e registre a leitura como alta Read. Repita com tampão pH 4 e registre a leitura como Low Read. Retire a sonda de pH do fermentador, lavar com água DI e introduzir a sonda into porto no navio chemostat. Aperte até dedo apertado.
7. Colocar o recipiente chemostat no rack. Nota sobre a embarcação que fermentador (1-6) a sonda de pH foi conectada e calibrado. Coloque a tampa da sonda de pH na sonda de pH. Usando folha de cobrir bem a parte superior da sonda DO _2.
8. Dobrar a folha ao longo das extremidades do tubo ligado ao recipiente de quimiostato.
9. Repita os passos de 1,2-1,8 para todas as embarcações.
10. Esterilizar por autoclavagem dos vasos lhes durante 15 minutos num ciclo de líquidos.

2. Preparação da mídia

1. Estabelecer a faixa-limite de concentração de um nutriente por uma crescente cultura de lotes em diferentes concentrações de nutrientes. O nutriente é limitante na gama em que a densidade celular final é uma função linear da concentração de nutrientes inicial (Figura 4). Selecione uma concentração de nutrientes bem dentro da faixa de limitação. Exemplos de composição de mídia padrão para estudos com Saccharomyces cerevisiae estão disponíveis em ^7-11.
2. Autoclave um garrafão vazio que é tapado com uma rolha de borracha que contém uma entrada de ar e meios de saída após a primeira assegurando que a extremidade do tubo de media está coberta em folha.
3. Em um recipiente separado preparar 10 L de meios de comunicação.
4. Coloque uma xícara de 500 ml de filtro para um frasco de 100 ml de mídia. Retire o filtro de algodão com uma pinça esterilizados em etanol e anexar imediatamente à porta filtração no garrafão mídia.
5. Prenda o garrafão de mídia a uma fonte de vácuo e filtro de esterilizar mídia, adicionando-o ao copo do filtro.
6. Quando filtração dos meios de comunicação é completa, fechar a porta de filtração com uma braçadeira de metal.

3. Calibrar fazer ₂ Sondas e Configurando chemostat

1. Depois de os vasos em quimiostato foram autoclavados e deixou-se arrefecer o lugar do navio no seu revestimento de calor correspondente. Ligue o sensor de temperatura, sonda de pH, e fazer ₂ sonda. Deixe onavio sentar-se com o poder por pelo menos 6 horas para permitir que os fazer ₂ sondas de polarizar.
2. Coloque a extremidade de cada tubo de efluentes em um receptáculo de coleta separado. Conecte o suprimento de ar através de um filtro autoclavado e ativar o fluxo de ar. A água em cada navio deverá sair dos tubos de efluentes, o que indica que todos os selos são devidamente formado.
3. Ajustar a altura do tubo efluente de acordo com o volume de trabalho desejado (por exemplo, 300 ml). Usamos uma régua que está marcado com a colocação de tubos calibrados para diferentes volumes de trabalho.
4. Conecte o garrafão de mídia para o navio chemostat. Use etanol, a fim de manter o tubo termina como estéril quanto possível. Passe a tubulação da bomba através da bomba e pinça aberta. Pressionar manualmente a bomba até que a mídia começa a fluir para dentro do vaso chemostat. Solte a tubulação da bomba, a mídia deve fluir livremente para dentro do vaso chemostat. Quando a mídia atinge o tubo de efluentes, recoloque a tubulação à bomba e pinça.
5. Comece running o programa básico com impulsor conjunto a 400 rpm e a temperatura fixada em 30 ° C.
6. Para calibrar fazer ₂ sondas, desligue o suprimento de ar e mudar para o gás nitrogênio. Espere pelo menos uma hora e registro de valor medida como "baixo de leitura". Volte para o fornecimento de ar (ou seja, contendo concentração de oxigênio ambiente), espere pelo menos uma hora e medição registro como "alta de leitura".
7. Iniciar a gravação de dados usando o software Iris.

4. Inoculação

1. Usar 70% de etanol para esterilizar a parte superior do vaso de cultura.
2. Remover o parafuso na parte superior do vaso e pipeta de 1 ml de uma cultura durante a noite para dentro do vaso quimiostato. Volte a apertar o parafuso.
3. Indique o tempo de inoculação em Iris.
4. Espere cerca de 24 horas para que as culturas para atingir fase estacionária adiantada. À medida que a cultura cresce, oxigênio dissolvido e pH diminuirá. No caso dos meios de limitação de glucose, oxigénio dissolvido voltará a ~ 100% em pha estacionáriasi. Por outras limitações nutricionais oxigénio dissolvido permanecerá <100% na fase estacionária.

