Tactile Conditioning und Bewegungsanalyse der antennalen Sampling Strategies In Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Samir Mujagić; Simon Michael Würth; Sven Hellbach; Volker Dürr

doi:10.3791/50179

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In diesem Artikel

Zusammenfassung
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Zusammenfassung

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Bedingung Honigbienen auf taktile Reize genutzt und die Einführung einer 2D-Motion-Capture-Technik zur Analyse der Kinematik feinskaligen antennalen Abtastmuster.

Zusammenfassung

Honigbienen (Apis mellifera L.) sind eusocial Insekten und bekannt für ihre komplexen Arbeitsteilung und assoziative Lernfähigkeit ^{1, 2} bekannt. Die Arbeitsbienen verbringen die erste Hälfte ihres Lebens in den dunklen Bienenstock, wo sie Pflege der Larven oder den Bau der regelmäßigen sechseckigen Waben für Lebensmittel (zB Pollen oder Nektar) und Brut ^3. Die Antennen sind außergewöhnlich multisensorische Fühlern und spielen eine entscheidende Rolle in verschiedenen taktilen vermittelten Aufgaben ^4, einschließlich hive Gebäude ⁵ und Mustererkennung ^6. Später im Leben hinterlässt jedes einzelne Biene den Stock, um nach Nahrung zu suchen. Dann eine Biene muss lernen, profitable Nahrungsquellen zu diskriminieren, zu speichern ihre Lage und kommunizieren sie ihre Nestgefährten ^7. Bienen verwenden verschiedene florale Signale wie Farben oder Gerüche ^{7, 8,} sondern auch taktile Hinweise aus der petal Oberfläche ⁹ bis multisensorische Erinnerungen an die Nahrungsquelle zu bilden. Unter Laborbedingungen conditions, können Bienen in einem appetitive Lernparadigma geschult werden, um taktile Objekteigenschaften, wie Kanten oder Rillen mit ihren Antennen ^{10, 11, 12, 13} unterscheiden. Diese Lernparadigma ist eng mit dem klassischen olfaktorischen Konditionierung des Rüssels Verlängerung Reaktion (PER) in angeschirrt Bienen ¹⁴ verbunden. Der Vorteil der taktilen Lernparadigma im Labor ist die Möglichkeit der Kombination Verhaltensexperimente auf das Lernen mit verschiedenen physiologischen Messungen, einschließlich der Analyse der antennalen Bewegungsmuster.

Protokoll

Ein. Vorbereitung der Bienen

Nektar oder Pollen Sammlerinnen im Feld entweder aus einer Saccharose Feeder oder direkt aus dem Flugloch gefangen, während der Rückkehr von einem Nahrungssuche Reise. Jede einzelne Biene wird in einen Glaskolben, der mit einem Schaum-Stopfen verschlossen ist und unmittelbar in das Labor für die weitere Handhabung getroffen eingefangen.
Im Labor werden die aufgenommenen Bienen kurz im Kühlschrank bei 4 ° C abgekühlt, bis sie erste Anzeichen von Immobilität zu zeigen.
Jede einzelne Biene immobilisiert ist in einem kleinen Metallrohres mit einem Klebestreifen zwischen Kopf und Thorax und über den Bauch befestigt. Es sollte darauf geachtet, dass der Rüssel und Antennen frei beweglich sind.
Malen Sie die Facettenaugen und Augenflecken der festen Biene mit weißer Farbe (zB lösemittelfreie Tipp-Ex) zur Vision zu verschließen.
Fügen Sie einen kleinen Tropfen geschmolzenen Wachs hinter dem Kopf der Biene um es dem Band zwischen Kopf und Thorax zu fixieren Kopfbewegungen während der Aufnahmen zu verhindern.
Markieren Sie jede einzelne Biene mit einer Nummer auf dem Band zur besseren Identifizierung und platzieren Sie den Schlauch mit dem festen Biene in einer feuchten Atmosphäre, um eine Dehydratation zu verhindern.
Führen Sie jede einzelne Biene für 5 sec mit Tröpfchen einer 30% Saccharose-Lösung mit einer Spritze vorgestellt und lassen Sie alle Bienen für 30 min erholen, bevor mit dem taktilen Klimaanlage Protokoll.

