イメージングとパッチクランプ電気生理学用ジャイアントリポソーム製剤

要約

定義されている物の巨大リポソームに機能的な膜タンパク質を再構成すると、パッチクランプ電気生理学と組み合わせた強力なアプローチである。しかし、従来の巨大リポソーム生産は、タンパク質の安定性と互換性がないかもしれません。私たちは純粋な脂質やイオンチャネルを含む小さなリポソームから巨大リポソームを製造するためのプロトコルを記述します。

要約

電気生理学的記録のために、化学的に定義された脂質膜へのイオンチャネルの再構成は、これらの重要なタンパク質の機能を識別し、探索するための強力な手法となっています。しかしながら、このような平面的な二重層のような古典的な製剤は、再構成されたチャネルと、その膜環境で行うことができる操作や実験を制限する。巨大リポソームの全表示セル​​状構造は、脂質環境の制御を犠牲にすることなく、従来のパッチクランプ実験を可能にする。

電鋳は効率的で巨大なリポソーム>薄い、順序付けられた脂質フィルムが電極表面に堆積する交流電圧の印加に依存して、直径が10μmを生成することを意味する。脂質は有機溶媒から析出させるために、古典的なプロトコルを呼び出ししかし、それはイオンチャネルと変更する必要がありますようにそれほど強固な膜タンパク質との互換性はありません。最近では、PRotocolsは私達が私達の研究室でタンパク質含有リポソームに適応している部分脱水小さなリポソームから巨大リポソームを電鋳するために開発されている。

我々はここで、背景、装置、技術、および小型のリポソーム分散液から巨大リポソームの電鋳の落とし穴を紹介。我々は従うより挑戦的なプロトコルを試みる前に、最初に習得すべきである古典的なプロトコルで始まる。私たちは、飽和塩溶液と蒸気の平衡を用いた小型リポソームの制御された部分的な脱水のプロセスを示しています。最後に、電鋳自体のプロセスを示す。我々は、高品質のリポソームを生成し、最良の結果を得るために各段階で調製物の目視検査を記述するために自社で製造することができる単純で安価な機器について説明する。

概要

ジャイアントリポソームは（しばしば巨大な単層小胞、またはGUVsと呼ばれる）は、主に二重層変形、横相共存（ "ラフト"）、膜融合など ^1-4の研究を含む脂質二重層の物理学と物理化学を勉強するために使用されている。簡単に周囲の水性緩衝液よりも異ならせることができる水性内部を取り囲む膜の球殻：それらは著しくセル状構造を有している。それらは、定義により、直径が1〜100μmで≈ので、それらは光学顕微鏡様々な手法を用いて撮像することができるされている。それらは、一般的にソフトながら、それらの特性は、取り扱いが簡単に操作できるように、ピンと張っ用いて浸透圧の勾配または機械的に適用された張力を行うことができる。具体的には、リポソームの "剛性"電気生理学のための "リポソームに接続された"又は切除したパッチを形成することが簡単で制御することになる。過去には、イオンチャネルの再構成は、主に平面脂質（b）で実施したilayers。さて、巨大リポソームからパッチを形成し、従来の電気生理学のために開発されたツールのかなりの震え（蛍光顕微鏡、マイクロピペット吸引、急速潅流と温度制御など ） を使用する能力は、再構成の研究^5,6のために巨大なリポソームがますます魅力的になります。

巨大リポソームは、多くの戦略によってなされている。乾燥した脂質膜は^4,7,8を再水和されたとき、実際には、巨大なリポソームは腫れプロセスによって自発的に形成する。より急速に大きくなる準備をする欲求は、より均一なリポソームは、電鋳^1,9そのうちチーフ他のアプローチへの研究を主導した。電鋳はまた、乾燥脂質膜の水和に依存するが、脂質膜を横切る振動電場を印加して処理を高速化する。フィールドまたは水によって分離され、二つの電極、白金線のいずれか、またはインジウムスズ酸化物（ITO）でコーティングされたガラススライドを介して印加されるバッファとその上に脂質が堆積される。リポソームの膨潤をスピードアップすることで、人はより大きなリポソームの高収率を達成しています。したがって、電鋳、巨大リポソーム^4を生成するデフォルトの方法となっています。