5. Iniciando Bombas e Atingir estado estacionário

1. A taxa de diluição é calculada dividindo o caudal (quanto mídia flui para dentro do vaso por hora) através do volume de cultura. Por exemplo, usando um volume de 300 ml, uma taxa de diluição de 0,1 significa que 30 ml de meio é adicionada à cultura a cada hora. Uma vez que o sistema se encontra sob pressão positiva o mesmo volume é removido a partir do vaso de assegurar que a cultura é continuamente diluído. Uma gama de taxas de diluição (D) pode ser usado, que não excedam a taxa máxima de crescimento (μ _max) das células, acima do qual as células serão lavadas para fora do chemostat.
2. Escolha as configurações de bomba, que especificam o número de segundos a bomba é ligado e desligado, para estabelecer a vazão desejada. A bomba fornece meios de comunicação, a uma taxa de ~ 0,11 ml / seg.
3. Definir um programa usando o Sixfors interface que especifica o tempo da bomba, a temperatura ea velocidade do rotor. Inicie o programa.
4. Esvazie os recipientes de coleta de líquido e registrar o tempo.
5. Depois de pelo menos duas horas, utilizar uma proveta para medir a quantidade de meios de comunicação tenha sido removido a partir do vaso. Isto será igual ao volume que foi adicionado ao recipiente de quimiostato. Calcular a taxa de diluição (D = V _efluentes / V _Cultura / tempo). Ajuste as configurações da bomba se a taxa de diluição calculada não coincide com taxa de diluição desejada.
6. No estado estacionário, a densidade celular no quimiostato não muda ao longo do tempo. Isto pode ser medido sem perturbar a cultura através da amostragem do fluxo de saída. Nós operacionalmente definir atingir o estado estacionário como medições da densidade de células idênticas que são separadas por pelo menos uma duplicação da população. Alcançando estado estacionário levará aproximadamente oito gerações de cultura após o início da diluição da cultura. No estado de equilíbrio, as células crescem exponencialmente (i.e. taxa de crescimento constante ao longo do tempo), em condições limitadas em nutrientes. O tempo de duplicação da população (tempo de geração) é ln (2) / D.
7. Continuar a medir periodicamente efluentes para a duração da experiência para assegurar que uma taxa de diluição é mantida constante.

6. Aplicação 1: estudar as células a crescer a taxas diferentes em condições de estado estacionário

1. No estado estacionário no quimiostato, a taxa de crescimento da população de células é igual à taxa de diluição. Ao alterar sistematicamente a taxa de diluição é possível cultivar células em taxas diferentes. Isso permite que o estudo sistemático de parâmetros fisiológicos que variam de acordo com a taxa de crescimento, incluindo o volume da célula, o estágio do ciclo celular e resistência ao estresse. Além disso, os perfis de estado estacionário de ARNm globais, proteína e níveis de metabolito pode ser ensaiada em células em crescimento em taxas diferentes. Há duas maneiras de adquirir amostras:
2. Pequenas amostras podem ser passivamente obretidos pela colocação da extremidade do tubo efluente em um tubo de 1,5 ml ou 15 ml. Uma amostra de 1-5 ml pode ser obtido em poucos minutos (dependendo da velocidade de fluxo). Muitos parâmetros fisiológicos pode ser medido a partir dessas amostras.
3. Expressão de genes, ou de metabolito análises exigem maiores amostras que devem ser obtidos mais rapidamente possível. Coloque a extremidade do tubo efluente em um tubo cónico de 15 ml. Solte o parafuso que prende a ponta de metal do tubo de efluentes e empurrar para baixo suavemente. A ~ 10 ml de amostra vai rapidamente preencher o seu tubo. Tenha em atenção que o volume no vaso de quimiostato mudou. Se várias amostras consecutivas são tomadas pode ser necessário para reduzir o fluxo para manter uma taxa de diluição constante.

