Condizionata tattile e Analisi del Movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Samir Mujagić; Simon Michael Würth; Sven Hellbach; Volker Dürr

doi:10.3791/50179

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In questo articolo

Riepilogo
Abstract
Protocollo
Risultati
Discussione
Divulgazioni
Riconoscimenti
Materiali
Riferimenti
Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo protocollo si mostra come condizione sfruttata api a stimoli tattili e introdurre un 2D tecnica del motion capture per analizzare la cinematica di fine scala modello di campionamento antenne.

Abstract

Le api da miele (Apis mellifera L.) sono insetti eusociali e ben noti per la loro complessa divisione del lavoro e la capacità di apprendimento associativo ^{1, 2.} Le api operaie trascorrere la prima metà della loro vita all'interno dell'alveare buio, dove sono le larve allattamento o la costruzione della regolare pettini esagonale per il cibo (ad esempio polline o nettare) e la covata ^3. Le antenne sono straordinari antenne multisensoriali e svolgono un ruolo fondamentale in diversi compiti tattili mediate ^4, tra cui lo sviluppo alveare ⁵ e riconoscimento di pattern ^6. Più tardi nella vita, ogni singola ape lascia l'alveare alla ricerca di cibo. Poi un ape deve imparare a discriminare redditizie fonti di cibo, memorizzare la loro posizione, e comunicare ai propri compagni di nido ^7. Api utilizzano diversi segnali floreali come colori o odori ^{7, 8,} ma anche tattili dalla superficie petalo ⁹ per formare memorie multisensoriali della fonte di cibo. In laboratorio conditions, le api possono essere addestrati in un paradigma di apprendimento appetitivo di discriminare le caratteristiche degli oggetti tattili, come i bordi o scanalature con le loro antenne ^{10, 11, 12, 13.} Questo paradigma di apprendimento è strettamente legato al condizionamento classico olfattivo della risposta estensione proboscide (PER) in api bardati ^14. Il vantaggio del paradigma dell'apprendimento tattile in laboratorio è la possibilità di combinare esperimenti comportamentali sull'apprendimento con varie misurazioni fisiologiche, compresa l'analisi del modello di movimento antennale.

Protocollo

1. Preparazione delle api

Bottinatrici nettare o polline sono catturati in campo sia da un alimentatore di saccarosio o direttamente dall'ingresso alveare mentre tornava da un viaggio foraggiamento. Ogni singola ape viene catturata in una fiala di vetro che viene chiuso con un tappo di schiuma e presi immediatamente in laboratorio per ulteriori manipolazioni.
In laboratorio, le api catturate sono brevemente raffreddata in frigorifero a 4 ° C fino a quando i primi segni di immobilità.
Ogni singola ape immobilizzato è montato in un tubo metallico piccola con nastro adesivo tra la testa e il torace e sopra l'addome. Si deve prestare attenzione che la proboscide e le antenne sono liberamente mobili.
Dipingere gli occhi composti e ocelli delle api fisso con vernice bianca (ad esempio, esente da solventi, Tipp-Ex) da occludere visione.
Aggiungere una goccia di cera fusa dietro la testa delle api per fissarlo al nastro tra la testa e il torace per evitare movimenti della testa durante le registrazioni.
Contrassegnare ogni singola ape con un numero sul nastro per una migliore identificazione e posizionare il tubo con l'ape fisso in un ambiente umido per prevenire la disidratazione.
Alimentare ogni singola ape per 5 secondi con gocce di una soluzione di saccarosio al 30% presentato con una siringa e lasciare tutte le api recuperare per 30 min prima di iniziare con il protocollo condizionata tattile.

2. Condizionamento tattile

Prima del condizionamento, ogni singola ape deve essere testato per la risposta estensione proboscide (PER) a uno stimolo di saccarosio 30% applicata alle antenne. In tal modo la punta della proboscide deve attraversare una linea virtuale tra le mandibole aperte. Eliminare tutte le api che non rispondono con un PER allo stimolo saccarosio.
Per il condizionamento tattile usare un cubo ottone (es. 3 x 5 mm) con una superficie liscia o un motivo inciso, ad esempio, scanalature orizzontali o verticali che formano un reticolo con 150 micron lunghezza d'onda, come stimolo condizionato (CS). Fo lo stimolo incondizionato (US) utilizzare una soluzione di saccarosio al 30% (zucchero domestico, diluito in acqua).
Il cubo ottone (CS) è collocato in un supporto su un micromanipolatore (ad esempio, Märzhäuser MM33) per garantire l'esatto posizionamento durante la procedura di condizionamento. L'US è presentato al ape con una siringa riempita con una soluzione di saccarosio al 30%.
Il procedimento di condizionamento costituito da cinque coppie di stimolo tattile (CS) e soluzione di saccarosio (US), con un inter-trial intervallo (ITI) di 5 min. Posizionare una singola ape davanti al micromanipolatore con lo stimolo montato tattile (CS). Posizionare il CS lentamente, in modo tale che la superficie dello stimolo tattile è parallelo alla testa delle api (Figura 1 A e B). La distanza tra l'animale e l'oggetto tattile dovrebbe essere nell'intervallo del raggio antennale lavoro dell'ape testati, cioè l'ape dovrebbe essere in grado di eseguire la scansione dello stimolo tattile in una posizione comoda wesimo entrambe le antenne. Nell'esempio illustrato in figura 1, la distanza di 3 mm. Lasciate che l'ape scansione lo stimolo tattile (CS) per 5 sec. Dopo i primi 3 sec, presentano una gocciolina di saccarosio 30% (US) soluzione con una siringa sotto la proboscide. Usare la punta della siringa per sollevare delicatamente la proboscide. Stimolazione Saccarosio sotto le proboscide susciterà l'incondizionato PER ^15. Lasciare l'ape a leccare la ricompensa di saccarosio. Utilizzare un cronometro con un segnale di allarme per mantenere gli intervalli di tempo durante il condizionamento esatti.
Il PER condizionato viene usato come misura per il successo di apprendimento di un ape. Dopo gli accoppiamenti primo premiati, le api iniziano a rispondere alla presentazione CS per estensione dei loro proboscide, che indica che si aspettano la ricompensa futura. A proboscide massima estensione osservati in qualsiasi momento durante la finestra 3 sec Tempo di presentazione dello stimolo tattile e prima della presentazione saccarosio è segnato come una risposta positiva. Nessuna risposta è negativa contato. Il occurrence della PER Va osservato dallo sperimentatore. La percentuale di api che mostrano il PER in occasione della presentazione CS è tracciata per ogni prova.

