השימוש בChemostats בביולוגיה מיקרוביאלית מערכות

Summary

שיעור צמיחת תאים הוא תהליך מוסדר וקובע עיקרי של פיזיולוגיה של תא. culturing הרציף באמצעות chemostats מאפשר שליטה חיצונית של שיעור צמיחת תאים על ידי הגבלה תזונתית להקל על הלימוד של רשתות מולקולריות השולטות צמיחת תאים וכיצד רשתות אלה להתפתח כדי לייעל את צמיחת תאים.

Abstract

תאים לווסת את קצב צמיחה שלהם בתגובה לאותות מהעולם החיצוני. כתא גדל, תהליכים תאיים שונים חייבים להיות מתואמים ביניהם סינתזת macromolecular, חילוף חומרים וסופו של דבר, מחויבת למחזור חלוקת תא. Chemostat, שיטה של ​​ניסוי שליטה שיעור צמיחת תאים, מספקת אמצעי רב עוצמה של שיטתי לומד כיצד תהליכים תאיים משפיע שיעור צמיחה - הכוללים ביטוי גנים וחילוף חומרים - ורשתות רגולטורים ששולטות בקצב גדילת תאים. כאשר נשמר במשך מאות דורות chemostats יכול לשמש כדי לחקור אבולוציה אדפטיבית של חיידקים בתנאים סביבתיים המגבילים את צמיחת תאים. אנו מתארים את העיקרון של תרבויות chemostat, להדגים את פעולתם ולספק דוגמאות של היישומים השונים שלהם. לאחר תקופה של חוסר שימוש לאחר כניסתה שלהם באמצע המאה העשרים, ההתכנסות של מתודולוגיות הגנום בקנה מידה עם מחודשת בterest בויסות גדילת תאים ואת הבסיס המולקולרי של אבולוציה אדפטיבית הוא מגרה רנסנס בשימוש בchemostats במחקר ביולוגי.

Introduction

הצמיחה של תאים מווסתות על ידי רשתות מורכבות של האינטראקציה ^1,2 גורמים גנטיים וסביבתיים. הרגולציה multifactorial של צמיחת תאים מחייבת גישה ברמת מערכת למחקר שלה. עם זאת, המחקר הקפדני של צמיחת תאים מוסדרת הוא קרא תיגר על ידי הקושי בניסוי שליטה על הקצב שבו תאים לגדול. יתר על כן, אפילו בניסויים הפשוטים תנאים תאיים הם לעתים קרובות דינמיים ומורכבים כמו תאים ברציפות לשנות את הסביבה שלהם כמו שהם מתרבים. פתרון לבעיות אלו מסופק על ידי chemostat: שיטה של ​​culturing תאים המאפשרת שליטת ניסיוני של שיעורי צמיחת תאים בסביבות מוגדרות, בלתי משתנה ומבוקרות.

השיטה של תרבית רציפה באמצעות chemostat תוארה באופן עצמאי על ידי מונה ³ ונוביק & ⁴ סילארד ב1950. כמו נולד במקור, תאים גדלים בנפח קבוע של תקשורת שהוא קוןדילול tinually על ידי תוספת של מדיה חדשה וההסרה בו זמנית של אמצעי תקשורת ותאים ישנים (איור 1). משוואות דיפרנציאליות רגילות יחד (איור 2) מתארות את שיעור השינוי בתא צפיפות (x) ואת הריכוז של חומר מזין הגבלת צמיחה (ים) בכלי chemostat. חשוב מכך, מערכת זו של משוואות צופה בודד (שאינו אפס) יציב מצב יציב (איור 3) עם המשמעות יוצאת דופן, כי במצב יציב, קצב הגידול הספציפי של התאים (כלומר קבוע שיעור צמיחה מעריכית) שווה לשיעור שבתרבות בדילול מלא (ד '). על ידי שינוי שיעור דילול זה אפשרי להקים אוכלוסיות מצב יציב של תאים על שיעורי צמיחה שונים ובתנאים שונים של הגבלה תזונתית.