7. Aplicação 2: Medição precisa das diferenças de taxas de crescimento entre os genótipos em ambientes controlados usando ensaios de competição baseados em citometria de fluxo

1. Quimióstatos pode ser utilizado para quantificar com precisão o efeito da concentração de nutrientessobre as diferenças nas taxas de crescimento (ou seja, de aptidão) entre diferentes origens genéticas. Por estirpes de co-cultura marcados com diferentes proteínas fluorescentes a taxa de alteração na abundância relativa durante o crescimento exponencial é determinada. A realização deste ensaio, em diferentes taxas de diluição (D) permite o estudo dos efeitos de concentração de nutrientes (s) sobre as diferenças de aptidão.
2. Estabelecer culturas de estado estacionário das duas linhagens nos vasos quimiostato separadas com taxas de diluição idênticos e um volume de 300 ml.
3. Passivamente amostra 1 ml de cada navio. Gire as células, ressuspender em tampão fosfato (PBS) e colocar a 4 ° C. Estas amostras contêm amostras de células homogêneas, que são controles para a análise de citometria de fluxo subseqüente.
4. Coloque o tubo de efluentes de um navio em um cilindro graduado autoclavado. Solte o parafuso que prende a ponta de metal do tubo de efluentes e empurre para baixo para expelir as células do chemostat. Quandoo volume atinge 150 ml, devolver o metal final do tubo efluente para a sua posição original (300 ml). Repetir com o segundo vaso, utilizando uma proveta graduada diferente.
5. Use etanol a 70% para manter a esterilidade durante a remoção do parafuso na parte superior do vaso de quimiostato. Coloque funil na abertura e despejar 150 ml de outra cultura no vaso quimiostato. Volte a apertar o parafuso. Repetir com o segundo vaso, usando o segundo funil. Cada vaso quimiostato agora contém uma mistura das duas estirpes.
6. Obter uma amostra de 1 ml de cada navio utilizando amostragem passiva cada 2-6 horas. Gire as células, ressuspender em PBS e armazenar a 4 ° C. Continue a tomar amostras para a gravação de 2-3 dias com cuidado o tempo que cada amostra foi colhida.
7. No fim do experimento, sonicado e diluir as amostras a ~ 2 x 10 ⁶ células / ml. Utilizando citometria de fluxo, medir a proporção das duas estirpes em cada amostra. Como ambas as tensões estão crescendo exponencialmente, a diferença da taxa de crescimento relativo édeterminada por regressão linear de ln (strain1/strain2) contra o tempo (medido em gerações). O declive da regressão é proporcional à diferença na taxa de crescimento (isto é, a vantagem de fitness) de uma estirpe em relação à outra.
8. Como a cultura mista pode levar algum tempo para atingir um novo estado de equilíbrio, momentos precoce pode caber mal à regressão. Esta questão é melhor resolvido, permitindo 2-3 gerações a decorrer antes de iniciar a amostragem ou removendo pontos iniciais, que são valores atípicos claras. Por outro lado, uma vez que uma cepa tem suplantado o outro os dados não são mais úteis e esses pontos devem ser excluídos.

8. Aplicação 3: Evolução Experimental

1. Evolução Experimental realizado em quimiostatos seleciona para mutantes que são aumentados em fitness no ambiente limitado em nutrientes. Seleção geralmente é realizada ao longo de centenas de gerações.
2. Estabelecer uma cultura chemostat estado estacionário utilizando uma cepagenótipo do conhecido (e seqüência do genoma de preferência conhecida) e um nutriente-limitação definida.
3. Para manter um "registro fóssil" da população adaptação passiva provar chemostat cada 2-3 dias e armazenar a amostra em 15% de glicerol a -80 ° C.
4. Monitorar o reservatório mídia e reabastecer com meios frescos, se necessário.
5. Manter a cultura exponencialmente crescente de várias centenas de gerações.
6. Após a conclusão da placa de selecção de uma amostra de células em placas de agar sólido. Após as células se transformaram em colônias, pegar uma amostra imparcial de colônias usando palitos de dente e inocular clones em poços individuais de uma placa de 96 poços contendo 100 ml de mídia. Permitir amostras clonais para crescer durante a noite, adicionar 100 ml de 30% de glicerol e armazenar em -80 ° C.
7. Caracterizar clones por seqüenciamento do genoma inteiro e realizando ensaios fenotípicos, incluindo a avaliação de aptidão física, utilizando uma estirpe de referência comum fluorescente etiquetado, conforme descrito na Aplicação 2.

Resultados

Uma grande vantagem do quimióstatos é a capacidade de controlar a taxa de crescimento das células experimentalmente ao variar a taxa de diluição. Na brotação levedura, Saccharomyces cerevisiae, a morfologia de uma célula é informativo da fase do ciclo de divisão celular. As populações com taxas de crescimento superiores contêm uma maior proporção de células em divisão activa tal como determinado através da medição da fracção de células não gemuladas (Figura 5A). Análises de expr...