2. Tactile Conditioning

Bevor Klimaanlage hat jede einzelne Biene für die proboscis extension response (PER) auf 30% Saccharose Stimulus zu den Antennen getestet werden. Wodurch die Spitze des Rüssels muss eine virtuelle Linie zwischen der geöffneten Mandibeln überqueren. Entsorgen Sie alle Bienen, nicht mit einem KGV der Saccharose Reiz reagieren.
Für taktile Konditionierung mit einem Messing cube (zB 3 x 5 mm) mit einer glatten oder einer gravierten Muster, zB horizontale oder vertikale Nuten bilden ein Gitter mit 150 um Wellenlänge, als die konditionierten Reiz (CS). Foder die unbedingte Reiz (US) mit einem 30% Saccharose-Lösung (Haushaltszucker, in Wasser verdünnt).
Das Messing Würfel (CS) in einer Halterung an einem Mikromanipulator platziert (zB Märzhäuser MM33) eine genaue Positionierung während der Konditionierung zu gewährleisten. Die USA die Biene mit einer Spritze mit einer 30% Saccharose-Lösung gefüllt präsentiert.
Die Konditionierung besteht aus fünf Paarungen der taktilen Reiz (CS) und Saccharose-Lösung (US) mit einem inter-trial-Intervall (ITI) von 5 min. Legen Sie eine einzelne Biene vor dem Mikromanipulator mit dem montierten taktilen Reiz (CS). Positionieren des CS langsam, so dass die Oberfläche des taktilen Reiz parallel zum Kopf der Biene (Abbildung 1 A und B) ist. Der Abstand zwischen dem Tier und dem taktilen Objekt sollte im Bereich des antennalen Ausladung der getesteten Biene sein, dh die Biene der Lage sein sollten, um die taktilen Reiz scannen in einer komfortablen Position with beide Antennen. In dem Beispiel in 1 gezeigt, war der Abstand von 3 mm. Lassen Sie die Biene scannen die taktilen Reiz (CS) für 5 Sekunden. Nach der ersten 3 sec, präsentieren ein Tröpfchen der 30% Sucrose (US)-Lösung mit einer Spritze unter den Rüssel. Verwenden Sie die Spitze der Spritze vorsichtig heben die Rüssel. Saccharose Stimulation unter den Rüssel wird entlocken die unbedingte PER ^15. Lassen Sie die Biene, die Saccharose Belohnung lecken. Verwenden Sie eine Stoppuhr mit einem Alarmsignal, um die genauen Zeitintervallen während der Konditionierung zu halten.
Das konditionierte PER wird als Maß für den Lernerfolg einer Biene verwendet. Nach den ersten belohnt Paarungen starten Bienen zu CS Präsentation durch Erweiterung ihres Rüssels zu reagieren, was darauf hinweist, dass sie die bevorstehende Belohnung erwarten. Ein vollständig ausgefahrenen Rüssels jederzeit während der 3 sec Zeitfenster Tastreizes Aufmachung und Präsentation vor Saccharose beobachtet wird als positive Reaktion gewertet. Keine Antwort gezählt negativ. Die occurrence des PER ist vom Experimentator vermerkt. Der Prozentsatz der Bienen, die die PER während CS Präsentation ist für jeden Versuch aufgetragen.

