Nous décrivons des méthodes de microscopie vidéo cellules vivantes de Candida albicans par les macrophages. Ces méthodes permettent spécifiques au stade de l'analyse de la migration des macrophages, la reconnaissance, l'engloutissement et de la maturation du phagosome et de révéler de nouveaux aspects de la phagocytose.
Jeu phagocytaire des champignons pathogènes et les microorganismes, plus généralement, peut être considéré comme constitué de quatre étapes distinctes: (i) la migration des phagocytes au site où se trouvent des agents pathogènes, (ii) la reconnaissance du pathogène motifs moléculaires associés (PAMP) par modèle récepteurs de reconnaissance (PRR), (iii) l'engloutissement de micro-organismes liés à la membrane cellulaire des phagocytes, et (iv) le traitement des cellules englouti dans les phagosomes maturation et la digestion de la particule ingérée. Des études qui évaluent la phagocytose dans son intégralité sont informatifs 1, 2, 3, 4, 5, mais sont limitées en ce sens qu'elles ne sont normalement pas rompre le processus en migration, l'engloutissement et de la maturation du phagosome, qui peut être affectée différemment. En outre, ces études évaluer l'absorption comme un événement unique, plutôt que comme un processus continu et dynamique. Nous avons récemment mis au point des technologies d'imagerie cellules vivantes, et ont combiné ces derniers avec l'analyse génétique fonctionnelle des deuxcellules pathogènes et hôte de créer une plate-forme interdisciplinaire pour l'analyse de la fonction des cellules immunitaire inné et pathogénie des champignons. Ces études ont révélé de nouveaux aspects de la phagocytose qui ne peuvent être observés en utilisant systématiquement l'analyse temporelle des interactions moléculaires et cellulaires entre les phagocytes humains et des champignons pathogènes et les microorganismes infectieux en général. Par exemple, nous avons commencé à définir les éléments suivants: (a) les composants de la surface cellulaire nécessaire à chaque étape du processus de reconnaissance, l'engloutissement et de destruction des cellules fongiques 1, 6, 7, 8, (b) la façon dont la géométrie de surface influe sur l'efficacité de l'absorption des macrophages et le meurtre de la levure et des cellules des hyphes 7, et (c) la façon dont l'engloutissement entraîne une modification du cycle cellulaire et le comportement des macrophages 9, 10.
Contrairement aux simples clichés de points de temps, la vidéo-microscopie des cellules vivantes permet une grande variété de cellules hôtes et des agents pathogènes à étudier en tant que continuous séquences plus longues périodes de temps, fournissant des informations spatiales et temporelles sur un large éventail de processus dynamiques, y compris la migration cellulaire, la réplication et le trafic vésiculaire. Ici, nous décrivons en détail la façon de préparer hôte et les cellules fongiques, et de mener des expériences de microscopie vidéo. Ces méthodes peuvent fournir un guide utilisateur pour les études futures avec d'autres phagocytes et les microorganismes.
1. C. Croissance albicans et Conditions
2. C Coloration albicans Utilisation isothiocyanate de fluorescéine (FITC)
3. Préparation de la Ligne J774.1 macrophages de souris de cellules
4. Live Video cellulaire phagocytose Microscopie Assay
Ici, nous montrons des résultats représentatifs pour C. absorption albicans par une lignée cellulaire de macrophages murins J774.1 pendant 6 heures une cellule vivante expérience vidéo-microscopie. Figure 1 est un représentant des cellules vivantes film vidéo microscopie, montrant la phagocytose de C. albicans par murins J774.1 macrophages. Vidéo-microscopie des cellules vivantes permet l'internalisation de C. albicans à être visualisées sans avoir besoin de colorer Candida externe. Cependant, au cours de ces expériences, C. albicans a été coloré avec le colorant sensible au pH FITC (vert), qui est désactivé au cours de l'acidification du phagosome des macrophages, et facilite la confirmation que Candida a été internalisé (figure 1). Pour visualiser l'aide supplémentaire de ingéré C. albicans, les macrophages ont été colorées en utilisant la fluorescence rouge Lysotracker colorant rouge MDN-99, quels compartiments taches acides et sert de marqueur non spécifique de la maturation du phagosome.La figure 2 est une image fixe à partir d'une expérience de cellules vivantes vidéo microscopie et illustre la variation du nombre de C. albicans ingérés par les macrophages J774.1 individuels. Dans cette expérience, 82% des macrophages J774.1 englouti au moins un C. albicans cellule à la fin de l'essai 6 h phagocytose. Dans la figure 3, le nombre de intériorisée C. cellules albicans par des macrophages est signalée. Le nombre moyen de C. albicans repris par des macrophages est de 3,4, mais il est intéressant macrophages peuvent ingérer jusqu'à 16 cellules fongiques. Figure 4 est une séquence d'images fixes à partir d'un représentant des cellules vivantes expérience microscopie vidéo montrant un macrophage phagocytant C. cellules albicans, la croissance hyphe avec le macrophage et la lyse des macrophages en fin de compte. Figure 4 illustre le fait que la vidéo-microscopie permet l'analyse des événements qui ont suivi l'embrasement de cellules cibles, à savoir les données peuvent être générés pour le kiLLING des macrophages par C. albicans hyphes en ce qui concerne le nombre et la morphogenèse des cellules cibles ingérés, et le meurtre des macrophages se rapporte à la façon dont la maturation du phagosome qui peuvent être étudiés en temps réel.
