Se describen métodos para la microscopia de vídeo en vivo de células de Candida albicans Fagocitosis por los macrófagos. Estos métodos permiten la etapa específica de análisis de la migración de macrófagos, el reconocimiento, la inmersión y la maduración del fagosoma y revelan nuevos aspectos de la fagocitosis.
Aclaramiento fagocítica de los hongos patógenos y microorganismos en general, se puede considerar que consisten en cuatro etapas distintas: (i) la migración de los fagocitos al sitio donde se encuentran los patógenos; (ii) el reconocimiento de patógenos asociados a patrones moleculares (PAMP) a través del patrón receptores de reconocimiento (PRRS), (iii) entrampamiento de microorganismos unidos a la membrana de la célula fagocítica, y (iv) la transformación de las células sumido en fagosomas maduración y la digestión de la partícula ingerida. Los estudios que evalúan la fagocitosis en su totalidad son informativos 1, 2, 3, 4, 5, pero están limitados en que normalmente no romper el proceso en la migración, la inmersión y la maduración del fagosoma, que puede ser afectado diferencialmente. Además, tales estudios valorar la aceptación como un acontecimiento único, en lugar de como un proceso dinámico continuo. Recientemente hemos desarrollado avanzados células vivas tecnologías de imagen, y éstos se han combinado con el análisis genético funcional de amboscélulas patógenas y de acogida para crear una plataforma interdisciplinaria para el análisis de la función celular inmune innata y la patogénesis fúngica. Estos estudios han revelado aspectos novedosos de la fagocitosis de que sólo podían ser observados mediante el análisis sistemático temporal de las interacciones moleculares y celulares entre los fagocitos humanos y hongos patógenos y microorganismos infecciosos más general. Por ejemplo, hemos comenzado a definir lo siguiente: (a) los componentes de la superficie celular para cada etapa del proceso de reconocimiento, la inmersión y la muerte de las células fúngicas 1, 6, 7, 8, (b) la forma geometría de la superficie influye en la eficiencia de la absorción de macrófagos y la muerte de células de levadura y de hifas 7, y (c) cómo inmersión conduce a la alteración del ciclo celular y el comportamiento de los macrófagos 9, 10.
En contraste con las instantáneas individuales tiempo del punto, en vivo de células microscopía de vídeo permite una gran variedad de células huéspedes y patógenos a ser estudiado como cosecuencias continua que durante períodos de tiempo prolongados, proporcionando información espacial y temporal en una amplia gama de procesos dinámicos, como la migración celular, la replicación y el tráfico vesicular. A continuación se describe en detalle cómo preparar huésped y las células fúngicas, y llevar a cabo los experimentos de microscopía de vídeo. Estos métodos pueden proporcionar a un usuario-guía para futuros estudios con otros fagocitos y microorganismos.
1. C. albicans Crecimiento y Condiciones
2. C. albicans tinción utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC)
3. Preparación de la línea celular de macrófago de ratón J774.1
4. Live Video Microscopía fagocitosis celular Ensayo
Aquí nos muestran resultados representativos de C. captación albicans por una línea celular de macrófagos murinos J774.1 durante un 6 hr vivo de células experimento microscopía de vídeo. Figura 1 es un representante vivo de células película microscopía de vídeo, que muestra la fagocitosis de C. albicans por murinos J774.1 macrófagos. Vivo de células microscopía de vídeo permite la internalización de C. albicans para ser visualizado sin la necesidad de teñir Candida externa. Sin embargo, durante estos experimentos, C. albicans se tiñeron utilizando el colorante sensible al pH FITC (verde), que se inactivó durante la acidificación del fagosoma de macrófagos, y facilita la confirmación de que Candida ha sido interiorizado (Figura 1). Para visualizar la ayuda adicional de ingestión C. albicans, los macrófagos fueron teñidas utilizando el tinte fluorescente rojo LysoTracker rojo DND-99, que compartimientos manchas ácidas y sirve como un marcador no específico de la maduración del fagosoma.La Figura 2 es una imagen fija a partir de un experimento de vídeo en vivo de células microscopía e ilustra la variación en el número de C. albicans ingeridos por macrófagos individuales J774.1. En este experimento, 82% de los macrófagos J774.1 engullido al menos una C. albicans celular al final del ensayo de fagocitosis 6 hr. En la Figura 3, el número de internalizada C. células albicans por macrófago se informa. El número medio de C. albicans adoptadas hasta por macrófagos es 3,4, pero es interesante que los macrófagos pueden ingerir hasta 16 células fúngicas. Figura 4 es una secuencia de imágenes fijas de un representante en vivo de células experimento microscopía de vídeo que muestra un macrófago phagocytosing C. células albicans, crecimiento de hifas con la lisis de macrófagos y en última instancia los macrófagos. Figura 4 ilustra que la microscopía de vídeo permite el análisis de los eventos siguientes entrampamiento de las células diana, es decir los datos pueden ser generados para el killing de los macrófagos por C. albicans hifas en relación con el número y la morfogénesis de las células diana ingeridos, y cómo se relaciona con matanza macrófagos maduración del fagosoma que puede ser estudiado en tiempo real.