3. Kinematische Recordings

Antennalen Bewegungen eines einzigen genutzt Biene mit einer digitalen Videokamera mit einem geeigneten Makro-Objektiv (zB Basler A602f-2 mit TECHSPEC VZM 200 ausgestattet, betrieben bei 50 fps über einen Firewire-Anschluss) aufgezeichnet. Die Kamera ist oberhalb des Tieres in einer Draufsicht (Figur 1 A) positioniert ist. In Abbildung 1 ist die räumliche Auflösung der Aufnahmen 0,02 mm / Pixel.
Kalibrieren Sie die Kamera durch die Aufnahme einzelner Bilder von einem 10 x 10 mm Schachbrett mit einer Kantenlänge von 1 mm aus verschiedenen Ausrichtungen unter dem Kamera-Objektiv. Die Kalibrierung kann mit der Kamera-Kalibrierung tool box Matlab ¹⁶ durchgeführt werden.
Legen Sie eine einzelne feste bee unterhalb der Kameralinse. Präsentieren des taktilen Reiz, der an einem Mikromanipulator, An das Tier. Gehen Sie in der gleichen Weise wie für die taktile Konditionierung, und notieren Sie die antennalen Bewegung, während die Biene ist das Scannen des Objekts. Es ist wichtig, dass die volle antennalen Arbeitsbereich und der Tastreizes sichtbar sind. Die Auswahl der Reizmuster getestet und Studie-Nummern hängen von der experimentellen Design.

4. Data Analysis

Die Berechnung der Bildhintergrund wird in Matlab getan. Erstens hat der Median Grauwert über die Zeit, um für jedes Pixel berechnet werden. Statische Objekte, wie die festen Kopf der Biene und der taktilen Reiz, bilden den Bildhintergrund. Bewegte Objekte, wie die beiden Antennen, werden nicht mehr in den Hintergrund.
Jeder Rahmen des aufgenommenen Videos hat, sequentiell geladen werden, und die Differenz zwischen dem aktuellen Frame und dem Bildhintergrund muss berechnet werden. Das Ergebnis dieser Subtraktion betont diejenigen Teile des Bildes, die von Rahmen zu Rahmen bewegen. Identifikationeally, sind die Antennen der Biene die einzigen Bereiche von Nicht-Null-Werte (Abbildung 1C).
Zur weiteren Verarbeitung werden die beiden größten Flächen mit von Null angenommen Pixelwerte die Antennen sein. Zu den beiden Antennen eine binäre Maske zu erzeugen, die für jedes Pixel einen Wert 1, falls das Pixel gehört zu der Antenne und den Wert 0 ansonsten. Diese Maske dient als Grundlage für die Lokalisierung der antennalen Tipps später. Um eine vorläufige Maske für das gesamte Bild zu gewinnen die grau-Wert jedes Pixels des Differenzbilds mit einem vordefinierten Schwellenwert verglichen. Da wir kümmern uns um Geräusche später diese Schwelle gewählt wird recht gering zu sein. Die vorläufige Maske dann noch trägt zwei Arten von Fehlern: Erstens wegen Bildrauschen kleinen Regionen sind immer noch Teil der Maske. Zweitens könnten Bereiche, die an der Antenne gehören nicht unbedingt in vollem Umfang angeschlossen werden. Letzteres geschieht meist, wenn der Hintergrund hat ungefähr die gleiche wie die Antenne Lumineszenz. Um diese Artefakte zu eliminieren, StandardBildverarbeitung morphologische Operation angewendet werden, dh eine Kombination von Bild Erosion und Dilatation, gestützt auf die Standard-Matlab-Funktionen imerode und imdilate sind (siehe ¹⁷ S. 158-205 für weitere Erläuterungen). Nach dem Verfahren werden die Antennen Rauschunterdrückung Hypothesen werden noch innerhalb des gleichen Maske enthalten. Daher in einem nächsten Schritt die binäre Maske für disjunkte Bereiche mit dem Standard Matlab-Funktion bwlabel (siehe ¹⁷ S. 40-48 für weitere Details auf das Bild Segmentierungsalgorithmus) gebündelt.
Die Anzahl von Pixeln pro Cluster wird gezählt und die beiden größten Clustern ausgewählt. Der Schwerpunkt berechnet wird, um zwischen dem linken und rechten Antenne (1D) zu unterscheiden.
Die antennalen Spitze für jede Antenne als das Pixel in einem Cluster mit dem höchsten Wert in proximal-zu-distal (siehe 1D) definiert werden.