Preparación de liposomas gigantes de la Imagen y Patch-Clamp Electrofisiología

Resumen

La reconstitución de proteínas de membrana funcionales en los liposomas gigantes de composición definida es un enfoque poderoso cuando se combina con la electrofisiología de patch-clamp. Sin embargo, la producción convencional de liposomas gigante puede ser incompatible con la estabilidad de la proteína. Se describen protocolos para producir liposomas gigantes de lípidos puros o pequeños liposomas que contienen canales iónicos.

Resumen

La reconstitución de los canales iónicos en las membranas de lípidos definidos químicamente para registro electrofisiológico ha sido una técnica poderosa para identificar y explorar la función de estas importantes proteínas. Sin embargo, las preparaciones clásicas, tales como bicapas planas, limitan las manipulaciones y experimentos que se pueden realizar en el canal reconstituido y su entorno de la membrana. La estructura más como una celda de liposomas gigantes permite experimentos de patch-clamp tradicionales sin sacrificar el control del medio ambiente de lípidos.

Electroformation es un medio eficiente para producir liposomas gigantes> 10 micras de diámetro que se basa en la aplicación de una tensión alterna a una, película de lípido ordenada delgada depositada sobre una superficie de electrodo. Sin embargo, ya que el protocolo clásico llama para los lípidos para ser depositados a partir de disolventes orgánicos, no es compatible con proteínas de la membrana menos robustos como canales de iones y debe ser modificado. Recientemente, protocols se han desarrollado para electroform liposomas gigantes de pequeños liposomas parcialmente deshidratadas, que hemos adaptado a los liposomas que contienen proteínas en nuestro laboratorio.

Presentamos aquí el fondo, equipo, técnicas, y las trampas de electroformation de liposomas gigantes de pequeñas dispersiones de liposomas. Comenzamos con el protocolo clásico, que debe ser dominado primero antes de intentar los protocolos más desafiantes que siguen. Se demuestra el proceso de deshidratación parcial controlada de pequeños liposomas usando equilibrio vapor con soluciones saturadas de sal. Por último, demostrar el propio proceso de electroformation. Vamos a describir un equipo simple, de bajo costo que se puede hacer en casa para producir liposomas de alta calidad, y describir la inspección visual de la preparación en cada etapa para garantizar los mejores resultados.

Introducción

Liposomas gigantes (a menudo llamado vesículas unilamelares gigantes, o Guvs) principalmente se han utilizado para estudiar la física y la química física de bicapas de lípidos, incluyendo los estudios de deformación bicapa, la coexistencia fase lateral ("balsas"), la fusión de membranas, etc ^1-4. Tienen una estructura groseramente similar a la célula: cáscara esférica de la membrana que rodea un interior acuoso que puede ser fácilmente hecho diferente que el tampón acuoso circundante. Ellos son, por definición, ≈ 1-100 micras de diámetro, por lo que se pueden obtener imágenes usando una variedad de enfoques de microscopía de luz. Pueden ser hechos tensa el uso de gradientes osmóticos o tensión aplicada mecánicamente, de modo que mientras que generalmente suave, sus propiedades pueden ser manipuladas para un fácil manejo. En particular, el control de la "rigidez" del liposoma hace que sea fácil para formar parches "liposomas adjuntos" o extirpado para electrofisiología. En el pasado, la reconstitución canal de iones se llevó a cabo en gran medida en los lípidos plana bilayers. Ahora, la capacidad para formar parches de liposomas gigantes y utilizar la considerable carcaj de herramientas desarrolladas para electrofisiología convencional (microscopía de fluorescencia, micropipeta de aspiración, la perfusión rápida y control de la temperatura, etc) hace que los liposomas gigantes cada vez más atractivo para los estudios de reconstitución de ^5,6.

Liposomas gigantes han hecho muchas estrategias. De hecho, los liposomas gigantes se forman espontáneamente por un proceso de hinchamiento cuando una película de lípido seca se rehidrata ^4,7,8. El deseo de preparar más rápidamente más grande, liposomas más uniformes llevó a los investigadores a otros enfoques, entre los que electroformation ^1,9. Electroformation también se basa en la hidratación de una película lipídica seca, pero acelera el proceso a través de la aplicación de un campo eléctrico oscilante a través de la película de lípido. El campo se aplica a través de dos electrodos, ya sea en alambres de platino o de indio-estaño-óxido (ITO) portaobjetos de vidrio recubiertos, separados por el agua otampón y en la que los lípidos se depositan. Al acelerar la hinchazón de los liposomas, se logra un mayor rendimiento de los liposomas más grandes. Por lo tanto, electroformation ha convertido en el método por defecto para producir liposomas gigantes ^4.