השליטה הניסיונית של שיעור צמיחה באמצעות chemostats הייתה קריטית להתפתחות של הבנה של אופן ששינויים בפיזיולוגיה של תאיםעם שיעורים של ^5,6 צמיחה. עם זאת, עמוד התווך לשעבר זה של שיטות מיקרוביולוגיות הפך מעורפל יותר ויותר במהלך הפיצוץ במחקר בביולוגיה מולקולרית בשלהיי המאה העשרים. כיום, עניין מחודש בצמיחת שליטה בשני חיידקים ויצורים רב תאיים וכניסתו של שיטות הגנום בקנה מידה לניתוח ברמת מערכות חידש מוטיבציה לשימוש בchemostats. כאן, אנו מתארים שלושה יישומים שמנצלים את השליטה המדויקת של שיעורי צמיחת תא והסביבה החיצונית, כי הם ייחודי אפשריים באמצעות chemostats. ראשית, אנו מתארים את השימוש של chemostats לחקור כיצד השפע של אלפי ביומולקולות - כגון תמלילים ומטבוליטים - מוסדרים מתואם עם קצב צמיחה. שנית, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש chemostats לקבל אומדנים מדויקים של הבדלי צמיחה בשיעור שבין גנוטיפים שונים בסביבות מוגבלות תזונתיים באמצעות ניסויי תחרות. שלישית, אנו מתארים כיצד chemostats יכוללשמש כדי לחקור אבולוציה אדפטיבית של תאים גדל בסביבות תזונתיות ירודה קבועים. דוגמאות אלה ממחישים את הדרכים שבהן chemostats מאפשרות לחקירות ברמת מערכות של רגולציה צמיחת תאים, גן על ידי אינטראקציות סביבה והתפתחות אדפטיבית.

Protocol

עיקרון culturing הרציף באמצעות chemostat יכול להתממש במגוון רחב של יישומים. בכל chemostats זה חיוני שיהיה לי 1) שיטות לשמירה על סטריליות של כל הרכיבים, 2) תרבות מעורבת היטב, 3) אוורור מתאים של כלי התרבות ו4) אמצעי אמין של תקשורת ובנוסף הסרת התרבות. כאן, אנו מתארים את השימוש של bioreactor Sixfors (INFORS Inc) כchemostat תוך שימוש בשיטות שניתן להתאים בקלות להגדרות חלופיות.

1. להרכבת כלי שייט Chemostat

1. הפעל את Sixfors באמצעות המתג הראשי.
2. לשטוף ביסודיות את כלי chemostat, הרכבה בוחש, וצינורות מחוברים עם מים deionized (DI). בדוק את כל צינורות וO-טבעות ולהחליף את כל חלקים שחוקים מחפש.
3. ודא שבסיס תמיכת פיר הכונן פונה כלפי מעלה בכלי הזכוכית, ושחלקו העליון של פיר הכונן היא התפרצה לדיור שלה בהרכבת הבוחש. הגדר את stirreההרכבה r לתוך כלי הזכוכית להבטיח את החלק התחתון של פיר הכונן יושבת בתמיכת פיר כונן. השתמש במהדק כדי לחזק את מערך stirrer לכלי הזכוכית.
4. למלא את הכלי עם כ 300 מיליליטר של מים די.
5. הסר את הפקקים מחמצן מומס (DO ₂₎ בדיקה ובדוק את מפלס האלקטרוליט ידי שחרור המעטפת התחתונה ולוודא כי המעטפת התחתונה מלאה באמצע הדרך עם תמיסת אלקטרוליט. Rescrew המעטפת התחתונה ולהכניס לתוך הנמל בספינת chemostat. בורג עד הדוק אצבע.
6. קח את הבדיקה ה-pH ולהסיר אותו מהמאגר שלה אחסון (3 M KCl). הסר את מכסה הבדיקה ה-pH ולצרף fermentor 1. שימוש במסך שליטת Sixfors, לנווט לתפריט פרמטר fermentor ובחר באפשרות "לכייל pH". מניחים את חללית ה-pH לחיץ pH 7 סטנדרטי ושיא קריאה כגבוה קראו. חזור על פעולה עם ה-pH 4 חיץ ושיא קריאה כנמוך קראו. לנתק את הבדיקה ה-pH מfermentor, לשטוף עם מים די והכנס את int הבדיקהo היציאה בכלי chemostat. בורג עד הדוק אצבע.
7. מניחים את כלי chemostat במעמד. הערה על הספינה שfermentor (1-6) הבדיקה ה-pH הייתה קשורה ולמכוילת. מניחים את כובע הבדיקה pH בבדיקת ה-pH. חוזקה באמצעות נייר כסף לכסות את החלק העליון של החללית לעשות _2.
8. מקפלים נייר כסף מעל הקצוות של צינורות מחוברים לכלי שיט chemostat.
9. חזור על שלבים 1.2-1.8 לכל כלי.
10. לעקר את כלי על ידי המעוקר ל15 דקות על מחזור נוזלי.