Figura 1. Vivo de células película microscopía video que muestra la fagocitosis de C. albicans por murinos J774.1 macrófagos. Los macrófagos son teñidos con el colorante fluorescente rojo LysoTracker rojo NOM-99 y C. albicans se tiñeron utilizando FITC (verde). Los macrófagos y C. albicans fueron co-cultivadas por un período de 6 horas a 37 ° C en CO 2-independiente completa medio. Las imágenes fueron capturadas a intervalos de 1 min durante 6 hr. Los macrófagos se puede ver el establecimiento de contacto célula-célula con C. albicans, que es seguido por la absorción de C. albicans en fagosomas de los macrófagos. Las flechas apuntan a C. albicans antes de la inmersión por J774.1 macrófagos. Este video también muestra que la fluorescencia FITC es QuEnched siguiente inmersión de C. albicans. Barra de escala, a 10 m. Haga clic aquí para ver la película .
Figura 2. Representante vivo de células microscopía de imagen fija de vídeo que muestra la variación en el número de C. albicans engullido por los macrófagos individuales. Los macrófagos (teñidas utilizando LysoTracker rojo DND-99) fueron co-cultivadas con FITC-manchado C. albicans (verde). Hay variación en el número de C. envuelto albicans (un número junto a una flecha indica el número de C. albicans envuelta), y en C. morfología albicans (levadura es decir versos hifa). Barra de escala, a 20 m.
Figura 3. Gráfico que muestra el número de C. albicans ingerido por J774.1 de macrófagos murinos al final de 6 ensayos de fagocitosis hr. Los datos representan 2 experimentos independientes. Un total de 100 macrófagos fueron contados a partir de 3 campos de cada experimento, dando un total de 600 macrófagos individuales.
Figura 4. Una serie de imágenes de un representante en vivo de células experimento microscopía de vídeo que muestra un macrófago (M) y C. albicans (C) antes de y durante el reconocimiento (A, B), y durante y después de la absorción (C, D). C. albicans hifas continúan creciendo dentro del macrófago (E, F), lo cual puede resultar en la lisis de los macrófagos (G). Otros macrófagos son reclutados en el sitio de ruptura y de intento de ingerir el liberado C. albicans (H). Los macrófagos son teñidos con el tinte rojo fluorescente LysoTracker rojo NOM-99 y C. albicans se tiñeron utilizando FITC (verde). Tenga en cuenta que la tinción FITC se inactivó después de C. albicans captación por los macrófagos J774.1 (C). Barra de escala, a 10 m.
Aquí, el método para el uso de microscopía de vídeo en vivo de células para estudiar la fagocitosis de macrófagos se describe. Microscopía de vídeo ofrece múltiples capas adicionales de información para el análisis. Una ventaja básica es que los datos de absorción se puede generar (de un solo experimento) para cualquier punto de tiempo durante todo el período de observación de 6 horas. Más importante aún, el método descrito permite el análisis diferencial de las etapas individuales de la fagocitosis. Hemos, por ejemplo, se muestra que los cambios en la absorción global de C. glicosilación albicans y mutantes morfogénesis por las líneas celulares de macrófagos y macrófagos primarios puede ser una consecuencia de los cambios en la migración de macrófagos hacia las células diana o la tasa de inmersión vez que el contacto célula-célula se establece 7.
Hay una serie de trampas para evitar la hora de realizar estos experimentos. En primer lugar, es muy importante para garantizar la estabilidad de las condiciones ambientales durante todo el procedimiento experimentalDuré. Esto se consigue mejor en una cámara ambiental que se ajusta a las condiciones experimentales durante varias horas antes de comenzar el experimento. La calidad de vídeo es altamente dependiente de módulos sofisticadas que utilizan láseres infrarrojos para mantener automáticamente la muestra z-posición independientemente de los cambios mecánicos o térmicos, eliminando así la necesidad de correcciones de enfoque manual.
