Онлайн-клеточной видео микроскопия грибкового патогена Фагоцитоз

Резюме

Мы опишем методы для живых клеток видеомикроскопии Candida Albicans Фагоцитоза макрофагами. Эти методы позволяют стадии конкретного анализа миграции макрофагов, признание, поглощения и фагосомы созревания и выявить новые аспекты фагоцитоза.

Аннотация

Фагоцитарная оформления патогенных грибов и микроорганизмов в целом, можно считать, состоят из четырех этапов: (I) миграцию фагоцитов к месту, где возбудители находятся; (II) признание патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs) по шаблону Признание рецепторов (ОРР), (III), поглощение микроорганизмов связаны с фагоцитарной клеточной мембраны, и (IV), обработка охватившего созревания клеток в фагосомами и переваривания проглотить частицу. Исследования, оценки фагоцитоза в полном объеме являются информативными ^{1, 2, 3, 4, 5,} но ограничены в том, что они обычно не нарушать процесс на миграцию, поглощения и фагосомы созревания, который может быть затронут дифференцированно. Кроме того, такие исследования оценки поглощения как единичное событие, а не как непрерывный динамический процесс. Недавно мы разработали передовые живых клеточных технологий обработки изображений, и объединили их с генетическими функционального анализа каквозбудителя и клетки-хозяева для создания междисциплинарной платформы для анализа врожденные иммунные функции клеток и грибковых патогенез. Эти исследования выявили новые аспекты фагоцитоза, что может наблюдаться только с помощью систематических временной анализ молекулярных и клеточных взаимодействий между человеческими фагоцитов и грибковых возбудителей инфекционных микроорганизмов и в целом. Например, мы начали определить следующие: (а) компоненты клеточной поверхности, необходимые для каждого этапа процесса признания, поглощения и уничтожения грибковых клеток ^{1, 6, 7, 8,} (б) как геометрия поверхности влияет на эффективность поглощения макрофагами и убийстве дрожжи и клетки гиф ^7, и (в) как поглощение приводит к изменению клеточного цикла и поведения макрофаги ^{9, 10.}

В отличие от снимков одной точке времени, живых клеток видео микроскопия позволяет широкий спектр клеток-хозяев и патогенные для изучения в качестве соntinuous последовательности в течение продолжительного периода времени, обеспечивая пространственную и временную информацию о широком диапазоне динамических процессов, в том числе клеточной миграции, репликации и везикулярного торговлей людьми. Здесь мы подробно расскажем, как подготовить хозяина и грибковых клеток, а также провести эксперименты видео микроскопии. Эти методы могут предоставить пользователю руководство для будущих исследований с другими фагоцитов и микроорганизмов.

протокол

1. C. Albicans роста и условия

1. Подготовка SC-Ура агаром путем добавления 6,9 г дрожжевого азотистого основания без аминокислот, 1 мл 1 М NaOH, 10 мл 1% (вес / объем) аденин гемисульфата соли и 20 г технической агар (ранее подробно описан в ^11). Макияж объем до 900 мл дистиллированной H ₂ O. Автоклав, позволяющие агара, чтобы охладиться, но не настолько, чтобы укрепить, а затем добавить 50 мл стерильного 40% D-глюкозы и 50 мл стерильного 4% SC-Ура отсева в асептических условиях. Перемешать, разлить в чашки Петри и оставляют агаром остыть и затвердеть. Магазин агара при температуре 5 ° C до использования.
2. Подряд C. Albicans серотип штамма CAI4 + CIp10 из глицерина запасы хранились при -80 ° C на SC-Ура-агар пластины.
3. Инкубируйте пластины при температуре 30 ° C до колонии формы и хранят при температуре 5 ° C.
4. Культура одном C. Albicans колонии в 5 мл SC-Ура среды (рецепт, как в 1.1, но без технических агар) и инкубировать в течение ночи при 30° C, 200 оборотов в минуту для создания стационарной фазы C. Albicans.