Discussão

Quimióstatos permitir o cultivo dos microrganismos em condições de estado estacionário de crescimento controlado. As células crescem continuamente a uma velocidade constante, resultando em um ambiente externo invariante. Isto está em contraste com os métodos de cultura em lotes em que o ambiente externo está em constante mudança e a taxa de crescimento das células é determinado pela interacção complexa de ambiente e genótipo. Assim, uma importante vantagem da cultura de micróbios em quimióstatos mais cul...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infors-HT Sixfors Chemostat	Appropriate Technical Resources, Inc.
Glass Bottle 9.5 L	Fisher Scientific	02-887-1	For Media Vessel and Hosing
Pinchcock	Fisher Scientific	05-867	For Media Vessel and Hosing
Stopper, Size 12, Green Neoprene	Cole-Palmer	EW-62991-42	For Media Vessel and Hosing
Straight Connector	Cole-Palmer	EW-30703-02	For Media Vessel and Hosing
General purpose ties 4 in	Fisher Scientific	NC9557052	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone Rubber	Small Parts	B000FMWTDE	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 3/8 in OD	Fisher Scientific	02-587-1Q	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 7/32 in OD	Fisher Scientific	02-587-1E	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD	McMaster-Carr	6100K164	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD	McMaster-Carr	6100K161	For Media Vessel and Hosing
Hook Connectors	Fisher Scientific	14-66-18Q	For Media Vessel and Hosing
Ratchet Clamp	Cole-Palmer	EW-06403-11	For Media Vessel and Hosing
Luer, Female	Cole-Palmer	EW-45512-34	For Media Vessel and Hosing
Luer, Male	Cole-Palmer	EW-45513-04	For Media Vessel and Hosing
Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm	Fisher Scientific	MTGR05010	For Media Vessel and Hosing
PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm	Fisher Scientific	NC9131037	For Media Vessel and Hosing
Direct-Reading Flowtube for Air	Cole-Palmer	EW-32047-77	For Nitrogen Gas Setup
Direct-Reading Flowtube for Nitrogen	Cole-Palmer	EW-32048-63	For Nitrogen Gas Setup
Gas Proportioner Multitube Frames	Cole-Palmer	EW-03218-50	For Nitrogen Gas Setup
Regulator, Two-Stage Analytical	Airgas	Y12-N145D580	For Nitrogen Gas Setup
Hose Adaptor, Stainless Steel	Airgas	Y99-26450	For Nitrogen Gas Setup
Hose Male Adaptor	Airgas	WES544	For Nitrogen Gas Setup
Norprene Tubing	US Plastics	57280	For Nitrogen Gas Setup
Tripod Base	Cole-Palmer	EW-03218-58	For Nitrogen Gas Setup
Valve Cartridges	Cole-Palmer	EW-03217-92	For Nitrogen Gas Setup
Carboy 10 L	Fisher Scientific	02-963-2A	For Media Preperation
Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size	Fisher Scientific	SCGP-T10-RE	For Media Preperation
Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size	Fisher Scientific	FB-800-100	For Media Preperation
calcium chloride·2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Media Reagents
sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	Media Reagents
magnesium sulfate·7H2O	Sigma Aldrich	230391	Media Reagents
potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	AC424205000	Media Reagents
ammonium sulfate	Fisher Scientific	AC423400010	Media Reagents
potassium chloride	Sigma Aldrich	P9541	Media Reagents
boric acid	Sigma Aldrich	B6768	Media Reagents
copper sulfate·5H2O	Sigma Aldrich	209198	Media Reagents
potassium iodide	Sigma Aldrich	60400	Media Reagents
ferric chloride·6H2O	Fisher Scientific	I88-100	Media Reagents
manganese sulfate·H2O	Sigma Aldrich	230391	Media Reagents
sodium molybdate·2H2O	Sigma Aldrich	M7634	Media Reagents
zinc sulfate·7H2O	Fisher Scientific	Z68-500	Media Reagents
biotin	Fisher Scientific	BP232-1	Media Reagents
calcium pantothenate	Fisher Scientific	AC24330-1000	Media Reagents
folic acid	Sigma Aldrich	F7876	Media Reagents
inositol (aka myo-inositol)	Fisher Scientific	AC12226-1000	Media Reagents
niacin (aka nicotinic acid)	Sigma Aldrich	N4126	Media Reagents
p-aminobenzoic acid	Fisher Scientific	AC14621-2500	Media Reagents
pyridoxine HCl	Sigma Aldrich	P9755	Media Reagents
riboflavin	Sigma Aldrich	R4500-25G	Media Reagents
thiamine HCl	Fisher Scientific	BP892-100	Media Reagents
Leucine	Sigma Aldrich	L8000-100G	Media Reagents
Uracil	Sigma Aldrich	U0750	Media Reagents
Dextrose	Fisher Scientific	DF0155-08-5	Media Reagents