Dada la amplia naturaleza de los experimentos, es importante limitar la exposición de luz láser y efectos asociados fotoblanqueo y fotoconversión, que puede ser minimizado mediante el empleo de marcadores altamente fluorescentes, que facilitan bajos tiempos de exposición. El protocolo de tinción FITC se describe aquí es rápido y confiable. Como FITC es un muy brillantes y estables veces mancha, exposición bajos son necesarios y esto la hace ideal para largos FITC time-lapse películas. Sin embargo, nosotros usamos una variedad de manchas de destino diferentes, incluyendo Calcofluor White y colorantes PKH así como organismos marcados.
La mayor parte de nuestro trabajo publicado se lleva a cabo utilizando un microscopio de campo amplio, pero la exposición puede reducirse aún más mediante el uso de un microscopio confocal de disco giratorio y en nuestras manos es esencial para la microscopía de time-lapse video 3D.
Durante este estudio, las imágenes se capturaron a intervalos de 1 min más de un ensayo de fagocitosis 6 hr. El intervalo entre las imágenes se puede ajustar dependiendo del proceso bajo investigación. Por ejemplo, el intervalo se puede disminuir la hora de investigar los procesos rápidos, como el tráfico vesicular. El intervalo de tiempo mínimo estará limitada por las especificaciones de microscopio y una cámara. Hay algunas consideraciones a tener en cuenta a la hora de ajustar tiempos. En primer lugar, la disminución del intervalo entre las instantáneas significa menos puntos se pueden obtener imágenes y el tamaño del archivo será aumentado considerablemente. Por el contrario, aumentando el intervalo de imagen demasiado hará perder la continuidad de la película.
Este enfoque se puede aplicaren principio, para estudiar otros patógenos y la absorción de morir las células huésped. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que la médula ósea de los macrófagos derivados de sialoadhesina deficientes en ratones muestran una unión reducida en gran medida y la fagocitosis de sialilada Campylobacter jejuni 8. Sin embargo, el tamaño solicitado es un determinante importante para la viabilidad, como el análisis de imagen se vuelve cada vez más difícil con una reducción en el tamaño de las células diana. Un sofisticado software de análisis de imagen es esencial para el rápido análisis de microscopía de vídeo, y esto debe ir acompañado de un apoyo adecuado bioinformática para facilitar la generación de algoritmos para estudiar la migración de las células individuales y poblaciones enteras de células 7. Vivo de células microscopía de vídeo en combinación con un sofisticado software de análisis de imágenes para el análisis minuto a minuto de la migración y las interacciones individuales C.albicans-macrófagos, ofrece una visión única de la complejidad de la C. albicans fagocitosis por macrophages. Existe un enorme potencial para expandir estos métodos para estudiar otros patógenos y los fagocitos (células dendríticas, neutrófilos) y el desarrollo de la microscopía de vídeo 3D con imagen interacciones célula-célula con mayor detalle o en más superficies fisiológicos tales como capas de células epiteliales y endoteliales. Esta técnica forma parte de la nueva generación de herramientas en el estudio de las interacciones huésped-patógeno y ayudará a generar información detallada espacial y temporal en una amplia gama de procesos dinámicos.
Los autores no tienen nada que revelar. NG es un beneficiario de las subvenciones sin restricciones para la investigación básica por Gilead Sciences. LE trabaja como consultor de GSK en el desarrollo de fármacos temprano.
LPE es un escocés Clinical Fellow Senior y agradece el apoyo de la Oficina de Jefe Científico (SCD/03). Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust del Proyecto Grant LPE (089.930). NARG fue financiado por el Wellcome Trust un programa de subvención (080.088) y una Beca de equipos (075.470) (para DeltaVision), y por una subvención del 7 º PM-2007-2013 (SALUD-F2-2010 a 260,338-ALLFUN). Nos gustaría dar las gracias a la Universidad de Aberdeen instalación de imágenes, en particular, Kevin MacKenzie, de apoyo y útiles consejos.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
Levadura nitrógeno base sin aminoácidos | Formedium | CYN0402 | |
NaOH | Sigma | S5881-500G | |
Sal hemisulfato de adenina | Sigma | A3159-25G | |
Agar técnico (n º 3) | Oxoid | LP0013 | |
D-glucosa | Sigma | G7021-1KG | |
SC-Ura deserción | Formedium | DSCK102 | |
FITC | Sigma | F7250-1G | |
De carbonato de sodio | BDH | 301215M | |
De bicarbonato de sodio | BDH | 102475W | |
PBS | Gibco | 18912-014 | |
DMEM | Lonza | BE12-614F | |
FCS | Life Technologies | 10106169 | |
Penicilina / estreptomicina | PAA | P11-010 | |
L-glutamina | Lonza | BE17-605E | |
LysoTracker Red NOM-99 | Invitrogen | L7528 | |
35 mm de vidrio platos | PAA | PAA12305160X |
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