Мы опишем методы для живых клеток видеомикроскопии Candida Albicans Фагоцитоза макрофагами. Эти методы позволяют стадии конкретного анализа миграции макрофагов, признание, поглощения и фагосомы созревания и выявить новые аспекты фагоцитоза.
Фагоцитарная оформления патогенных грибов и микроорганизмов в целом, можно считать, состоят из четырех этапов: (I) миграцию фагоцитов к месту, где возбудители находятся; (II) признание патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs) по шаблону Признание рецепторов (ОРР), (III), поглощение микроорганизмов связаны с фагоцитарной клеточной мембраны, и (IV), обработка охватившего созревания клеток в фагосомами и переваривания проглотить частицу. Исследования, оценки фагоцитоза в полном объеме являются информативными 1, 2, 3, 4, 5, но ограничены в том, что они обычно не нарушать процесс на миграцию, поглощения и фагосомы созревания, который может быть затронут дифференцированно. Кроме того, такие исследования оценки поглощения как единичное событие, а не как непрерывный динамический процесс. Недавно мы разработали передовые живых клеточных технологий обработки изображений, и объединили их с генетическими функционального анализа каквозбудителя и клетки-хозяева для создания междисциплинарной платформы для анализа врожденные иммунные функции клеток и грибковых патогенез. Эти исследования выявили новые аспекты фагоцитоза, что может наблюдаться только с помощью систематических временной анализ молекулярных и клеточных взаимодействий между человеческими фагоцитов и грибковых возбудителей инфекционных микроорганизмов и в целом. Например, мы начали определить следующие: (а) компоненты клеточной поверхности, необходимые для каждого этапа процесса признания, поглощения и уничтожения грибковых клеток 1, 6, 7, 8, (б) как геометрия поверхности влияет на эффективность поглощения макрофагами и убийстве дрожжи и клетки гиф 7, и (в) как поглощение приводит к изменению клеточного цикла и поведения макрофаги 9, 10.
В отличие от снимков одной точке времени, живых клеток видео микроскопия позволяет широкий спектр клеток-хозяев и патогенные для изучения в качестве соntinuous последовательности в течение продолжительного периода времени, обеспечивая пространственную и временную информацию о широком диапазоне динамических процессов, в том числе клеточной миграции, репликации и везикулярного торговлей людьми. Здесь мы подробно расскажем, как подготовить хозяина и грибковых клеток, а также провести эксперименты видео микроскопии. Эти методы могут предоставить пользователю руководство для будущих исследований с другими фагоцитов и микроорганизмов.
1. C. Albicans роста и условия
2. C. Albicans Окрашивание Использование изотиоцианат флуоресцеина (FITC)
3. Подготовка J774.1 Мыши линии клеток макрофагов
4. Онлайн-видео сотовый микроскопии Фагоцитоз анализа
Здесь мы показываем, представитель результаты C. Albicans поглощение мышиной линии клеток макрофагов J774.1 в течение 6 часов живой клетке эксперимент микроскопии видео. Рисунок 1 является представителем живых клеток видеомикроскопия фильм, показывающий фагоцитоз C. Albicans на мышиных макрофагов J774.1. Онлайн-клеточной видео микроскопия позволяет интернализации C. Albicans быть визуализированы без необходимости пятно внешних Candida. Тем не менее, в ходе этих экспериментов, C. Albicans была запятнана использованием рН-чувствительных красителей FITC (зеленый цвет), которая гасится при подкислении макрофагов фагосомы, а также облегчает подтверждение того, что Candida были усвоены (рис. 1). Для дальнейшей визуализации помощи попадает C. Albicans, макрофаги окрашивали красным флуоресцентным красителем красного LysoTracker DND-99, который окрашивает кислой отсеков и служит неспецифическим маркером фагосомы созревания.Рисунок 2 представляет собой неподвижное изображение из живых клеток эксперимент микроскопии видео и показано изменение числа C. Albicans попадает в организм отдельных J774.1 макрофагов. В этом эксперименте, 82% J774.1 макрофаги охвативший по крайней мере одно C. Albicans ячейки в конце 6 часов фагоцитоза анализа. На рисунке 3, число внутреннее C. Albicans клеток на макрофаг не сообщается. Среднее число C. Albicans рассмотрен в макрофагов составляет 3,4, но интересно, макрофаги могут поглощать до 16 грибковых клеток. Рисунок 4 представляет собой последовательность статических изображений с представителем живых клеток видеомикроскопия эксперимент показывает макрофагов phagocytosing C. Albicans клетки, гифы роста с макрофагами и в конечном итоге макрофагов лизиса. рисунке 4 показано, что видео-микроскопия позволяет проводить анализ событий после охвата клеток-мишеней, т.е. данные могут быть получены для киlling макрофагов К. Albicans гиф по отношению к количеству и морфогенез попадании клетки-мишени, и как макрофаг убийство относится к фагосомы созревания, которое может быть изучено в реальном времени.