電鋳のメカニズムは完全には理解されるものではなく、プロトコルのほとんど（ 例えば ^、10,11）経験的に開発されている。それにもかかわらず、我々は理論といくつかの実証結果を考慮することによって期待することについて少し学ぶことができます。これは、広く電鋳が堆積脂質膜^10,11に積層され、個々の脂質二重層との間のバッファの電気浸透流を駆動することによって起こると考えられている。脂質二重層の熱揺らぎに静電結合はまた、おそらく¹²複雑です。これらの仮説は、定性的^10,12を使用することができる電界の周波数および強度の上限を予測する。特に、その高い導電性溶液を予測している（ すなわち生理的塩溶液）がリポソーム電鋳^12を開始することができる電気流体力を低減。電気浸透流速度は、一般に、塩濃度の増加に伴って減少し、頻繁にいくつかの電界発振周波数（ 例えば 、異なる幾何学的形状、Green ら^。13であっても）でピークに達している。したがって、高い電界強度と高い周波数は制限¹⁰内、高導電性ソリューションのための合理的である。

しかしながら、膜タンパク質は、その後、薄い脂質フィルムを残すように蒸発させる有機溶媒中、すなわち、electroswelling手順については電極上に脂質を堆積する通常の方法と互換性があると思われる。この難しさの周りに二つの主要な経路があり​​ます：巨大リポソーム形成後にタンパク質を組み込むために、または脂質が堆積されているどのように適応する。我々のアプローチは、脂質とreconstiを堆積させるために他の人^5,11上に構築小規模または大規模な "プロテオ"の懸濁液から一緒に膜タンパク質をtuted。我々は、（コリンズとゴードン、 レビューで）他の場所で、タンパク質と脂質を精製からプロテオリポソームを生成する長い、より挑戦的なプロセスについて説明します。ここでは、任意のタンパク質が存在しない場合にプロトコルを記述しますが、タンパク質が組み込まれているとき、それは同じであり、私たちはイオンチャネルTRPV1を含むプロテオがGUVsに変換され、パッチクランプ電気生理学に使用できることを示す結果が含まれています。任意の電鋳アプローチでは、脂質堆積プロセス中の脂質サンプルの目視検査が成功に不可欠である。

我々のアプローチはイオンチャネル再構成に専用アプリケーションを超えて関連しているかもしれません。まず現在、このプロトコルを開発してからの時間で、それはまた、脂質​​電鋳用電極上に積層された方法は、得られたGUVsの組成の不均一性をどのように影響するかが示されている。 BaykアルCaglar ら ^14は慎重に脱水リポソームから形成GUVsは、様々なリン脂質とコレステロールの混合物から形成GUVsの混和転移温度で2.5倍小さい変動を有することを示した。彼らの仕事は、その脂質を示し、特にコレステロール、堆積された脂質膜の組成に大きな空間的変動を生じる有機溶媒から析出脂質混合物から沈殿し得る。これは、脂質膜の相挙動の研究のために特に重要であるだけでなく、イオンチャンネル機能に関する定量実験に重要であり得る。バイカル-Caglar らのプロトコルは似ていますが、私たち自身と同一ではない、と読者は、同様にそれを勉強することをお勧めします。

このプロトコルは、（概要、 図1を参照）を使用することができる、多くの一つである。原則電鋳の成功で脂質混合物、水和、温度、他の溶質（特にイオン）、およびに依存もちろん形成に使用される電圧および周波数を。電鋳は、より良い理解になると、我々はより多くの我々のプロトコルを絞り込むことを期待しています。