2. הכנת מדיה

1. להקים את מגוון הגבלה של ריכוזים לתזונתיים על ידי גידול תרביות אצווה בריכוזי חומרי הזנה שונים. מזין הוא הגבלה בטווח שבו צפיפות התא הסופית היא פונקציה לינארית של ריכוז החומר המזין הראשוני (איור 4). בחר ריכוז תזונתי גם בתוך הטווח המגביל. דוגמאות להרכב תקשורת סטנדרטית ללימודים עם Saccharomycecerevisiae של זמין ^ב7-11.
2. החיטוי בקבוק ריק שהוא הכתיר עם תקע גומי המכיל כניסת אוויר וכלי תקשורת לאחר שווידאת הראשונה כי בסופו של צינור התקשורת מכוסה בנייר כסף.
3. בכלי נפרד להכין 10 L של מדיה.
4. צרף כוס מסנן 500 מיליליטר לבקבוק 100 תקשורת מיליליטר. הסר את מסנן הכותנה עם מלקחיים המעוקרים באתנול ומייד לצרף את נמל הסינון על בקבוק התקשורת.
5. צרף את בקבוק התקשורת למקור ואקום ומסנן לעקר תקשורת ידי הוספתו לכוס המסנן.
6. כאשר הסינון של תקשורת הוא מוחלט, לסגור את נמל הסינון עם מהדק מתכת.

3. כיול לעשות ₂ בדיקות והגדרת Chemostat

1. לאחר כלי chemostat כבר autoclaved ואפשרו להתקרר מקום הכלי במעיל החום המתאים לו. חבר את הבדיקה הטמפרטורה, הבדיקה ה-pH, ולעשות ₂ חללית. בואוכלי לשבת עם העצמה בלפחות 6 שעות כדי לאפשר ₂ בדיקות לעשות כדי לקטב.
2. מניחים את הקצה של כל צינור שפכים לקיבול איסוף נפרד. חבר את אספקת האוויר באמצעות מסנן autoclaved ולהפעיל את זרימת אוויר. המים בכל כלי צריכים לזרום החוצה מצינורות השפכים, אשר מציין כי כל החותמות נוצרות כראוי.
3. התאם את גובה צינור השפכים בהתאם להיקף העבודה הרצוי (למשל 300 מיליליטר). אנו משתמשים בסרגל שמסומן עם מיקומי צינור מכוילים לנפחי עבודה שונים.
4. חבר את בקבוק המדיה לכלי שיט chemostat. השימוש באתנול כדי לשמור על הצינור מסתיים סטרילי ככל האפשר. השחל את צינור המשאבה דרך המשאבה והמהדק פתוח. באופן ידני לחץ על המשאבה עד שהתקשורת מתחילה לזרום לתוך כלי chemostat. לשחרר צינורות ממשאבה, תקשורת צריכה לזרום בחופשיות לתוך כלי chemostat. כאשר התקשורת מגיעה לצינור השפכים, חבור מחדש צינורות לשאיבה ולצבוט.
5. התחל running התכנית הבסיסית עם סט גלגל מניע ל400 סל"ד והטמפרטורה שנקבעה ב30 ° C.
6. על מנת לכייל את ₂ בדיקות לעשות, לכבות את אספקת אוויר ולעבור לשימוש בגז חנקן. חכה לפחות שעה אחת וערך מדד שיא כמו "נמוכה לקריאה". לעבור בחזרה לאספקת אוויר (כלומר המכילה ריכוז חמצן סביבה), לחכות לפחות שעה אחת נוספת ומדידת שיא כמו "גבוהה לקריאה".
7. ליזום הקלטת נתונים באמצעות תוכנת איריס.