3. Registrazioni cinematici

Movimenti antennale di un'ape sfruttata sono registrati con una videocamera digitale con un obiettivo macro adatto (per esempio Basler A602f-2 dotato di TechSpec VZM 200, operato a 50 fps tramite una connessione FireWire). La telecamera è posizionata sopra l'animale in una vista dall'alto in basso (Figura 1 A). In figura 1, la risoluzione spaziale delle registrazioni è di 0,02 mm / pixel.
Calibrare la fotocamera con la registrazione di immagini singole di una scacchiera 10 x 10 mm, con una lunghezza dello spigolo 1 mm da diversi orientamenti nel quadro dell'obiettivo della fotocamera. La calibrazione può essere fatto con la cassetta degli attrezzi di calibrazione fotocamera Matlab ^16.
Posizionare un un'ape fissa sotto la lente della fotocamera. Presentare lo stimolo tattile, fissato ad un micromanipolatore, Per l'animale. Procedere nello stesso modo descritto per il condizionamento tattile, e registrare il movimento antennale mentre l'ape viene scansione dell'oggetto. È importante che l'intera gamma antennale lavoro e lo stimolo tattile sono visibili. Le scelte dei modelli di stimolo testato e numeri di prova dipende dal disegno sperimentale.

4. Analisi dei dati

Il calcolo dello sfondo dell'immagine è fatto in Matlab. Primo, il valore mediano di grigio nel tempo deve essere calcolato per ciascun pixel. Oggetti statici, come la testa fissa delle api e lo stimolo tattile, costituirà l'immagine di sfondo. Oggetti in movimento, come due antenne, non sarà parte dello sfondo.
Ogni fotogramma del video registrato deve essere caricato in sequenza, e la differenza tra il frame corrente e lo sfondo dell'immagine deve essere calcolata. Il risultato di questa sottrazione enfatizza quelle parti dell'immagine che si sposta da frame a frame. Ideally, le antenne delle api sono le uniche aree di valori diversi da zero (Figura 1C).
Per l'ulteriore elaborazione, i due più grandi aree con valori diversi da zero pixel vengono considerati le antenne. Per entrambe le antenne di una maschera binaria deve essere generato contenenti, per ciascun pixel un valore 1, se il pixel appartiene alla antenna e valore 0 altrimenti. Questa maschera serve come base per localizzare le punte antennali tardi. Per ottenere una maschera preliminare per l'intera immagine del grigio-valore di ciascun pixel dell'immagine differenza viene confrontata con una soglia predefinita. Dal momento che ci prendiamo cura di rumore entro la soglia viene scelto per essere piuttosto basso. La maschera preliminare poi porta ancora due tipi di errori: in primo luogo, a causa del rumore di immagine piccole regioni sono ancora parte della maschera. In secondo luogo, le aree che appartengono alla antenna potrebbe non necessariamente essere completamente collegato. Quest'ultimo si verifica soprattutto se lo sfondo ha approssimativamente la stessa luminescenza come antenna. Per eliminare questi artefatti, standardoperazione di trattamento immagini morfologiche vengono applicate, ossia una combinazione di erosione e dilatazione dell'immagine, basandosi sulle funzioni standard Matlab imerode e imdilate rispettivamente (vedi ¹⁷ pp 158-205 per ulteriori spiegazioni). Dopo il processo di denoising le ipotesi antenne sono ancora contenute all'interno della maschera stessa. Quindi, come passo successivo la maschera binaria è in cluster per le aree disgiunte che utilizzano lo standard Matlab funzione bwlabel (vedi ¹⁷ pp 40-48 per ulteriori dettagli su l'algoritmo di segmentazione di immagini).
Il numero di pixel per cluster viene contato e le due maggiori gruppi sono selezionati. Il centro di gravità è calcolata a distinguere tra l'antenna sinistra e destra (Figura 1D).
La punta antennale per ciascuna antenna può essere definita come il pixel in un cluster con il valore massimo nella prossimale-distale direzione (vedi Figura 1D).