Aire táctil y Análisis de Movimiento de estrategias de muestreo antenales de las abejas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Samir Mujagić; Simon Michael Würth; Sven Hellbach; Volker Dürr

doi:10.3791/50179

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Resumen

En este protocolo se muestra cómo acondicionar aprovechado las abejas a los estímulos táctiles e introducir una técnica de captura de movimiento 2D para analizar la cinemática de escala fina patrón de muestreo antenal.

Resumen

Las abejas de miel (Apis mellifera L.) son insectos eusociales y bien conocido por su compleja división del trabajo y la capacidad de aprendizaje asociativo ^{1, 2.} Las abejas obreras pasar la primera mitad de su vida en el interior de la colmena oscura, donde se está cuidando las larvas o la construcción de la regular peines hexagonales para la alimentación (por ejemplo polen o néctar) y cría ^3. Las antenas son antenas multi-sensoriales extraordinarias y desempeñan un papel fundamental en diversas tareas táctiles mediadas por ^4, incluyendo la construcción de la colmena ⁵ y reconocimiento de patrones ^6. Más tarde en la vida, cada abeja sale de la colmena para buscar comida. A continuación, una abeja tiene que aprender a discriminar fuentes rentables de alimentos, memorizar su ubicación, y la comunicará a sus compañeros de nido ^7. Las abejas utilizan diferentes señales florales como colores u olores ^{7, 8,} sino también señales táctiles de la superficie del pétalo ⁹ para formar memorias multisensoriales de la fuente de alimento. En virtud de laboratorio conditions, las abejas pueden ser entrenados en un paradigma de aprendizaje apetitivo para discriminar las características táctiles de objetos, tales como bordes o surcos con sus antenas ^{10, 11, 12, 13.} Este paradigma de aprendizaje está estrechamente relacionada con el condicionamiento clásico de la respuesta olfativa de extensión proboscis (PER) en abejas enjaezados ^14. La ventaja del modelo de aprendizaje táctil en el laboratorio es la posibilidad de combinar los experimentos de comportamiento en el aprendizaje con diversas mediciones fisiológicas, incluyendo el análisis del patrón de movimiento antenal.

Protocolo

1. Preparación de las abejas

Recolectoras de néctar o polen son capturados en el campo ya sea desde un alimentador de sacarosa o directamente desde la entrada de la colmena cuando regresaba de un viaje de forrajeo. Cada abeja es capturado en un vial de vidrio que se cierra con un tapón de espuma y se lleva inmediatamente al laboratorio para su posterior manipulación.
En el laboratorio, las abejas se capturaron brevemente enfrió en el refrigerador a 4 ° C hasta que muestren signos primera de inmovilidad.
Cada abeja inmovilizado está montado en un pequeño tubo de metal con cinta adhesiva entre la cabeza y el tórax y en el abdomen. Se debe tener cuidado de que la trompa y las antenas se mueven libremente.
Pintar los ojos compuestos y ocelos de la abeja fijo con pintura blanca (por ejemplo, libre de solventes Tipp-Ex) para ocluir la visión.
Agregar una pequeña gota de cera derretida detrás de la cabeza de la abeja para fijarlo a la cinta entre la cabeza y el tórax para evitar movimientos de la cabeza durante las grabaciones.
Marque cada abeja con un número en la cinta para una mejor identificación y coloque el tubo con la abeja fijo en un ambiente húmedo para evitar la deshidratación.
Alimentar cada sola abeja durante 5 segundos con gotitas de una solución de sacarosa al 30% se presentaron con una jeringa y dejar que todas las abejas recuperar durante 30 min antes de comenzar con el protocolo acondicionado táctil.

2. Aire Táctil

Antes de acondicionamiento, cada abeja tiene que ser probada por la respuesta de extensión probóscide (PER) a un estímulo de sacarosa al 30% aplicado a las antenas. De esta manera la punta de la trompa tiene que cruzar una línea virtual entre las mandíbulas abiertas. Deseche todas las abejas que no responden con un PER para el estímulo de sacarosa.
Para el acondicionamiento táctil utilizar un cubo de latón (por ejemplo, 3 x 5 mm) con una superficie lisa o un patrón de grabado, por ejemplo, horizontal o ranuras verticales que forman una rejilla con 150 micras de longitud de onda, como el estímulo condicionado (CS). Fo el estímulo no condicionado (EE.UU.) utilizar una solución de sacarosa al 30% (azúcar doméstico, diluido en agua).
El cubo de latón (CS) se coloca en un soporte en un micromanipulador (por ejemplo, Märzhäuser MM33) para asegurar el posicionamiento exacto durante el procedimiento de acondicionado. Los EE.UU. se presenta a la abeja con una jeringa llena de una solución de sacarosa al 30%.
El procedimiento de acondicionamiento se compone de cinco emparejamientos de la estímulo táctil (CS) y solución de sacarosa (EE.UU.), con un intervalo entre ensayos (ITI) de 5 min. Coloque una sola abeja en frente de la micromanipulador con el estímulo táctil montada (CS). Coloque la CS lentamente, de tal manera que la superficie del estímulo táctil es paralela a la cabeza de la abeja (Figura 1 A y B). La distancia entre el animal y el objeto táctil debe estar en el rango del radio antenal de trabajo de la abeja probado, es decir, la abeja debe ser capaz de escanear el estímulo táctil en una posición cómoda wi-ésimo ambas antenas. En el ejemplo mostrado en la Figura 1, la distancia era de 3 mm. Deje que la abeja escanear el estímulo táctil (CS) durante 5 segundos. Después de la primera sec 3, presentan una gotita de la sacarosa al 30% (EE.UU.) solución con una jeringa bajo la proboscis. Utilice la punta de la jeringa para elevar suavemente la probóscide. Estimulación sacarosa bajo la probóscide provocará la incondicionado PER ^15. Deje que la abeja a lamer la recompensa sacarosa. Use un cronómetro con una señal de alarma para mantener los intervalos de tiempo exactos durante el acondicionamiento.
El PER acondicionado se usa como una medida para el éxito de aprendizaje de una abeja. Después de que los emparejamientos primera recompensa, las abejas comienzan a responder a la presentación CS, por extensión, de su trompa, lo que indica que esperan que la recompensa futura. A probóscide completamente extendidas observadas en cualquier momento durante la ventana de tiempo de 3 segundos de presentación del estímulo táctil y antes de la presentación de sacarosa se obtuvo una respuesta positiva. No hay respuesta se cuenta negativa. El occurrence de la PER ha de señalar por el experimentador. El porcentaje de abejas que muestran el PER durante la presentación de CS se traza para cada ensayo.