Рисунок 1. Онлайн-клеточной микроскопии видео фильм, показывающий фагоцитоз C. Albicans на мышиных макрофагов J774.1. Макрофаги окрашивают с помощью красного флуоресцентного красителя красного LysoTracker DND-99, В и С. Albicans которые окрашивали FITC (зеленый). Макрофаги и C. Albicans были совместно культивировали в течение 6 часов при температуре 37 ° C в полном CO 2-независимой средой. Изображения были захвачены в 1 мин интервалом 6 часов. Макрофаги можно увидеть создании межклеточных контактов с C. Albicans, которая затем следуют поглощение C. Albicans в макрофаг фагосом. Стрелки указывают на C. Albicans до охвата по J774.1 макрофагов. Это видео также показывает, что флуоресценции FITC является QuEncHed следующие охвата С. Albicans. Шкала бар, 10 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов .
Рисунок 2. Представитель живых клеток видеомикроскопия еще изображение, показывающее изменение числа C.albicans охвачены отдельные макрофаги. Макрофаги (окрашенные использованием LysoTracker красной DND-99) были совместно культивировали с FITC-окрашенных C. Albicans (зеленый). Существует вариация числа C. Albicans охватившего (число рядом с стрелка указывает число C. Albicans охватившего), а в C. Albicans морфологии (т.е. стихи дрожжей гифы). Шкала бар, 20 мкм.
Рисунок 3. График, показывающий количество C. Albicans попадает в мышиных макрофагов J774.1 в конце 6 анализов час фагоцитоза. Данные представляют собой 2 независимых экспериментов. В общей сложности 100 макрофаги были подсчитаны от 3 поля из каждой эксперимент, дав в общей сложности 600 индивидуальных макрофагов.
Рисунок 4. Серии изображений с представителем живых клеток видеомикроскопия эксперимент показывает макрофагов (M) и С. Albicans (C) до и во время признания (A, B), а также во время и после поглощения (C, D). C. Albicans гиф продолжать расти в течение макрофагов (E, F), что может привести к лизиса макрофагов (G). Другие макрофаги привлекаются к месту разрыва и попытка глотать выпустила C. Albicans (H). Макрофаги окрашивают с помощью красного флуоресцентного красителя LysoTracкег красной DND-99, В и С. Albicans которые окрашивали FITC (зеленый). Обратите внимание, что FITC окрашивания гасится после C. Albicans поглощение J774.1 макрофагов (C). Шкала бар, 10 мкм.
Здесь метод для использования живых клеток видео микроскопии для изучения макрофагов фагоцитоз описано. Видео микроскопии предлагает несколько дополнительных слоев информации для анализа. Одним из основных преимуществ является то, что поглощение данные могут быть получены (от одного эксперимента) для любого момента времени протяжении 6 ч периода наблюдения. Более того, описанный способ позволяет дифференциального анализа отдельных стадий фагоцитоза. Мы, например, показали, что изменения в общем поглощение C. Albicans гликозилирования и морфогенеза мутантов макрофагов клеточных линий и первичных макрофагах может быть либо следствием изменений в миграции макрофагов к клеткам-мишеням или скорость поглощение раз межклеточных контактов установлено 7.
Есть ряд ошибок, чтобы избежать при проведении этих экспериментов. Во-первых, это очень важно обеспечить стабильные условия окружающей среды по всему экспериментальных процедурДюре. Это лучше всего достигается в экологических камеры, которая установлена в экспериментальных условиях за несколько часов до начала эксперимента. Качество видео очень сильно зависит от сложных модулей, которые используются инфракрасные лазеры для автоматического поддержания образца Z-позиция, независимо от механических или термических изменений устраняя таким образом необходимость корректировки ручной фокусировки.