最後に、巨大リポソームを電鋳で急な学習曲線がしばしばあります。我々は、従来のプロトコル（セクション1と4、そして、必要に応じて、第5項）をリポソーム懸濁液（セクション2-5）から脂質を堆積させるために学習する前にマスタリングを示唆している。

プロトコル

1。有機溶媒からの脂質の沈着：クラッシックプロトコル

1. 。-20℃または-80℃で貯蔵から脂質を取り外し、RTに暖かい注意：脂質は極めて吸湿性であり、多くは酸素に敏感である。乾燥アルゴンまたは窒素ガス中の脂質をカバーし、 すべてのステップで空気への暴露を最小限に抑えることができます 。
2. 必要であれば、1から10 mg / mlのでクロロホルム又はシクロヘキサンに脂質を中断、メーカーの規定の濃度は、通常、名目だけであることに注意してください注意：有機溶剤を使用する場合、適切な手袋および他の個人用保護具を着用してください。ほとんどの材料は、まだこれらの溶剤に対して透過性であり、彼らは唯一の一時的な保護を提供するような溶媒は、その上にこぼした場合はすぐにPPEを外します。
3. エタノールを持つ2つの25×37.5ミリメートルITO被覆ガラススライドの両側をきれい
4. 所望のモル比を達成するために、脂質を混ぜる。リップで被覆するITOスライドの領域のそれぞれ1cm ^2のためのイド、ミックス〜脂質の15〜20μgの。両方とも25×37.5ミリメートルスライドが完全に被覆されるべきであった場合、我々は一般的に10 mg / mlの脂質混合物30μlのを使用します（注）。蛍光イメージングのために0.1モル％、テキサスレッド-DPPEを追加し、に関する注意については、以下を参照してください蛍光色素。
5. スライドガラスのITOコーティングされた側が抵抗計またはマルチメータと表面抵抗を測定することにより、上を向いていることを確認します。
6. 溶媒耐性シリンジ注意に脂質を吸引：いいえ接着剤やPTFE以外のプラスチック、有機溶剤にお問い合わせください。
7. 注射針はかなりITO表面に触れていないと、徐々にスライドを行き来針を動かす脂質を適用します。ガラス表面に "虹の輝き"を探して、均等に表面を覆う。
8. <1トル（1 mmHgの）溶剤の痕跡を除去するための0.5-1時間、真空下で素早くスライドを置きます。不活性ガスで真空を解除します。
9. で、シリコンガスケットを適用する両側のシリコン真空グリースの薄層。スライドの一端で露出むき出しのスライドの5mm以上にしておきます。
10. 第4節にすぐ進みます。

2。制御された脱水のための小さなリポソーム製剤

1. ステップ1.4から1.1のように、脂質混合物を準備します。
2. 10〜15ミリメートル径培養チューブにアルゴンのストリームまたは窒素ガスを用いた脂質を乾かします。脂質の少量の場合は、≤0.5mgを、得られたフィルムを直接残留溶媒を除去するために0.5〜1時間真空下に置いた後、水和することができ、2.5に進みます。脂質の多量でも真空下で、厚いゲル中に有機溶媒をトラップする傾向があり、良好な凍結乾燥により調製され、ステップ2.3-4を参照してください。
3. 、シクロヘキサンで乾燥脂質フィルムを中断ストッパーとアルゴンとシールでカバー、1時間最低-80℃で冷たいブロックと凍結にチューブを配置。
4. 真空システムに冷たいブロックと脂質サンプルを置き100トルに達することができる。真空を適用し、それは溶剤昇華オフとして約1Torrで "失速"意志。いったん溶媒が完全に真空がこのレベル以下に低下します（約1時間）に削除されます。不活性ガスで真空を解除し、直ちに管又は水和物を封印。
5. 脂質は、真空下でされていますが、脱気水和バッファ真空を使用して^15-17を散布。
6. 最終濃度1-10 mg / mlので脱気したバッファーを使用して水和物脂質。ゆっくり水和物への脂質を許す。 30分後、1時間、残りの塊を分割するための渦。完全な水和を可能にするために追加の0.5-1時間を待ちます。以下の手順で完全に脱水症状を防ぐために、このような最大200 mmまでのソルビトールまたはスクロースなど、osmoticantを使用してください。
7. 押出により100-200 nmの直径リポソームを準備します。詳細については、製造元の押し出しプロトコルを参照してください。バッファは〜25 mMのイオン強度未満持っている必要があります、または特別な電鋳電圧プロトコルは第4節で必要とされることに注意してください。