4. חיסון

1. השתמש 70% אתנול לעקר החלק העליון של כלי התרבות.
2. הסר את הבורג על גבי כלי שיט ופיפטה 1 מיליליטר של תרבות לילה לתוך כלי chemostat. הדק מחדש את בורג.
3. לציין את הזמן של חיסון באיריס.
4. המתן כ24 שעות לתרבויות להגיע לשלב נייח מוקדם. כתרבות גדלה, חמצן וחומציות מומסים יקטנו. במקרה של תקשורת הגבלת גלוקוז, חמצן מומס יחזור בPHA נייח ~ 100%se. למגבלות תזונתיים אחרות חמצן מומס יישאר <100% בשלב נייח.

5. ייזום משאבות והשגת מצב יציב

1. שיעור הדילול מחושב על ידי חלוקת קצב הזרימה (עד כמה תקשורת זורמת לתוך הכלי לשעה) על ידי תרבות הנפח. לדוגמא, שימוש בנפח של 300 מיליליטר שיעור דילול של 0.1 אומר ש30 מיליליטר של תקשורת מתווסף לתרבות בכל שעה. מכיוון שהמערכת נמצאת בלחץ חיובי באותו הנפח הוא להסיר את הכלי להבטיח שהתרבות היא מדוללת ברציפות. מגוון רחב של שיעורי דילול (ד ') ניתן להשתמש שלא יעלה על השיעור המרבי הצמיחה _{(מקסימום} μ) של התאים, ומעליו התא יהיה דהוי של chemostat.
2. בחר הגדרות משאבה, אשר מפרט את מספר שניות שהמשאבה היא לסירוגין, כדי לבסס את קצב הזרימה הרצויה. המשאבה מספקת תקשורת בשיעור של ~ 0.11 מיליליטר / שנייה.
3. הגדרת תכנית באמצעות int Sixforserface המציין את תזמון המשאבה, טמפרטורה ומהירות impellor. הפעל את התכנית.
4. רוקן את מכלי האיסוף של נוזל ולהקליט את הזמן.
5. אחרי לפחות שעות, השתמש גליל סיים למדוד כמה תקשורת הוסרה מהכלי. זה יהיה שווה את הנפח שנוסף לכלי שיט chemostat. לחשב את שיעור הדילול (D = _השפכים V / V _תרבות / שעה). התאם את הגדרות משאבה אם שיעור דילול מחושב אינו תואם את שיעור דילול הרצוי.
6. במצב יציב, צפיפות תאים בchemostat אינה משתנה לאורך זמן. זו ניתן למדוד ללא מביך את התרבות על ידי דגימת יצוא. אנו מבצעי מגדירים השגת המצב יציב כמדידות צפיפות תאים זהות שמופרדות על ידי הכפלת אוכלוסייה אחת לפחות. להגיע למצב יציב ייקח כשמונה דורות תרבות לאחר תחילת דילול התרבות. במצב יציב, תאים גדלים באופן מעריכי (I.דואר. קצב קבוע צמיחה לאורך זמן) בתנאים מוגבלים בחומרים מזינים. זמן ההכפלה של האוכלוסייה (זמן דור) הוא ln (2) / D.
7. המשך למדוד מעת לעת כמויות שפכים לתקופת הניסוי, כדי להבטיח ששיעור דילול קבוע נשמר.