Figure 1. Cellules vivantes film microscopie vidéo montrant la phagocytose de C. albicans par murins J774.1 macrophages. Les macrophages sont colorées par le rouge fluorescent Lysotracker colorant rouge MDN-99, et C. albicans sont colorées par FITC (vert). Les macrophages et C. albicans ont été co-cultivées pendant une période de 6 heures à 37 ° C dans le CO 2-complet indépendant milieu. Les images ont été capturées à des intervalles de 1 min pour 6 heures. Les macrophages peuvent être vus établir contact cellule-cellule avec C. albicans, qui est ensuite suivie par l'absorption de C. albicans dans les phagosomes des macrophages. Les flèches indiquent C. albicans avant l'engloutissement par J774.1 macrophages. Cette vidéo montre également que la fluorescence FITC est QuEnched engloutissement suivante de C. albicans. La barre d'échelle, 10 pm. Cliquez ici pour voir le film .
Figure 2. Variation microscopie vidéo représentative de cellule vivante image fixe représentant le nombre de C.albicans englouties par les macrophages individuels. Macrophages (teinté à l'aide Lysotracker rouge MDN-99) ont été co-cultivées avec FITC teinté C. albicans (vert). Il ya des variations dans le nombre de C. albicans englouti (un nombre à côté d'une flèche indique le nombre de C. albicans englouti), et C. morphologie albicans (levure soit versets hyphes). La barre d'échelle, 20 um.
Figure 3. Graphique montrant le nombre de C. albicans ingérée par J774.1 macrophage murin à la fin de 6 tests de phagocytose h. Les données représentent les 2 expériences indépendantes. Un total de 100 macrophages ont été comptés à partir de 3 champs de chaque expérience, ce qui donne un total de 600 macrophages individuels.
Figure 4. Une série d'images à partir d'un représentant des cellules vivantes expérience microscopie vidéo montrant un macrophage (M) et C. albicans (C) avant et pendant la reconnaissance (A, B), et pendant et après l'absorption (C, D). C. albicans hyphes continuer à croître dans le macrophage (E, F), ce qui peut entraîner la lyse des macrophages (G). D'autres macrophages sont recrutés au site de rupture et de tentative d'ingérer le libéré C. albicans (H). Les macrophages sont colorées par le rouge colorant fluorescent LysoTracker rouge MDN-99, et C. albicans sont colorées par FITC (vert). Noter que la coloration FITC est éteint après C. absorption albicans par J774.1 macrophages (C). La barre d'échelle, 10 pm.
Voici la méthode pour l'utilisation de la vidéo-microscopie des cellules vivantes pour étudier la phagocytose des macrophages est décrite. Vidéomicroscopie offre de multiples couches d'informations supplémentaires pour l'analyse. Un avantage essentiel est que les données d'absorption peut être générée (à partir d'une seule expérience) pour tout point dans le temps tout au long de la période de 6 heures d'observation. Plus important encore, la méthode décrite permet une analyse différentielle des différentes étapes de la phagocytose. Nous avons, par exemple, montré que les changements dans l'absorption globale de C. glycosylation albicans et des mutants de la morphogenèse par des lignées cellulaires de macrophages et les macrophages primaires peut être une conséquence de l'évolution de la migration des macrophages vers les cellules cibles ou le taux d'immersion fois contact cellule-cellule est établi 7.
Il ya un certain nombre d'écueils à éviter lors de la conduite de ces expériences. Tout d'abord, il est très important de s'assurer des conditions environnementales stables tout au long de la procédure expérimentaleDure. Le meilleur moyen est dans une chambre climatique qui est réglé pour les conditions expérimentales plusieurs heures avant de commencer l'expérience. La qualité vidéo est très dépendante des modules sophistiqués qui utilisent des lasers infrarouges pour maintenir automatiquement l'échantillon position z, indépendamment des changements mécaniques ou thermiques, éliminant ainsi la nécessité pour les corrections mise au point manuelle.