El mecanismo de electroformation no se entiende completamente, y la mayoría de los protocolos se han desarrollado empíricamente (por ejemplo, ^10,11). Sin embargo, podemos aprender un poco acerca de lo que puede esperar teniendo en cuenta la teoría y algunos resultados empíricos. La opinión generalizada es que electroformation se produce por la conducción del flujo electro-osmótico de amortiguación entre las bicapas lipídicas individuales apiladas en la película de lípidos depositados ^10,11. Acoplamiento electrostático a las fluctuaciones térmicas de la bicapa lipídica es probable que también involucró ^12. Estas hipótesis cualitativamente predicen los límites superiores de la frecuencia del campo eléctrico y la fuerza que se puede utilizar ^10,12. En particular, se prevé que las soluciones de alta conductividad ( es decir, soluciones salinas fisiológicas) reducen las fuerzas electrohidrodinámicos que pueden iniciar la electroformation liposoma ^12. Las tasas de flujo electroosmótico generalmente disminuyen con el aumento de la concentración de sal y se alcanzó su punto máximo con frecuencia a una frecuencia de oscilación del campo eléctrico (por ejemplo, si bien en una geometría diferente, Green et al. ^13). Por lo tanto, las intensidades de campo más altas y frecuencias más altas son razonables para soluciones de alta conductividad, dentro de los límites ^10.

Sin embargo, proteínas de la membrana es probable que sean incompatibles con el método habitual de depósito de lípidos en electrodos para el procedimiento electroswelling, a saber, en disolventes orgánicos que luego se evapora para dejar una película delgada de lípido. Hay dos rutas principales en torno a esta dificultad: para incorporar proteínas después de la formación de liposomas gigantes, o adaptar la forma en se depositan los lípidos. Nuestro enfoque se basa en otros ^5,11 para depositar los lípidos y reconstitucióntuido proteína de membrana, junto a una suspensión de pequeñas o grandes "proteoliposomas". Se describe el largo y más difícil proceso de producción de proteoliposomas de proteínas y lípidos purificados en otro lugar (Collins y Gordon, en revisión). A continuación se describe el protocolo en ausencia de cualquier proteína, pero es lo mismo cuando se incorpora proteínas; incluimos los resultados muestran que proteoliposomas contienen el canal iónico TRPV1 se pueden transformar en GUVs y utilizados para patch-clamp electrofisiología. En cualquier enfoque electroformation, la inspección visual de la muestra de lípidos durante el proceso de deposición de lípidos es crítica para el éxito.

Nuestro enfoque puede ser relevante más allá de la aplicación especializada para la reconstitución canal de iones. En el tiempo desde que nos desarrollamos este protocolo y, ahora, también se ha demostrado que la forma en que los lípidos se depositan en los electrodos de electroformation afecta a la heterogeneidad de composición de los GUVs resultantes. Baykal-Caglar et. al ¹⁴ mostraron que GUVs cuidadosamente formados a partir de liposomas deshidratados tenían un 2,5 veces menor variación en la temperatura de transición miscibilidad de GUVs formados a partir de mezclas de diferentes fosfolípidos y colesterol. Su trabajo indica que los lípidos, y especialmente el colesterol, puede precipitar de la mezcla de lípidos cuando se depositan a partir de disolventes orgánicos, lo que resulta en una variación espacial en la composición de la película de lípido depositada. Esto es especialmente importante para los estudios de comportamiento de fase de lípidos de membrana, pero también puede ser crítico para experimentos cuantitativos en función del canal iónico. Protocolo Baykal-Caglar et al. 'S es similar pero no idéntica a la nuestra, y se anima a los lectores a estudiar también.

Este protocolo (véase el resumen, la Figura 1) es uno de los muchos que se podría utilizar. En principio electroformation éxito depende de la mezcla de lípidos, la hidratación, la temperatura, otros solutos (especialmente iones), y dePor supuesto, el voltaje y la frecuencia utilizada en la formación. Como electroformation se entiende mejor, esperamos refinar nuestro protocolo más.