6. תאי לימוד גידול בשיעורים שונים בתנאי מצב יציב: יישום 1

1. במצב יציב בchemostat, קצב הגידול של האוכלוסייה של תאים הוא שווה לשיעור הדילול. באופן שיטתי לשנות את שיעור הדילול שניתן לגדל תאים בשיעורים שונים. זה מאפשר הלימוד השיטתי של פרמטרים פיסיולוגיים המשתנים בקצב צמיחה הכולל נפח תא, שלב מחזור התא והתנגדות ללחץ. בנוסף, פרופילי מצב יציב של mRNA הגלובלי, חלבון ורמות המטבוליט ניתן assayed בתאים הולך וגדל בקצב שונה. ישנן שתי דרכים לרכישת דגימות:
2. דגימות קטנות יכולות להיות פסיבי obמזרקה על ידי הצבת סוף צינור השפכים לצינור מיליליטר 1.5 מיליליטר או 15. ניתן להשיג מדגם של 1-5 מ"ל בכמה דקות (תלוי בקצב הזרימה). ניתן למדוד פרמטרים פיסיולוגיים רבים מדוגמאות אלה.
3. ניתוחי ביטוי גנים, או המטבוליט דורשים דגימות גדולות יותר, כי יש לקבל מהר ככל האפשר. מניחים את הקצה של צינור השפכים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. שחרר את הבורג מחזיק את קצה המתכת של צינור השפכים ולדחוף למטה בעדינות. ~ 10 מדגם מיליליטר במהירות ימלא הצינור שלך. יש לזכור כי הנפח בכלי chemostat השתנה. אם רבות דגימות רצופות נלקחות זה עשוי להיות נחוץ כדי להפחית את הזרימה כדי לשמור על שיעור דילול מתמיד.

7. יישום 2: מדידה מדויקת של הבדלים בשיעורי צמיחה בין גנוטיפים בסביבות מבוקרות באמצעות מבחני תחרות מבוססות Cytometry הזרימה

1. Chemostats יכול לשמש כדי לכמת את ההשפעה של ריכוז חומר מזין באופן מדויקעל הבדלים בשיעורי צמיחה (כלומר כושר) בין רקע גנטי שונה. על ידי זני שיתוף culturing שכותרתו עם חלבוני ניאון שונים שיעור השינוי בשפע יחסי בגידול מעריכי נקבע. ביצוע assay זה בשיעורים שונים דילול (D) מאפשר הלימוד של השפעות של ריכוז חומר מזין (ים) על הבדלי כושר.
2. להקים תרבויות מצב יציבה של שני הזנים בכלי chemostat נפרדים עם שיעורי דילול זהים ונפח של 300 מיליליטר.
3. באופן פסיבי לדוגמא 1 מיליליטר מכל כלי. ספין למטה תאים, resuspend ב פוספט שנאגרו מלוח (PBS) ומקום ב 4 ° C. דגימות אלה מכילות דגימות תאים הומוגנית, שהם שולט על ניתוח התזרים cytometry שלאחר מכן.
4. מניחים את צינור השפכים מכלי שיט אחד לautoclaved גליל סיים. שחרר את הבורג מחזיק את קצה המתכת של צינור השפכים ובעדינות לדחוף למטה לגרש תאים מchemostat. כאשרהנפח מגיע 150 מיליליטר, להחזיר את סוף המתכת של צינור השפכים למיקום המקורי שלה (300 מיליליטר). חזור עם הכלי השני, באמצעות גליל סיים שונה.
5. השתמש 70% אתנול כדי לשמור על סטריליות בעת הסרת בורג בחלק העליון של כלי chemostat. מניחים משפך בפתיחה ויוצקים 150 מיליליטר מהתרבות אחרת לתוך כלי chemostat. הדק מחדש את בורג. חזור עם הכלי השני, תוך שימוש במשפך השני. כל כלי chemostat כעת מכיל תערובת של שני הזנים.
6. להשיג מדגם מיליליטר 1 מכל כלי שיט באמצעות דגימה פסיבית בכל שעות 2-6. ספין למטה תאים, resuspend ב PBS ולאחסן ב 4 ° C. המשך נטילת דגימות להקלטת הזמן כל דגימה נלקחה 2-3 ימים בזהירות.
7. בסוף הניסוי, sonicate ולדלל דגימות ל~ 2 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר. באמצעות cytometry זרימה, למדוד את חלקן של שני הזנים במדגם זה. כשני הזנים גדלים באופן אקספוננציאלי, הבדל שיעור גידול היחסי הואנקבע על ידי רגרסיה ליניארית של ln (strain1/strain2) נגד זמן (נמדד בדורות). השיפוע של רגרסיה הוא ההבדל היחסי בקצב צמיחה (כלומר יתרון הכושר) של אחד זן ביחס לאחרים.
8. כתרבות המעורבת יכולה לקחת קצת זמן כדי להגיע למצב יציב חדש, נקודות זמן המוקדם עשויות להתאים היטב לרגרסיה. בעיה זו נפתרה על ידי המיטב המאפשר 2-3 דורות לחלוף לפני תחילת דגימה או הסרת נקודות מוקדם כי הם חריגים ברורים. לעומת זאת, ברגע שזן אחד outcompeted אחר נתונים הם כבר לא שימושיים ולא לכלול את הנקודות הללו.