3。小さなリポソームの制御脱水によって脂質の堆積

1. 注意：私たちのプロトコルは脂質が多くの時間のために、飽和塩溶液と蒸気の平衡状態に置かれている必要があります。我々は強くグローブボックスまたは類似のエンクロージャを使用して、不活性ガス雰囲気中でプロトコルを実行することをお勧めします。
2. 注意：タンパク質を含む試料を準備した場合、完全な脱水を避ける。水和物は、暖かい水のビーカーを持つ任意のエンクロージャ内の雰囲気、または超音波処理器ベースの加湿器。少なくとも30％の相対湿度があることを確認するために湿度計を使用してください。合計脱水を防ぐために、追加の予防措置として、小さなリポソームバッファ内ソルビトールまたはスクロースを使用してください。
3. 適切な相対湿度の飽和塩溶液を準備します。目標湿度は、小胞の準備の浸透圧に依存します。低浸透圧の小胞の準備が十分に脱水することができるしながら生理的浸透圧を有する製剤の場合、30〜45％RHを使用75から90パーセントRH（ 表1も参照）と平衡。
4. インテリア棚でしっかり密閉できる容器に飽和食塩水と過剰な塩分を入れて。非常によくヨーグルトとグラノーラの仕事のための商業食品容器。充填した後に棚を交換し、流体はシェルフの下5〜10ミリメートルであることを確認してください。
5. セクション1のようにITOコートしたスライドを清掃してください。導電性のある側面を決定し、サンプル名と非導電性の面にラベルを付けるためにマルチメータを使用します。
6. 軽くグリースつまたは複数の孔を有するシリコーン（USPグレードVI）ガスケット（複数可）の両側。
7. ベンチの上に導電性のスライド側を上に置き、電鋳装置に接続するための一方の端部に露出したスライドの少なくとも5mmがあることを確認し、脂質が適用される各スライドにシリコーンガスケット（s）を適用する。良好なシール性を確保するためにガスケットを滑らかに。
8. 〜1-2 mg / mlのに低塩等張緩衝液中の小胞の準備を希釈。我々は、より高いconcentrを見つける管理ポイントが悪い結果を生む。
9. 1-10液滴内のスライドに脂質を適用します。小さな液滴は、一般的に良い結果を生む。
10. 飽和塩溶液上記のインテリア棚の上にスライドを置き、しっかりと容器を密封する。 O / Nに3時間室温で残す容器を4℃で配置することができるが、いくつかの塩のために、RH、温度、およびその冷たいに強く依存することに注意が平衡時間を増加させる。
11. 得られたフィルムは、それにわずかに虹の光沢を持っているかもしれませんが、いずれにしてもほぼ乾燥表示されるはずです。高い浸透開始ソリューションは、脂質膜に完全に乾燥することは不可能かもしれないが、これは逆に結果には影響しません。