Por último, a menudo hay una pronunciada curva de aprendizaje en galvanoplastia liposomas gigantes. Sugerimos dominar el protocolo convencional (secciones 1 y 4, y de ser necesario, la Sección 5) antes de aprender a depositar los lípidos a partir de suspensiones de liposomas (Secciones 2-5).

Protocolo

1. La deposición de lípidos a partir de disolventes orgánicos: Protocolo Clásica

1. Eliminar los lípidos de almacenamiento a -20 ° C o -80 ° C; se calentó a TA Precaución:. Lípidos son extremadamente higroscópicos, y muchos son sensibles al oxígeno. Cubra lípidos en argón seco o nitrógeno gaseoso y en todos los pasos minimizar la exposición al aire.
2. Si es necesario, suspender los lípidos en cloroformo o ciclohexano en mg / ml 1-10, tenga en cuenta que las concentraciones indicadas del fabricante suelen nominal sólo PRECAUCIÓN: Use guantes y otros equipos de protección personal cuando se utilizan disolventes orgánicos.. Retire el PPE rápidamente si solvente se derramó sobre ellos, como la mayoría de los materiales están siendo permeable a estos disolventes y sólo proporcionan una protección temporal.
3. Limpie ambos lados de dos x 25 mm ITO portaobjetos de vidrio recubiertas con 37,5 etanol
4. Mezclar los lípidos para conseguir las proporciones molares deseadas. Por cada 1 cm ² de área de ITO se desliza a recubrir con el labioid, mix ~ 15-20 g de lípidos. Por ejemplo, si ambos diapositivas 25 x 37,5 mm iban a ser totalmente revestido, que se utilizaría normalmente 30 l de 10 mg / ml de mezcla de lípidos Nota:. Añadir 0,1% en moles Rojo Texas-DPPE para formación de imágenes fluorescentes, y ver a continuación para precauciones acerca colorantes fluorescentes.
5. Verifique que el lado recubierto ITO de las placas de vidrio se enfrenta por la medición de la resistencia de la superficie con un polímetro o multímetro.
6. Aspirar los lípidos en un resistente a los disolventes jeringa Precaución:. No hay colas o plástico, excepto PTFE, debe ponerse en contacto con el disolvente orgánico.
7. Con la aguja de la jeringa sin llegar a tocar la superficie de ITO, aplicar lentamente el lípido mover la aguja hacia atrás y adelante a través de la corredera. Cubra la superficie de la forma más uniforme, en busca de un "arco iris brillo" en la superficie del vidrio.
8. Coloque las diapositivas rápidamente bajo <1 Torr (1 mm Hg) de vacío durante 0,5-1 horas para eliminar cualquier traza de disolvente. Suelte vacío con gas inerte.
9. Aplique una junta de silicona, con uncapa fina de grasa de vacío de silicona en ambos lados. Deje al menos 5 mm de diapositivas descubierta expuesta en un extremo de la corredera.
10. Siga en la sección 4.

2. Preparación de liposomas pequeños para la deshidratación controlada

1. Preparar la mezcla de lípidos que en los pasos 1.1 a 1.4.
2. Secar los lípidos usando una corriente de gas argón o nitrógeno en un tubo de cultivo de 10-15 mm de diámetro. Para pequeñas cantidades de lípidos, ≤ 0,5 mg, la película resultante puede ser hidratado directamente después de colocarla bajo vacío durante 0,5-1 horas para eliminar el disolvente residual; continúe en el paso 2.5. Grandes cantidades de lípidos tienden a atrapar disolventes orgánicos en un gel espeso, incluso bajo vacío, y están mejor preparados por liofilización; consulte los pasos 2.3-4.
3. Suspender la película lipídica seca en ciclohexano, cubierta con argón y sellado con un tapón, colocar el tubo en un bloque frío y se congelan a -80 ° C durante 1 hora mínimo.
4. Coloque el bloque frío y la muestra de lípidos en un sistema de vacíocapaz de alcanzar los 100 mTorr. Aplicar un vacío, sino que va a "pararse" en alrededor de 1 Torr tan sublimes solventes libres. Una vez disolvente se elimina por completo (aproximadamente 1 hora) de vacío caerá por debajo de este nivel. Liberar el vacío con gas inerte y sellar el tubo o hidrato inmediatamente.
5. Mientras que los lípidos están bajo vacío, tampón de hidratación degas usando vacío y rociado ^15-17.
6. Hidratar los lípidos usando tampón desgasificado a una concentración final de 1-10 mg / ml. Permitir que los lípidos para hidratar lentamente. Después de 30 min-1 hora, remolino para romper los grumos que quedan. Espere un 0,5-1 horas más para permitir la hidratación completa. Utilice un osmoticant, tal como sorbitol o sacarosa hasta 200 mM, para prevenir la deshidratación completa en los pasos siguientes.
7. Prepare liposomas 100-200 nm de diámetro por extrusión. Ver protocolo de extrusión del fabricante para obtener más información. Tenga en cuenta que el buffer debe tener menos de ~ 25 mM fuerza iónica, o protocolos de voltaje electroformation especiales serán necesarias en la Sección 4.