8. יישום 3: אבולוציה ניסויית

1. אבולוציה ניסיונית שבוצעה בchemostats בוחרת עבור מוטציות שהם גדלו בכושר בסביבה מוגבל בחומרים המזינה. בחירה מתבצעת בדרך כלל על פני מאות דורות.
2. להקים תרבות chemostat מצב יציב באמצעות מתחגנוטיפ של ידוע (ורצף הגנום רצוי ידוע) ומזין הגבלה מוגדרת.
3. כדי לשמור על "המאובנים" של אוכלוסיית ההסתגלות פסיבית לטעום chemostat כל 2-3 ימים ולאחסן את הדגימה בגליצרול 15% ב -80 ° C.
4. לפקח על מאגר המדיה ולחדש עם מדיה חדשה לפי צורך.
5. לשמור על התרבות גדלה באופן אקספוננציאלי לכמה מאה דורות.
6. לאחר השלמת את צלחת בחירת מדגם של תאים על צלחות אגר מוצקות. לאחר התאים גדלו לתוך מושבות, לבחור מדגם מוטה של ​​מושבות באמצעות קיסמים ולחסן שיבוטים לתוך בארות בודדות של צלחת 96 היטב המכילה המדיה 100 μl. לאפשר דגימות משובטים לגדול בין לילה, להוסיף של גליצרול 30% וחנות 100 μl ב-80 ° C.
7. לאפיין שיבוטים על ידי רצף הגנום כולו וביצוע מבחני פנוטיפי כולל הערכה של כושר, באמצעות מתח התייחסות שכותרתו fluorescently משותף, כפי שמתוארים ביישום 2.

תוצאות

יתרון עיקרי של chemostats הוא היכולת לשלוט על קצב הצמיחה של תאים בניסוי על ידי שינוי שיעור הדילול. בשמרי ניצנים, שמר אפייה, המורפולוגיה של תא הוא אינפורמטיבי של השלב שלה במחזור חלוקת תא. אוכלוסיות עם שיעורי צמיחה גבוהים יותר מכילות שיעור גבוה יותר של תאים המתחלקים באופן פע...