2. C. Albicans Окрашивание Использование изотиоцианат флуоресцеина (FITC)

1. Добавить 10 мкл C. Albicans ночной культуры до 990 мкл PBS (рН 7,4) и выполнить клеток помощью гемоцитометра.
2. Для оказания помощи в визуализации C. Albicans во время фагоцитоза анализы, пятно 1 × 10 ⁸ C. Albicans использовании 1 мг / мл FITC в 0,05 М карбонат-бикарбонат буфером (рН 9,6) в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте.
3. Для удаления несвязанного FITC, мыть C. Albicans в 1 мл 1 х PBS, центрифуги при 3000 г в течение 5 мин, удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл 1 х PBS. Повторить 3 раза.
4. Ресуспендируют гранул на 1 × 10 ⁶ клеток / мкл в 1 х PBS.

3. Подготовка J774.1 Мыши линии клеток макрофагов

1. Поддерживать J774.1 макрофагов в 75 см ² тканиколбы с культурой в среде DMEM с добавлением 10% (V / V) эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 200 Ед / мл пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина при 37 ° C с 5% CO _2. Подготовка первичных макрофагах описано в другом месте подробнее ^{12, 13.}
2. Очистите J774.1 клеток из колбы культуры тканей и передачи в 50 мл трубки Falcon. Центрифуга при 600 х г в течение 5 минут, чтобы получить осадок клеток.
3. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл подогретого дополнен среде DMEM. Граф клеток с использованием гемоцитометра и пластины 1 × 10 ⁶ J774.1 макрофагов в 2 мл DMEM дополнить среду в 35 мм стекла на основе изображений блюдо. Выдержите в течение ночи при 37 ° C, 5% CO _2.
4. До изображений, заменить дополнить DMEM среде с 2 мл подогретого дополнен CO _{2-независимой} среды (с 10% (V / V) эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 200 Ед / мл пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) , содержащей 1 мкМ LysoTracker Красной DND-99.

4. Онлайн-видео сотовый микроскопии Фагоцитоз анализа

1. Выбор микроскопа будет зависеть от того, что доступно локально, но под микроскопом установки нужно будет включить перевернутой этапе, экологические камера нагревается до 37 ° C и возбуждение / излучение фильтры для выбранной пятна (FITC и TRITC).
2. Включите обогреватель микроскопе до эксперимента и обеспечивать достаточное время для экологического управления камерой нагреваться до 37 ° С. Время, затрачиваемое на камеру стабилизации температуры будут варьироваться для разных установок микроскопом.
3. Включите микроскоп и компьютер, и загружать изображения программное обеспечение. Установите изображений блюдо на столик микроскопа и настроить фокус, чтобы найти J774.1 макрофагов. Оптимизация появление TRITC и DIC изображения, регулируя процент проходящего света и времени экспозиции.
4. Выньте блюдо и добавить 3 × 10 ⁶ FITC-окрашенных C. Albicans к тОн блюдо. Запишите время, которое C. Albicans добавляют в блюдо. Вернуться блюдо на сцену и оптимизировать внешний вид FITC изображения, если это необходимо. Настройка пунктов списка, если требуется.
5. Начать изображения, когда все точки находятся в центре внимания и каналы оптимизированы. Захват FITC, TRITC и DIC изображение каждую минуту в течение 6 часов.

Результаты

Здесь мы показываем, представитель результаты C. Albicans поглощение мышиной линии клеток макрофагов J774.1 в течение 6 часов живой клетке эксперимент микроскопии видео. Рисунок 1 является представителем живых клеток видеомикроскопия фильм, показывающий фагоцитоз C. Albicans на мышиных макрофагов J774.1. Онлайн-клеточной видео микроскопия позволяет интернализации C. Albicans быть визуализированы без необходимости пятно внешних Candida. Тем не менее, в ходе этих экспериментов, C. Albicans была запятнана использованием рН-чувствительных красителей FITC (зеленый цвет), которая гасится при подкислении макрофагов фагосомы, а также облегчает подтверждение того, что Candida были усвоены (рис. 1). Для дальнейшей визуализации помощи попадает C. Albicans, макрофаги окрашивали красным флуоресцентным красителем красного LysoTracker DND-99, который окрашивает кислой отсеков и служит неспецифическим маркером фагосомы созревания.Рисунок 2 представляет собой неподвижное изображение из живых клеток эксперимент микроскопии видео и показано изменение числа C. Albicans попадает в организм отдельных J774.1 макрофагов. В этом эксперименте, 82% J774.1 макрофаги охвативший по крайней мере одно C. Albicans ячейки в конце 6 часов фагоцитоза анализа. На рисунке 3, число внутреннее C. Albicans клеток на макрофаг не сообщается. Среднее число C. Albicans рассмотрен в макрофагов составляет 3,4, но интересно, макрофаги могут поглощать до 16 грибковых клеток. Рисунок 4 представляет собой последовательность статических изображений с представителем живых клеток видеомикроскопия эксперимент показывает макрофагов phagocytosing C. Albicans клетки, гифы роста с макрофагами и в конечном итоге макрофагов лизиса. рисунке 4 показано, что видео-микроскопия позволяет проводить анализ событий после охвата клеток-мишеней, т.е. данные могут быть получены для киlling макрофагов К. Albicans гиф по отношению к количеству и морфогенез попадании клетки-мишени, и как макрофаг убийство относится к фагосомы созревания, которое может быть изучено в реальном времени.