4。ジャイアントリポソームの電鋳

1. 特に、脂質膜、脱水リポソームから形成されたものは、容易に外れている。 慎重水和物各ウェルは、ガスケット27の端部にGの注射針を配置し、 徐々にバッファを適用することによって。バッファができます水、≤200mMのスクロース、ソルビトール≤1 Mと≤の5mM HEPESを含む。以上の10mM塩溶液は、代替電鋳電圧プロトコルを必要とするかもしれない。 〜10％よくあふれ各ガスケット。
2. 注：一度脂質が水和している、脂質膜はすぐに剥離し始めているので、残りの手順をすばやく進める。電鋳は、速やかに始まる場合収量とサイズが最大化されています。
3. 1滑らかな動きでは、ガスケットの一番上に、第二のITOスライド、導電性の顔を適用します。ガスケットエリア外と最初のオーバーハング反対オーバーハングの少なくとも5ミリメートルを持っていることを確認してください。良好なシール性を確保するために軽く押します。
4. エタノールを使用して2オーバーハングを清掃し、ガスケットが直面している側面があなたのマルチメータを有する導電性であることを確認します。
5. 必要に応じてチャンバーはパラフィルムや光テンションスプリングクリップでさらに固定することができる。
6. "、アルミニウムまたは銅バーを固定することによって、電圧源にEMI gaskを電鋳槽を接続するら2つのスライドの導電性表面に泡"、または導電性粘着テープ。私たちはEMIガスケットの泡を使用しています。具とクランプのための計画は、 図5に示します。
7. 接点間には電気的短絡がないことを確認し、マルチメータを使用して、連絡先がITO表面に適切に接続すること。
8. 52にDPPC用など 、熱42のチェーン融解温度℃以上、最低10℃℃、室内は10℃現在の脂質のうちのいずれかの最高溶融温度以上Cを加熱
9. 低塩バッファの場合、60〜90分間、10 Hzの正弦波、2 ITOコーティングされた表面間の各ミリギャップ〜0.7 V _RMSを適用。高塩緩衝液については、他の電圧プロトコル（参考文献を参照）を使用すべきである。

5。イメージングとトラブルシューティング

1. イメージローダミンまたはテキサスレッド染料用のフィルタキューブ装備倒立顕微鏡を用いてリポソームを。リポソームは、球状であるべき主に目で単層、およびそのようなリポソームをオフにぶら下がって "文字列"として欠陥。
2. リポソームが小さすぎると、より少ない脂質を使用する。
3. 多くの欠陥または少数のリポソームがある場合、これは、ゲル相脂質に起因する可能性がある。電鋳の温度を上昇させることを検討してください。
4. 脱水小さなリポソームから全く形成少ない又は全く巨大リポソーム場合、リポソームバッファの浸透強度を低下させる、または電鋳バッファの浸透強度を高める。濃縮された間質性緩衝液中にバッファの突入は、堆積脂質フィルムの剥離を引き起こす可能性があります。
5. 小胞の収量、品質、またはサイズが悪く、あなたは電鋳やリポソームバッファー中の塩またはpH緩衝液が含まれている場合、代替電鋳電圧プロトコルを検討してください。例えば、ポットら ^11は 、90分間保持して、Vppは50-1,300 / mで30分かけてからの電圧を上昇させる、500Hzの正弦波を用いて3段階プロトコルを推薦するnは30〜60分かけて50 Hzに周波数を下げる。白金またはチタン電極は、この場合には必要とされ得るが、これは実質的にプロトコルを変更しません。

結果

我々の実施例では、約55モル％のPOPC（1 -パルミトイル-2 -オレオイル-sn-グリセロ-ホスホコリン）、15モル％ポップ（1 -パルミトイル-2 -オレオイル-sn-グリセロホスホセリンの混合物からリポソームを調製、30モル％コレステロール、および0.1モル％テキサス1,2 -ジパルミトイル-SN-ホスホエタノールアミン（TxRは-DPPE）赤標識。この組成物は^、18後根神経節の脂質の約?...

ディスカッション

巨大リポソームの電鋳は、多様な脂質、準備、およびバッファとの互換性が柔軟な手法へと発展しています。脂質堆積プロセスの注意深い制御が成功にとって最も重要である。私たちは小さなリポソーム製剤簡単なプロセスからの脂質の制御された堆積を作るための簡単​​なツールを提示している。相対湿度は、初期リポソームの適切な脱水するために重要であり、最適値は、リポソーム?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667