Discussion

Chemostats לאפשר הטיפוח של חיידקים בתנאי מצב יציב בשליטת צמיחה. התאים גדלים ברציפות בקצב קבוע וכתוצאה מכך סביבה חיצונית משתנה. זאת בניגוד לשיטות התרבות אצווה שבסביבה החיצונית משתנית ללא הרף ובקצב צמיחת תאים נקבע על ידי האינטראקציה המורכבת של הסביבה וגנוטיפ. לפיכך, יתרון ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infors-HT Sixfors Chemostat	Appropriate Technical Resources, Inc.
Glass Bottle 9.5 L	Fisher Scientific	02-887-1	For Media Vessel and Hosing
Pinchcock	Fisher Scientific	05-867	For Media Vessel and Hosing
Stopper, Size 12, Green Neoprene	Cole-Palmer	EW-62991-42	For Media Vessel and Hosing
Straight Connector	Cole-Palmer	EW-30703-02	For Media Vessel and Hosing
General purpose ties 4 in	Fisher Scientific	NC9557052	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone Rubber	Small Parts	B000FMWTDE	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 3/8 in OD	Fisher Scientific	02-587-1Q	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 7/32 in OD	Fisher Scientific	02-587-1E	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD	McMaster-Carr	6100K164	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD	McMaster-Carr	6100K161	For Media Vessel and Hosing
Hook Connectors	Fisher Scientific	14-66-18Q	For Media Vessel and Hosing
Ratchet Clamp	Cole-Palmer	EW-06403-11	For Media Vessel and Hosing
Luer, Female	Cole-Palmer	EW-45512-34	For Media Vessel and Hosing
Luer, Male	Cole-Palmer	EW-45513-04	For Media Vessel and Hosing
Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm	Fisher Scientific	MTGR05010	For Media Vessel and Hosing
PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm	Fisher Scientific	NC9131037	For Media Vessel and Hosing
Direct-Reading Flowtube for Air	Cole-Palmer	EW-32047-77	For Nitrogen Gas Setup
Direct-Reading Flowtube for Nitrogen	Cole-Palmer	EW-32048-63	For Nitrogen Gas Setup
Gas Proportioner Multitube Frames	Cole-Palmer	EW-03218-50	For Nitrogen Gas Setup
Regulator, Two-Stage Analytical	Airgas	Y12-N145D580	For Nitrogen Gas Setup
Hose Adaptor, Stainless Steel	Airgas	Y99-26450	For Nitrogen Gas Setup
Hose Male Adaptor	Airgas	WES544	For Nitrogen Gas Setup
Norprene Tubing	US Plastics	57280	For Nitrogen Gas Setup
Tripod Base	Cole-Palmer	EW-03218-58	For Nitrogen Gas Setup
Valve Cartridges	Cole-Palmer	EW-03217-92	For Nitrogen Gas Setup
Carboy 10 L	Fisher Scientific	02-963-2A	For Media Preperation
Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size	Fisher Scientific	SCGP-T10-RE	For Media Preperation
Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size	Fisher Scientific	FB-800-100	For Media Preperation
calcium chloride·2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Media Reagents
sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	Media Reagents
magnesium sulfate·7H2O	Sigma Aldrich	230391	Media Reagents
potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	AC424205000	Media Reagents
ammonium sulfate	Fisher Scientific	AC423400010	Media Reagents
potassium chloride	Sigma Aldrich	P9541	Media Reagents
boric acid	Sigma Aldrich	B6768	Media Reagents
copper sulfate·5H2O	Sigma Aldrich	209198	Media Reagents
potassium iodide	Sigma Aldrich	60400	Media Reagents
ferric chloride·6H2O	Fisher Scientific	I88-100	Media Reagents
manganese sulfate·H2O	Sigma Aldrich	230391	Media Reagents
sodium molybdate·2H2O	Sigma Aldrich	M7634	Media Reagents
zinc sulfate·7H2O	Fisher Scientific	Z68-500	Media Reagents
biotin	Fisher Scientific	BP232-1	Media Reagents
calcium pantothenate	Fisher Scientific	AC24330-1000	Media Reagents
folic acid	Sigma Aldrich	F7876	Media Reagents
inositol (aka myo-inositol)	Fisher Scientific	AC12226-1000	Media Reagents
niacin (aka nicotinic acid)	Sigma Aldrich	N4126	Media Reagents
p-aminobenzoic acid	Fisher Scientific	AC14621-2500	Media Reagents
pyridoxine HCl	Sigma Aldrich	P9755	Media Reagents
riboflavin	Sigma Aldrich	R4500-25G	Media Reagents
thiamine HCl	Fisher Scientific	BP892-100	Media Reagents
Leucine	Sigma Aldrich	L8000-100G	Media Reagents
Uracil	Sigma Aldrich	U0750	Media Reagents
Dextrose	Fisher Scientific	DF0155-08-5	Media Reagents