3.La deposición de lípidos por deshidratación controlada de liposomas pequeños

1. Precaución: Nuestro protocolo requiere lípidos para ser colocados en equilibrio vapor con soluciones salinas saturadas para muchas horas. Recomendamos realizar el protocolo en una atmósfera de gas inerte, con una caja de guantes o recinto similar.
2. Precaución: Si la preparación de muestras que contienen proteínas, evitar la deshidratación completa. Hidratar la atmósfera en un lugar cerrado con un vaso de agua tibia, o un humidificador basado en ultrasonidos. Utilice un higrómetro para asegurarse de que existe al menos 30% de humedad relativa. Usa sorbitol o sacarosa en el pequeño tampón de liposoma como una precaución adicional para prevenir la deshidratación total.
3. Preparar una solución de sal saturada de humedad relativa apropiada. Humedad del objetivo depende de la osmolaridad de la preparación de vesículas. Para las preparaciones con osmolaridad fisiológica, utilice el 30-45% de humedad relativa, mientras que las preparaciones de vesículas de baja osmolaridad pueden ser adecuadamente deshidratados enequilibrio con 75-90% de humedad relativa (Véase también la Tabla 1).
4. Ponga la solución saturada de sal y el exceso de sal en un recipiente herméticamente sellable con un estante interior. Contenedores de alimentos comerciales para yogurt y granola funcionan muy bien. Vuelva a colocar el estante después del llenado, y asegúrese de que el fluido es de 5-10 mm por debajo de la plataforma.
5. Limpie portaobjetos recubiertos de ITO como en la Sección 1. Utilice el multímetro para determinar cuál es el lado conductor, y etiquetar el lado no conductor con el nombre de la muestra.
6. Engrase ligeramente ambos lados de la (grado USP VI) junta de silicona (s) con uno o múltiples agujeros.
7. Coloque el lado conductor desliza en el banco, y aplicar la junta de silicona (s) a cada diapositiva a la que se aplicará lípidos, asegurándose de que hay por lo menos 5 mm de diapositiva expuesta en un extremo a conectar al aparato electroformation. Alise la junta para asegurar un buen sellado.
8. Se diluye la preparación de vesículas en un tampón isotónico bajo contenido de sal a ~ 1-2 mg / ml. Nos parece que el aumento de concentrciones producen resultados pobres.
9. Aplique grasa a la diapositiva en gotas l 1-10. Las gotas más pequeñas generalmente producen mejores resultados.
10. Posicionar el cursor en la plataforma interior por encima de la solución saturada de sal y sellar el recipiente herméticamente. Dejar a temperatura ambiente durante 3 horas a O / N. El recipiente se puede colocar a 4 ° C, pero tenga en cuenta que para algunas sales, la humedad relativa depende fuertemente de la temperatura, y que el frío aumentará el tiempo de equilibración.
11. La película resultante puede tener un arco iris ligero brillo a él, pero en cualquier caso debe aparecer casi desecado. Soluciones de partida muy osmóticos pueden ser imposibles de secar completamente a una película de lípidos, lo que no afectará negativamente a los resultados.

4. Electroformation de liposomas gigantes

1. Películas de lípidos, especialmente los formados a partir de liposomas deshidratados, se desencajan fácilmente. Cuidadosamente hidrato de cada pocillo mediante la colocación de un G aguja de la jeringa 27 en el borde de la junta y aplicar lentamente tampón. Buffers puedeincluyen agua, ≤ 200 mM de sacarosa, ≤ 1 M sorbitol y ≤ 5 mM HEPES. Solución de sal de más de 10 mm puede requerir protocolos de voltaje electroformation alternos. Sobrellenado de cada junta y de ~ 10%.
2. Nota: una vez que los lípidos se hidratan, proceder rápidamente a través de los pasos restantes, ya que las películas de lípidos comienzan a exfoliar inmediatamente. Rendimiento y tamaño se maximizan si electroformation comienza puntualmente.
3. En un movimiento suave, aplique una segunda diapositiva, cara conductora ITO en, en la parte superior de la junta. Asegúrese de tener al menos 5 mm de voladizo fuera del área de empaque y frente a la primera proyección. Presione suavemente para asegurar un buen sellado.
4. Limpie los dos voladizos utilizan etanol y verificar que los lados que se enfrenta la junta son conductores con su multímetro.
5. La cámara se puede asegurar aún más con parafilm o ligeras pinzas de resorte de tensión si se desea.
6. Conectar la cámara de electroformation a una fuente de tensión, asegurando de aluminio o de cobre bares, "EMI Gasket espuma ", o cinta conductora-adhesivo a las superficies conductoras de las dos correderas. Utilizamos espuma junta EMI. Planes para una plantilla y la abrazadera se muestran en la Figura 5.
7. Compruebe que no hay cortocircuito eléctrico entre los contactos, y que los contactos se conectan adecuadamente a las superficies de ITO, usando el multímetro.
8. Se calienta la cámara de 10 ° C por encima de la temperatura de fusión más alta de cualquiera de los lípidos presentes, por ejemplo, para DPPC, calentar a 52 ° C, como mínimo, 10 ° C por encima de la temperatura de fusión de cadena de 42 ° C.
9. Para amortiguadores bajos en sal, aplique una onda sinusoidal 10 Hz, ~ 0.7 V _rms para cada hueco milímetros entre las dos superficies revestidas de ITO, de 60 a 90 min. Para buffers de sal, otros protocolos de tensión se deben utilizar (ver referencias).

5. Imágenes y solución de problemas

1. Imagen del liposoma utilizando un microscopio invertido equipado con un cubo filtro para rodamina o colorantes rojos de Texas. El liposoma debe ser esférica,predominantemente unilamelar por ojo, y libre de defectos tales como "cuerdas" que cuelgan del liposoma.
2. Si los liposomas son demasiado pequeños, utilizar menos lípidos.
3. Si hay muchos defectos o unos liposomas, esto puede ser debido a los lípidos de gel-fase. Considere la posibilidad de elevar la temperatura electroformation.
4. Si pocos o ningún liposomas gigantes formaron en absoluto de pequeños liposomas deshidratados, reducir la fuerza osmótica de la memoria intermedia de liposoma, o aumentar la fuerza osmótica de la memoria intermedia de electroformation. Una corriente de entrada de tampón en la solución tampón intersticial concentrada puede provocar la deslaminación de la película de lípido depositada.
5. Si el rendimiento de la vesícula, la calidad o el tamaño son pobres, y que incluyen sales o tampones de pH en los electroformation o liposoma buffers, tenga en cuenta los protocolos de voltaje electroformation alternativas. Por ejemplo, Pott, et al. ^11, recomendar un protocolo de tres etapas utilizando una onda sinusoidal de 500 Hz, el aumento de la tensión de 50-1,300 Vpp / m durante 30 minutos, manteniendo durante 90 min, lan la disminución de la frecuencia de 50 Hz en 30-60 min. Platino o titanio electrodos pueden ser necesarios en este caso, pero esto no alterarán sustancialmente el protocolo.

Resultados

En nuestros ejemplos, preparamos liposomas a partir de una mezcla de aproximadamente 55% en moles de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfocolina), 15% en moles POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfoserina , 30 moles% de colesterol, y 0,1% en moles marcados con Rojo Texas 1,2-dipalmitoil-sn-fosfoetanolamina (TxR-DPPE). Esta composición fue elegido como representante de aproximadamente el ganglio de la raíz dorsal lípidos ^18. Observamos que 15% en moles cargada lípidos ...

Discusión

Electroformation de liposomas gigantes se ha convertido en una técnica flexible, compatible con diversos lípidos, preparaciones y tampones. El control cuidadoso del proceso de deposición de lípidos es más crítico para el éxito. Hemos presentado herramientas simples para hacer deposición controlada de los lípidos de las pequeñas preparaciones de liposomas un proceso sencillo. La humedad relativa es crítica a la deshidratación adecuada de los liposomas iniciales, y el valor óptimo variará con la concentraci?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667