3. Grabaciones cinemáticos

Movimientos antenales de una sola abeja aprovechada se graban con una cámara de vídeo digital con un lente macro adecuada (por ejemplo Basler A602f-2 equipado con TechSpec VZM 200, funciona a 50 fps a través de una conexión de cable de fuego). La cámara se coloca por encima del animal en una vista de arriba hacia abajo (Figura 1 A). En la Figura 1, la resolución espacial de las grabaciones es 0,02 mm / pixel.
Calibrar la cámara mediante la grabación de imágenes individuales de un tablero de ajedrez 10 x 10 mm con una longitud de arista de 1 mm a partir de diferentes orientaciones en el marco del objetivo de la cámara. La calibración se puede hacer con la caja de la cámara herramienta de calibración ¹⁶ Matlab.
Coloque una sola abeja fijo por debajo del objetivo de la cámara. Presentar el estímulo táctil, fijado a un micromanipulador, Para el animal. Proceder de la misma manera como se describe para el acondicionamiento táctil, y registrar el movimiento antenal mientras que la abeja se analizó el objeto. Es importante que toda la gama de trabajo antenal y el estímulo táctil son visibles. Las opciones de los patrones de estímulos probados y números de ensayo dependerá del diseño experimental.

4. Análisis de Datos

El cálculo de la imagen de fondo se realiza en Matlab. En primer lugar, el valor medio de escala de grises en el tiempo tiene que ser calculado para cada píxel. Los objetos estáticos, como la cabeza fija de la abeja y el estímulo táctil, constituirán el fondo de la imagen. Los objetos en movimiento, como las dos antenas, no será parte de los antecedentes.
Cada fotograma de la grabación de vídeo tiene que ser cargado de forma secuencial, y la diferencia entre la trama actual y la imagen de fondo tiene que ser calculado. El resultado de esta resta hace hincapié en las partes de la imagen que se están moviendo de marco a marco. Identificacióneally, las antenas de las abejas son las únicas áreas de valores distintos de cero (Figura 1 C).
Para el tratamiento posterior, las dos mayores áreas con valores de los píxeles que no son cero se supone que son las antenas. Para ambas antenas una máscara binaria se ha de generar para cada píxel que contiene un valor de 1, si el píxel pertenece a la antena y el valor 0 de lo contrario. Esta máscara sirve de base para la localización de las puntas antenales más tarde. Para obtener una máscara preliminar para toda la imagen gris del valor de cada píxel de la imagen de diferencia se compara con un umbral predefinido. Dado que nosotros nos encargamos de ruido a finales de este umbral se elige para ser bastante baja. La máscara preliminar entonces todavía lleva dos tipos de errores: En primer lugar, debido al ruido de la imagen pequeñas regiones son todavía parte de la máscara. En segundo lugar, las zonas que pertenecen a la antena podría no ser necesariamente completamente conectada. En estas últimas, se produce si el fondo tiene aproximadamente la misma luminiscencia como la antena. Para eliminar estos artefactos, estándaroperación de procesamiento de imagen morfológica se aplican, es decir, una combinación de erosión y dilatación imagen, confiando en las funciones estándar de Matlab imerode y imdilate respectivamente (ver ¹⁷ pp 158-205 para una explicación más detallada). Después de que el proceso de eliminación de ruido de las hipótesis antenas son todavía contenido dentro de la misma máscara. Por lo tanto, como paso siguiente la máscara binaria está agrupado por áreas disjuntas utilizando el estándar de Matlab función bwlabel (ver ¹⁷ pp 40-48 para más detalles sobre el algoritmo de segmentación de imágenes).
El número de píxeles por racimo se cuenta y los dos mayores grupos seleccionados. El centro de gravedad se calcula para distinguir entre la antena izquierda y derecha (Figura 1D).
La punta antenal para cada antena puede ser definido como el píxel en un grupo con el valor más alto en la dirección proximal a distal (véase la Figura 1D).