Рисунок 1. Онлайн-клеточной микроскопии видео фильм, показывающий фагоцитоз C. Albicans на мышиных макрофагов J774.1. Макрофаги окрашивают с помощью красного флуоресцентного красителя красного LysoTracker DND-99, В и С. Albicans которые окрашивали FITC (зеленый). Макрофаги и C. Albicans были совместно культивировали в течение 6 часов при температуре 37 ° C в полном CO _{2-независимой} средой. Изображения были захвачены в 1 мин интервалом 6 часов. Макрофаги можно увидеть создании межклеточных контактов с C. Albicans, которая затем следуют поглощение C. Albicans в макрофаг фагосом. Стрелки указывают на C. Albicans до охвата по J774.1 макрофагов. Это видео также показывает, что флуоресценции FITC является QuEncHed следующие охвата С. Albicans. Шкала бар, 10 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Рисунок 2. Представитель живых клеток видеомикроскопия еще изображение, показывающее изменение числа C.albicans охвачены отдельные макрофаги. Макрофаги (окрашенные использованием LysoTracker красной DND-99) были совместно культивировали с FITC-окрашенных C. Albicans (зеленый). Существует вариация числа C. Albicans охватившего (число рядом с стрелка указывает число C. Albicans охватившего), а в C. Albicans морфологии (т.е. стихи дрожжей гифы). Шкала бар, 20 мкм.

Рисунок 3. График, показывающий количество C. Albicans попадает в мышиных макрофагов J774.1 в конце 6 анализов час фагоцитоза. Данные представляют собой 2 независимых экспериментов. В общей сложности 100 макрофаги были подсчитаны от 3 поля из каждой эксперимент, дав в общей сложности 600 индивидуальных макрофагов.

Рисунок 4. Серии изображений с представителем живых клеток видеомикроскопия эксперимент показывает макрофагов (M) и С. Albicans (C) до и во время признания (A, B), а также во время и после поглощения (C, D). C. Albicans гиф продолжать расти в течение макрофагов (E, F), что может привести к лизиса макрофагов (G). Другие макрофаги привлекаются к месту разрыва и попытка глотать выпустила C. Albicans (H). Макрофаги окрашивают с помощью красного флуоресцентного красителя LysoTracкег красной DND-99, В и С. Albicans которые окрашивали FITC (зеленый). Обратите внимание, что FITC окрашивания гасится после C. Albicans поглощение J774.1 макрофагов (C). Шкала бар, 10 мкм.

Обсуждение

Здесь метод для использования живых клеток видео микроскопии для изучения макрофагов фагоцитоз описано. Видео микроскопии предлагает несколько дополнительных слоев информации для анализа. Одним из основных преимуществ является то, что поглощение данные могут быть получены (от одного эксперимента) для любого момента времени протяжении 6 ч периода наблюдения. Более того, описанный способ позволяет дифференциального анализа отдельных стадий фагоцитоза. Мы, например, показали, что изменения в общем поглощение C. Albicans гликозилирования и морфогенеза мутантов макрофагов клеточных линий и первичных макрофагах может быть либо следствием изменений в миграции макрофагов к клеткам-мишеням или скорость поглощение раз межклеточных контактов установлено ^7.

Есть ряд ошибок, чтобы избежать при проведении этих экспериментов. Во-первых, это очень важно обеспечить стабильные условия окружающей среды по всему экспериментальных процедурДюре. Это лучше всего достигается в экологических камеры, которая установлена ​​в экспериментальных условиях за несколько часов до начала эксперимента. Качество видео очень сильно зависит от сложных модулей, которые используются инфракрасные лазеры для автоматического поддержания образца Z-позиция, независимо от механических или термических изменений устраняя таким образом необходимость корректировки ручной фокусировки.

Учитывая расширенные характер экспериментов, важно ограничить лазерного воздействия света и связанных фотообесцвечивания и фотопреобразования эффектов, которые могут быть сведены к минимуму за счет использования высоко флуоресцентные маркеры, которые способствуют низкой экспозиции. FITC протокол окрашивания описанный здесь, быстро и надежно. Как FITC является очень ярким и стабильным пятно, малое время экспозиции требуется, и это делает FITC идеально подходит для длительного покадровой фильмов. Тем не менее, мы обычно используют различные пятна цели, в том числе Calcofluor Белый и PKH красителей, а также отмеченных организмов.

Большинство наших опубликована работа проводится с использованием широкого поля микроскопа, но экспозиция может быть сведено к минимуму дальнейшие помощью вращающийся диск конфокальной микроскопии и в наших руках, это очень важно для покадровой микроскопии 3D видео.

Во время этого исследования, изображения были взяты в плен в 1 мин интервалами в течение 6 часов фагоцитоза анализа. Интервал между снимками может быть скорректирована в зависимости от исследуемого процесса. Например, интервал может быть уменьшен при исследовании быстротекущих процессов, таких как везикулярного торговлей людьми. Минимальный интервал времени будет ограничен микроскопа и камеры спецификаций. Есть некоторые соображения иметь в виду при настройке таймингов. Во-первых, уменьшение интервала между снимками будет означать меньшее количество точек может быть отображена и размер файла будет значительно увеличена. Напротив, увеличение изображения интервал слишком много сделает фильм потерять преемственности.

Этот подход может быть примененВ принципе для изучения других патогенов и поглощения умирают клетки хозяина. Например, недавно мы показали, что костного мозга, полученных от макрофагов sialoadhesin-дефицитных мышей проявляют значительно сократить обязательные и фагоцитоз сиалилированных Campylobacter jejuni ^8. Тем не менее, размер цели является важным фактором для возможности, как анализ изображений становится все труднее с сокращением целевого размера ячейки. Сложное программное обеспечение анализа изображения имеет важное значение для экспресс-анализа микроскопии видео, и это должно сочетаться с соответствующей поддержкой биоинформатики для облегчения поколение алгоритмов для изучения миграции отдельных клеток и целых популяций клеток ^7. Онлайн-клеточной видео микроскопии в сочетании со сложным программным обеспечением для анализа изображений в минуту за минутой анализ миграции и отдельных макрофагов C.albicans взаимодействия, предоставляет уникальную возможность заглянуть в сложности C. Albicans фагоцитоза macrophagES. Существует огромный потенциал для расширения этих методов для изучения других патогенов и фагоцитов (дендритных клеток, нейтрофилов), а также для разработки 3D-микроскопии видео изображения межклеточных взаимодействий более подробно или более физиологических поверхностей, таких как эпителиальных и эндотелиальных клеточных слоев. Этот метод является частью следующее поколение инструментов в исследовании хозяин-патоген взаимодействия и поможет генерировать подробные пространственные и временные информацию о широком диапазоне динамических процессов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Дрожжи азотистого основания без аминокислот	Formedium	CYN0402
NaOH	Сигма	S5881-500G
Аденин соль гемисульфата	Сигма	A3159-25G
Агар технические (№ 3)	Oxoid	LP0013
D-глюкозы	Сигма	G7021-1кг
SC-Ура отсева	Formedium	DSCK102
FITC	Сигма	F7250-1G
Карбонат натрия	BDH	301215M
Бикарбонат натрия	BDH	102475W
PBS	Gibco	18912-014
DMEM	Lonza	BE12-614F
FCS	Life Technologies	10106169
Пенициллина / стрептомицина	PAA	P11-010
L-глютамин	Lonza	BE17-605e
LysoTracker Красной DND-99	Invitrogen	L7528
35 мм стекло блюд	PAA	PAA12305160X