Compte tenu de la nature étendue de ces expériences, il est important de limiter l'exposition de lumière laser et effets associés photoblanchiment et photoconversion, qui peut être minimisé en utilisant des marqueurs fluorescents hautement, ce qui facilite les temps d'exposition faible. Le protocole de coloration FITC décrit ici est rapide et fiable. Comme FITC est un très lumineuses et stable tache, temps d'exposition faibles sont nécessaires, ce qui le rend idéal pour les longues FITC time-lapse films. Cependant, nous avons l'habitude d'utiliser une variété de taches cibles différentes, y compris calcofluor blanc et colorants PKH ainsi que les organismes marqués.
La plupart de notre travail publié est réalisé en utilisant un microscope à champ large, mais l'exposition peut être diminuée en utilisant un microscope confocal à disque rotatif et dans nos mains ce qui est essentiel pour la microscopie time-lapse vidéo 3D.
Au cours de cette étude, les images ont été capturées à des intervalles de 1 min sur un essai de phagocytose 6 heures. L'intervalle entre les images peut être ajustée en fonction du procédé objet de l'enquête. Par exemple, l'intervalle peut être diminué lorsque l'étude des processus rapides tels que le trafic vésiculaire. L'intervalle de temps minimum sera limitée par les spécifications du microscope et de la caméra. Il ya quelques considérations à prendre en compte lors de l'ajustement des synchronisations. Tout d'abord, diminuer l'intervalle entre les clichés se traduira par moins de points peuvent être visualisés et la taille du fichier sera considérablement augmentée. Au contraire, l'augmentation de l'intervalle image trop se faire le film perd la continuité.
Cette approche peut être appliquéeen principe, d'étudier d'autres agents pathogènes et l'absorption de la mort des cellules hôtes. Par exemple, nous avons récemment montré que les macrophages de la moelle osseuse provenant de souris déficientes en sialoadhésine présentent grandement réduit la liaison et la phagocytose des sialylé Campylobacter jejuni 8. Cependant, la taille de la cible est un déterminant important de la faisabilité, comme l'analyse d'images devient de plus en plus difficile avec une réduction de la taille de la cellule cible. Un logiciel sophistiqué d'analyse d'image est essentielle pour l'analyse vidéo microscopie rapide, ce qui devrait aller de pair avec un soutien approprié bioinformatique pour faciliter la génération d'algorithmes pour étudier la migration des cellules individuelles et des populations de cellules entières 7. Vidéo-microscopie des cellules vivantes en combinaison avec le logiciel d'analyse d'image sophistiqué pour l'analyse minute par minute de la migration des macrophages et individuels-C.albicans interactions, offre une perspective unique sur la complexité de C. phagocytose albicans par macrophages. Il ya un énorme potentiel pour élargir ces méthodes pour étudier d'autres agents pathogènes et les phagocytes (cellules dendritiques, les neutrophiles) et de développer la vidéo-microscopie 3D pour l'imagerie interactions cellule-cellule avec plus de détails ou sur des surfaces plus physiologiques tels que des couches de cellules épithéliales et endothéliales. Cette technique fait partie de la prochaine génération d'outils pour l'étude des interactions hôte-pathogène et permettra de générer des informations détaillées spatiale et temporelle sur un large éventail de processus dynamiques.
Les auteurs n'ont rien à révéler. NG est un bénéficiaire de la pension subvention sans restriction de la recherche fondamentale par Gilead Sciences. LE travaille comme consultant pour GSK dans le développement précoce de médicaments.
LPE est un écossais Senior Fellow clinique et reconnaît le soutien de l'Office scientifique en chef (SCD/03). Ce travail a été financé par le Wellcome Trust subvention de projet de LPE (089 930). NARG a été financé par une subvention du Wellcome Trust programme (080 088) et une subvention d'équipement (075 470) (pour DeltaVision), et par une subvention du 7e PC-2007-2013 (SANTÉ-F2-2010-260338-Allfun). Nous tenons à remercier l'Université d'Aberdeen imagerie installation, en particulier Kevin MacKenzie, pour l'appui et des conseils utiles.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | |
Base azotée de levure sans acides aminés | Formedium | CYN0402 | |
NaOH | Sigma | S5881-500G | |
Sel hémisulfate adénine | Sigma | A3159-25G | |
Agar technique (n ° 3) | Oxoid | LP0013 | |
D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
SC-Ura abandon | Formedium | DSCK102 | |
FITC | Sigma | F7250-1G | |
Carbonate de sodium | BDH | 301215M | |
Le bicarbonate de sodium | BDH | 102475W | |
PBS | Gibco | 18912-014 | |
DMEM | Lonza | BE12-614F | |
FCS | Life Technologies | 10106169 | |
Pénicilline / streptomycine | AAP | P11-010 | |
L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
Lysotracker Rouge MDN-99 | Invitrogen | L7528 | |
35 mm de verre plats | AAP | PAA12305160X |
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