Учитывая расширенные характер экспериментов, важно ограничить лазерного воздействия света и связанных фотообесцвечивания и фотопреобразования эффектов, которые могут быть сведены к минимуму за счет использования высоко флуоресцентные маркеры, которые способствуют низкой экспозиции. FITC протокол окрашивания описанный здесь, быстро и надежно. Как FITC является очень ярким и стабильным пятно, малое время экспозиции требуется, и это делает FITC идеально подходит для длительного покадровой фильмов. Тем не менее, мы обычно используют различные пятна цели, в том числе Calcofluor Белый и PKH красителей, а также отмеченных организмов.
Большинство наших опубликована работа проводится с использованием широкого поля микроскопа, но экспозиция может быть сведено к минимуму дальнейшие помощью вращающийся диск конфокальной микроскопии и в наших руках, это очень важно для покадровой микроскопии 3D видео.
Во время этого исследования, изображения были взяты в плен в 1 мин интервалами в течение 6 часов фагоцитоза анализа. Интервал между снимками может быть скорректирована в зависимости от исследуемого процесса. Например, интервал может быть уменьшен при исследовании быстротекущих процессов, таких как везикулярного торговлей людьми. Минимальный интервал времени будет ограничен микроскопа и камеры спецификаций. Есть некоторые соображения иметь в виду при настройке таймингов. Во-первых, уменьшение интервала между снимками будет означать меньшее количество точек может быть отображена и размер файла будет значительно увеличена. Напротив, увеличение изображения интервал слишком много сделает фильм потерять преемственности.
Этот подход может быть примененВ принципе для изучения других патогенов и поглощения умирают клетки хозяина. Например, недавно мы показали, что костного мозга, полученных от макрофагов sialoadhesin-дефицитных мышей проявляют значительно сократить обязательные и фагоцитоз сиалилированных Campylobacter jejuni 8. Тем не менее, размер цели является важным фактором для возможности, как анализ изображений становится все труднее с сокращением целевого размера ячейки. Сложное программное обеспечение анализа изображения имеет важное значение для экспресс-анализа микроскопии видео, и это должно сочетаться с соответствующей поддержкой биоинформатики для облегчения поколение алгоритмов для изучения миграции отдельных клеток и целых популяций клеток 7. Онлайн-клеточной видео микроскопии в сочетании со сложным программным обеспечением для анализа изображений в минуту за минутой анализ миграции и отдельных макрофагов C.albicans взаимодействия, предоставляет уникальную возможность заглянуть в сложности C. Albicans фагоцитоза macrophagES. Существует огромный потенциал для расширения этих методов для изучения других патогенов и фагоцитов (дендритных клеток, нейтрофилов), а также для разработки 3D-микроскопии видео изображения межклеточных взаимодействий более подробно или более физиологических поверхностей, таких как эпителиальных и эндотелиальных клеточных слоев. Этот метод является частью следующее поколение инструментов в исследовании хозяин-патоген взаимодействия и поможет генерировать подробные пространственные и временные информацию о широком диапазоне динамических процессов.
Авторы не имеют ничего раскрывать. NG является получателем гранта неограниченной поддержки для проведения фундаментальных исследований по Gilead Sciences. LE работает в качестве консультанта для GSK в начале разработки лекарств.
LPE является шотландский старший клинический научный сотрудник и признает поддержке Главного управления Scientist (SCD/03). Эта работа финансировалась Wellcome Trust гранта в LPE (089930). Narg финансировалось Wellcome Trust Программа грантов (080088) и оборудование Грант (075470) (для DeltaVision), и FP7-2007-2013 Грант (ЗДОРОВЬЕ-F2-2010-260338-Allfun). Мы хотели бы поблагодарить Университета Абердина средства визуализации, в частности, Кевин Маккензи, для поддержки и полезными советами.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Название реагента | Компания | Номер в каталоге | |
Дрожжи азотистого основания без аминокислот | Formedium | CYN0402 | |
NaOH | Сигма | S5881-500G | |
Аденин соль гемисульфата | Сигма | A3159-25G | |
Агар технические (№ 3) | Oxoid | LP0013 | |
D-глюкозы | Сигма | G7021-1кг | |
SC-Ура отсева | Formedium | DSCK102 | |
FITC | Сигма | F7250-1G | |
Карбонат натрия | BDH | 301215M | |
Бикарбонат натрия | BDH | 102475W | |
PBS | Gibco | 18912-014 | |
DMEM | Lonza | BE12-614F | |
FCS | Life Technologies | 10106169 | |
Пенициллина / стрептомицина | PAA | P11-010 | |
L-глютамин | Lonza | BE17-605e | |
LysoTracker Красной DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
35 мм стекло блюд | PAA | PAA12305160X |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены