Giant Preparazione liposomi per Immagini e di patch-clamp elettrofisiologia

Riepilogo

Ricostituzione di proteine ​​di membrana funzionale in liposomi giganti di composizione definita è un approccio efficace quando combinato con elettrofisiologia patch-clamp. Tuttavia, la produzione convenzionale di liposomi gigante può essere incompatibile con la stabilità della proteina. Descriviamo i protocolli per la produzione di liposomi giganti di lipidi puri o piccoli liposomi contenenti canali ionici.

Abstract

La ricostituzione dei canali ionici in membrane lipidiche chimicamente definite per registrazione elettrofisiologica è una tecnica potente a individuare e studiare la funzione di queste proteine ​​importanti. Tuttavia, le preparazioni classiche, come doppi strati planari, limitano le manipolazioni ed esperimenti che possono essere eseguite sul canale ricostituito e il suo ambiente di membrana. La struttura più alveolare dei liposomi giganti permette esperimenti di patch-clamp tradizionali senza sacrificare controllo dell'ambiente lipidico.

Electroformation è un mezzo efficace per produrre liposomi giganti> 10 micron di diametro, che si basa sull'applicazione della tensione alternata ad un sottile film lipidico, ordinata depositato su una superficie dell'elettrodo. Tuttavia, poiché il protocollo classico prevede i lipidi da depositare da solventi organici, non è compatibile con meno robusti proteine ​​di membrana come canali ionici e deve essere modificata. Recentemente, protocols sono stati sviluppati per electroform liposomi giganti da parzialmente disidratati piccoli liposomi, che si sono adattati a liposomi contenenti proteine ​​nel nostro laboratorio.

Presentiamo qui lo sfondo, le attrezzature, le tecniche, e le insidie ​​di electroformation di liposomi giganti da piccole dispersioni liposomi. Cominciamo con il protocollo classico, che dovrebbe essere masterizzato prima di tentare i protocolli più impegnativi che seguono. Dimostriamo il processo di disidratazione parziale controllata di piccoli liposomi con equilibrio vapore con soluzioni saline sature. Infine, abbiamo dimostrato il processo di electroformation stesso. Noi descriveremo semplice attrezzatura, poco costoso che può essere fatto in casa per la produzione di liposomi di alta qualità, e descrivere l'ispezione visiva della preparazione in ogni fase per garantire i migliori risultati.

Introduzione

Liposomi giganti (spesso chiamati vescicole unilamellari giganti, o GUVs) sono stati principalmente utilizzati per lo studio della fisica e della chimica fisica di doppi strati lipidici, inclusi studi di deformazione doppio strato, la coesistenza di fase laterale ("zattere"), la fusione di membrana, ecc ^1-4. Hanno una cella grossolanamente struttura simile: guscio sferico di membrana che circonda un interno acquosa che può essere facilmente reso diverso rispetto al tampone acquoso circostante. Essi sono, per definizione, ≈ 1-100 micron di diametro, in modo che possano essere esposte utilizzando una varietà di approcci di microscopia ottica. Possono essere realizzati utilizzando gradienti osmotici tesa o dalla tensione applicata meccanicamente, in modo che mentre generalmente morbido, le loro proprietà possono essere manipolati per una facile movimentazione. In particolare, il controllo della "rigidità" del liposoma rende semplice per formare patches "liposoma iscritti" o asportato per elettrofisiologia. In passato, canale ionico ricostituzione è stata in gran parte svolta in planare lipidi bilayer. Ora, la capacità di formare le patch da liposomi giganti e utilizzare il notevole faretra di strumenti sviluppati per elettrofisiologia convenzionale (microscopia a fluorescenza, micropipetta aspirazione, rapido perfusione e il controllo della temperatura, ecc) rende liposomi giganti sempre più attraente per gli studi di ricostituzione ^5,6.

Liposomi giganti sono stati fatti da molte strategie. Infatti, liposomi giganti formano spontaneamente da un processo di rigonfiamento quando un film lipidico essiccato viene reidratato ^4,7,8. Il desiderio di preparare più rapidamente grandi, liposomi più uniformi ha portato i ricercatori ad altri approcci, primo fra tutti electroformation ^1,9. Electroformation basa anche su idratazione di un film lipidico essiccata, ma accelera il processo attraverso l'applicazione di un campo elettrico oscillante attraverso il film lipidico. Il campo viene applicato tramite due elettrodi, sia fili di platino o di indio-stagno-Oxide (ITO) vetrini rivestiti, separati da acqua otampone e su cui i lipidi sono depositati. Accelerando il gonfiore di liposomi, si raggiunge una maggiore resa di liposomi più grandi. Così, electroformation è diventato il metodo predefinito per produrre liposomi giganti ^4.

Il meccanismo di electroformation non è pienamente compreso, e la maggior parte dei protocolli sono sviluppati empiricamente (es. ^10,11). Tuttavia, siamo in grado di imparare un po 'su cosa aspettarsi considerando la teoria e alcuni risultati empirici. E 'opinione diffusa che electroformation avviene guidando il flusso elettro-osmotico di cuscinetto tra i singoli doppi strati lipidici accatastati nel film lipidico depositato ^10,11. Accoppiamento elettrostatico a fluttuazioni termiche dei doppi strati lipidici è probabilmente coinvolto anche ^12. Queste ipotesi qualitativamente predicono limiti superiori per la frequenza di campo elettrico e forza che può essere utilizzato ^10,12. In particolare, si prevede che le soluzioni ad alta conduttività ( cioè soluzioni saline fisiologiche) riducono le forze electrohydrodynamic che può avviare la electroformation liposomi ^12. Portate elettroosmotico generalmente diminuiscono all'aumentare della concentrazione di sale e sono spesso alzato a qualche campo elettrico frequenza di oscillazione (es sebbene in una diversa geometria, Green et al. ^13). Così, più elevate intensità di campo e frequenze più alte sono ragionevoli per le soluzioni ad alta conduttività, entro i limiti di ^10.

Tuttavia, proteine ​​di membrana sono suscettibili di essere incompatibile con il solito metodo di deposizione lipidi sul elettrodi per la procedura electroswelling, ossia in solventi organici che vengono poi evaporato per lasciare un sottile film lipidico. Ci sono due principali sentieri intorno a questa difficoltà: per incorporare le proteine ​​dopo la formazione di liposomi giganti, o di adattarsi come i lipidi si depositano. Il nostro approccio si basa su altri ^5,11 per depositare i lipidi e ricostituito proteina di membrana insieme da una sospensione di piccole o grandi "proteoliposomi". Descriviamo il processo lungo e più impegnativo di produrre proteoliposomi da purificata proteine ​​e lipidi altrove (Collins e Gordon, in revisione). Qui si descrive il protocollo, in assenza di qualsiasi proteina, ma è la stessa quando la proteina è compresa; includiamo risultati mostrano che proteoliposomi contenenti il ​​canale ionico TRPV1 può essere trasformato in GUVs e utilizzati per patch-clamp elettrofisiologia. In qualsiasi approccio electroformation, ispezione visiva del campione lipidi durante il processo di deposizione di lipidi è fondamentale per il successo.

Il nostro approccio può essere pertinente al di là della domanda specializzata di canale ionico ricostituzione. Nel tempo da quando abbiamo sviluppato questo protocollo e ora, è stato anche dimostrato come il modo in cui i lipidi sono depositati su elettrodi per electroformation colpisce l'eterogeneità composizionale dei GUVs risultanti. BayKal-Caglar et al. ¹⁴ hanno mostrato che GUVs formate da liposomi attentamente disidratate avevano 2,5 volte più piccola variazione nella temperatura di transizione di miscibilità GUVs formati da miscele di vari fosfolipidi e colesterolo. Il loro lavoro indica che i lipidi, e soprattutto il colesterolo, possono precipitare dalla miscela lipidica quando depositati da solventi organici, con conseguente grande variazione spaziale nella composizione del film lipidico depositato. Questo è particolarmente importante per gli studi del comportamento di fase membrana lipidica, ma può anche essere fondamentale per esperimenti quantitativi sulla funzione del canale ionico. Protocollo Baykal-Caglar et al s '.' Simile ma non identico al nostro, ed i lettori sono incoraggiati a studiare pure.

Questo protocollo (vedere la panoramica, la Figura 1) è uno dei tanti che potrebbero essere utilizzati. In linea di principio electroformation successo dipende dalla miscela lipidica, idratazione, temperatura, altri soluti (in particolare ioni), e diNaturalmente la tensione e la frequenza utilizzata in formazione. Come electroformation diventa meglio compresa, ci aspettiamo di affinare il nostro protocollo di più.

Infine, vi è spesso una ripida curva di apprendimento in elettroformatura liposomi giganti. Suggeriamo la padronanza del protocollo convenzionale (sezioni 1 e 4, e, se necessario, la sezione 5) prima di imparare a depositare i lipidi dalle sospensioni liposomiali (sezioni 2-5).

Protocollo

1. Deposizione di lipidi da solventi organici: Protocollo Classica

1. Rimuovere i lipidi dalla conservazione a -20 ° C o -80 ° C; caldo per RT. Attenzione: i lipidi sono estremamente igroscopico, e molti sono sensibili all'ossigeno. Coprire lipidi nella secca Argon o Azoto e in tutte le fasi minimizzare l'esposizione all'aria.
2. Se necessario, sospendere i lipidi in cloroformio o cicloesano a mg / ml 1-10; notare che le concentrazioni indicate dal costruttore sono in genere solo nominale ATTENZIONE: Indossare guanti ed altri dispositivi di protezione individuale appropriati quando si utilizzano solventi organici.. Rimuovere il PPE rapidamente se solvente viene versato su di loro, come la maggior parte dei materiali sono ancora permeabili a questi solventi e forniscono solo una protezione temporanea.
3. Pulire entrambi i lati di due 25 x 37,5 millimetri ITO vetrini rivestiti con etanolo
4. Mescolare i lipidi per ottenere i desiderati rapporti molari. Per ogni 1 cm ² di area di ITO diapositive essere rivestita con labbroid, mix ~ 15-20 mg di lipidi. Ad esempio, se entrambi 25 x 37,5 millimetri diapositive dovevano essere completamente rivestito, saremmo di solito utilizziamo 30 ml di 10 mg / ml di miscela lipidica. Nota: aggiungere 0.1 mol% Texas Red-PDPE per l'imaging a fluorescenza, e vedi sotto per avvertenze circa coloranti fluorescenti.
5. Verificare che il lato rivestito ITO dei vetrini è rivolto verso l'alto, misurando la resistenza di superficie con un ohmetro o multimetro.
6. Aspirare i lipidi in una resistente ai solventi siringa. Attenzione: Nessun colle o plastica, diversi da PTFE, devono contattare il solvente organico.
7. Con l'ago della siringa non proprio toccare la superficie ITO, applicare lentamente il lipide muovendo l'ago avanti e indietro attraverso la diapositiva. Coprire la superficie il più uniformemente, in cerca di un "arcobaleno lucentezza" sulla superficie del vetro.
8. Porre i vetrini rapidamente sotto <1 Torr (1 mmHg) vuoto per 0,5-1 ore per eliminare ogni traccia di solvente. Rilascio del vuoto con gas inerte.
9. Applicare una guarnizione in silicone, con unsottile strato di silicone vuoto grasso su entrambi i lati. Lasciare almeno 5 mm di diapositiva non coperto esposto ad una estremità della slitta.
10. Procedere immediatamente alla Sezione 4.

2. Piccolo Preparazione liposomi per disidratazione controllata

1. Preparare la miscela di lipidi, come nei passi da 1.1 a 1.4.
2. Asciugare i lipidi utilizzando un flusso di gas argon o azoto in una provetta di coltura diametro 10-15 mm. Per piccole quantità di lipidi, ≤ 0,5 mg, la pellicola risultante può essere idratato direttamente dopo la messa sotto vuoto per 0,5-1 ore per rimuovere il solvente residuo; procedere al punto 2.5. Quantità maggiori di lipidi tendono ad intrappolare solventi organici in un gel denso, anche sotto vuoto, e sono più preparati mediante liofilizzazione; vedi procedura 2.3-4.
3. Sospendere il film lipidico essiccato in cicloesano, coprire con Argon e sigillare con un tappo, porre la provetta in un blocco freddo e congelare a -80 ° C per 1 ora minimo.
4. Posizionare il blocco freddo e lipidi campione in un sistema di vuotoin grado di raggiungere i 100 mTorr. Applicare il vuoto, lo farà "stallo" a circa 1 Torr come sublima solvente off. Una volta solvente viene completamente rimosso (~ 1 ora) vuoto scenderà sotto questo livello. Rilascio del vuoto con gas inerte e sigillare il tubo o idratare immediatamente.
5. Mentre i lipidi sono sotto vuoto, buffer di idratazione Degas usando il vuoto e sparge ^15-17.
6. Idratare la lipidi utilizzando tampone degasato in finale concentrazione 1-10 mg / ml. Lasciare i lipidi per idratare lentamente. Dopo 30 minuti-1 ora, vortice di rompere grumi rimasti. Attendere un ulteriore 0,5-1 ore per consentire la completa idratazione. Utilizzare un osmoticant, come il sorbitolo o saccarosio fino a 200 mM, per prevenire la disidratazione completa in passi di seguito.
7. Preparare liposomi 100-200 nm di diametro per estrusione. Vedi protocollo di estrusione del produttore per i dettagli. Si noti che il buffer deve avere meno di 25 ~ forza ionica mM, o protocolli di tensione electroformation speciali saranno necessari nella sezione 4.

3.Deposizione di lipidi da disidratazione controllata di liposomi

1. Attenzione: Il nostro protocollo richiede lipidi da collocare in equilibrio vapore con soluzioni saline sature per molte ore. Si consiglia vivamente di eseguire il protocollo in atmosfera di gas inerte, con un vano portaoggetti o contenitore simile.
2. Attenzione: se la preparazione di campioni contenenti proteine, evitare di completa disidratazione. Idratare l'atmosfera in un vano chiuso con un bicchiere di acqua calda o di un umidificatore a base sonicator. Utilizzare un igrometro per assicurarsi che ci sia almeno il 30% di umidità relativa. Utilizzare sorbitolo o saccarosio nel piccolo buffer di liposomi come ulteriore precauzione per prevenire la disidratazione totale.
3. Preparare una soluzione satura di adeguata umidità relativa. Obiettivo umidità dipende dalla osmolarità della preparazione delle vescicole. Per i preparati con osmolarità fisiologica, utilizzare 30-45% di umidità relativa, mentre i preparativi delle vescicole bassa osmolarità possono essere adeguatamente disidratato inequilibrio con il 75-90% di umidità relativa (vedi anche tabella 1).
4. Mettere la soluzione satura di sale e il sale in eccesso in un contenitore ermeticamente sigillabile con un ripiano interno. Contenitori per alimenti commerciali per lo yogurt e muesli funzionare molto bene. Sostituire lo scaffale dopo il riempimento, e assicurarsi fluido è 5-10 mm al di sotto della mensola.
5. Pulire vetrini rivestiti di ITO come nella sezione 1. Utilizzare il multimetro per determinare quale lato è conduttivo, ed etichettare il lato non conduttivo con il nome del campione.
6. Ungere leggermente entrambi i lati del silicone (USP VI) guarnizione (s) con uno o più fori.
7. Posizionare il lato conduttivo diapositive sulla panca, e applicare la guarnizione (s) per ciascuna diapositiva a cui verrà applicato lipidico, assicurandosi che vi sia almeno 5 mm di diapositiva esposta ad una estremità per collegare all'apparato electroformation. Smooth la guarnizione per garantire una buona tenuta.
8. Diluire la preparazione vescicola in un buffer isosmotic basso contenuto di sale per ~ 1-2 mg / ml. Troviamo che Concentrazione superiorezioni producono scarsi risultati.
9. Applicare lipidi alla diapositiva in gocce microlitri 1-10. Gocce più piccole producono generalmente risultati migliori.
10. Posizionare il cursore sul ripiano interno sopra la soluzione satura di sale e sigillare il contenitore ermeticamente. Lasciare a temperatura ambiente per 3 ore di O / N. Il contenitore può essere posto a 4 ° C, ma si noti che per alcuni sali, l'umidità relativa dipende fortemente dalla temperatura, e che freddo aumenterà tempo di equilibrazione.
11. Il film risultante può avere una leggera lucentezza arcobaleno ad esso, ma in ogni caso dovrebbe apparire quasi essiccato. Soluzioni a partire altamente osmotici possono essere impossibile asciugare completamente per un film lipidico, questo non pregiudicherà i risultati.

4. Electroformation di liposomi giganti

1. Film lipidici, specialmente quelli formati da liposomi vengono disidratati, si spostano facilmente. Cautela idrato ogni pozzetto inserendo un ago di siringa 27 G sul bordo della guarnizione e applicando lentamente buffer. Buffer possonocomprendono acqua, ≤ 200 mM saccarosio, ≤ 1 M sorbitolo e ≤ 5 HEPES. Più di 10 mM di soluzione salina può richiedere protocolli di tensione electroformation alternativi. Troppo-pieno ogni guarnizione ben di ~ 10%.
2. Nota: una volta che i lipidi sono idratati, procedere rapidamente attraverso i passaggi rimanenti, dal momento che i film di lipidi iniziano a delaminate immediatamente. Resa e dimensioni sono massimizzati se electroformation inizia prontamente.
3. Con un movimento uniforme, applicare una seconda slitta, faccia conduttivo ITO in, per la parte superiore della guarnizione. Assicuratevi di avere almeno 5 mm di sporgenza al di fuori della zona guarnizione e di fronte al primo sbalzo. Premere delicatamente per garantire una buona tenuta.
4. Pulire le due sporgenze che utilizzano l'etanolo e verificare che le parti che affrontano la guarnizione sono conduttivi con il multimetro.
5. La camera può essere ulteriormente fissato con parafilm o leggeri tensione clip a molla, se desiderato.
6. Collegare la camera electroformation ad una sorgente di tensione, garantendo in alluminio o rame bar, "EMI Gasket schiuma ", o nastro conduttivo adesivo alle superfici conduttive delle due slitte. Usiamo EMI guarnizione in schiuma. piani per una giga e morsetto sono mostrati in figura 5.
7. Verificare che non vi sia un corto elettrico tra i contatti, e che i contatti sono connessi correttamente alle superfici ITO, usando il multimetro.
8. Riscaldamento della camera di 10 ° C la temperatura più alta di fusione di qualsiasi dei lipidi presenti; esempio per DPPC, riscaldare a 52 ° C minimo, 10 ° C sopra la temperatura di fusione catena di 42 ° C.
9. Per buffer basso contenuto di sale, applicare una Hz sinusoidale 10, ~ 0.7 V _rms per ogni millimetro gap tra le due superfici rivestite ITO, per 60-90 min. Per i tamponi alti di sale, altri protocolli di tensione devono essere utilizzati (vedi riferimenti).

5. Imaging e risoluzione dei problemi

1. Immagine del liposomi utilizzando un microscopio invertito dotato di un cubo filtro rodamina o Texas coloranti rossi. Il liposoma dovrebbe essere sferica,prevalentemente unilamellare a occhio, e priva di difetti come "stringhe" appesi fuori il liposoma.
2. Se i liposomi sono troppo piccole, usare meno lipidi.
3. Se ci sono molti difetti o poche liposomi, ciò può essere dovuto al lipidi gel trifase. Considerare l'aumento della temperatura electroformation.
4. Se pochi o nessun liposomi giganti formate affatto dal disidratate piccoli liposomi, ridurre la forza osmotica del buffer liposoma, o aumentare la forza osmotica del buffer electroformation. Uno spunto di tampone nella soluzione tampone concentrata interstiziale può causare delaminazione del film lipidico depositato.
5. Se resa vescicola, la qualità o la dimensione è scarsa, e si inclusi sali o buffer pH nel electroformation o liposomi buffer, considerare protocolli di tensione electroformation alternativi. Per esempio, Pott, et al. ^11, raccomandare un protocollo a tre fasi utilizzando una sinusoide 500 Hz, alzando la tensione da 50-1,300 Vpp / m in 30 min, tenendo per 90 min, lan diminuendo la frequenza di 50 Hz per 30-60 min. Platino o titanio elettrodi possono essere necessari in questo caso, ma questo non alterare sostanzialmente il protocollo.

Risultati

Nei nostri esempi, preparando liposomi da una miscela di circa 55% molare POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-phosphocholine), 15 mol% POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-phosphoserine , 30 mol% colesterolo, e 0.1 mol% Texas Red-etichettato 1,2-dipalmitoil-sn-phosphoethanolamine (TxR-PDPE). Questa composizione è stata scelta da circa rappresentante della radice dorsale lipidi gangliari ^18. Prendiamo atto che il 15% molare addebitato lipidi (qui POPS) è vicina al limite di ciò...

Discussione

Electroformation di liposomi giganti si è sviluppato in una tecnica flessibile, compatibile con diversi lipidi, preparati, e buffer. Attento controllo del processo di deposizione lipidica è più critico per il successo. Abbiamo presentato strumenti semplici per rendere deposizione controllata di lipidi da piccole preparazioni liposomiali un processo semplice. L'umidità relativa è critica per la disidratazione dei liposomi iniziali, e il valore ottimale varia con la concentrazione iniziale di soluti nella sospens...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667