Гигантские липосом для работы с изображениями и патч-зажим электрофизиологии

Резюме

О восстановлении функциональных белков мембраны в гигантские липосомы определенного состава является мощным подходом в сочетании с патч-зажим электрофизиологии. Однако обычные производственные липосома гигантский могут быть несовместимы с стабильности белка. Мы описываем протоколы для производства гигантских липосом из чистого липидов или небольших липосом, содержащих ионные каналы.

Аннотация

Восстановления ионных каналов в химически определенных липидов мембран для электрофизиологические записи был мощный метод для выявления и изучения функции этих важных белков. Тем не менее, классические препараты, такие как плоские бислоев, ограничивают манипуляций и эксперименты, которые могут быть выполнены на восстановленный канал и его мембрана среды. Чем больше клеточной структуры гигантских липосом позволяет традиционных патч-зажим эксперименты не жертвуя контролем липидного среды.

Electroformation является эффективным средством для получения гигантских липосом> 10 мкм в диаметре, который основан на применении переменного напряжения в тонкой липидной пленки упорядоченной осажденных на поверхности электрода. Однако, так как классический протокол предусматривает липидов на хранение из органических растворителей, не совместимы с менее надежными мембранных белков, как ионные каналы и должна быть изменена. В последнее время PRotocols были разработаны для Electroform гигантские липосомы из частично обезвоженной небольшой липосомы, которые мы адаптировали к белку содержащих липосомы в нашей лаборатории.

Мы приведем здесь фоне, оборудования, техники и ловушки electroformation гигантских липосом от небольших липосомы дисперсий. Начнем с классического протокола, которая должна быть освоена, прежде чем пытаться более сложные протоколы, которые следуют. Мы продемонстрировать процесс контролируемого частичному обезвоживанию малых липосом использованием паров равновесии с насыщенными растворами солей. Наконец, мы демонстрируем процесс electroformation себя. Мы опишем простым, недорогим оборудованием, которое может быть сделано в лабораторных условиях для производства высококачественного липосомы и описать визуальный осмотр подготовки на каждом этапе, чтобы обеспечить наилучшие результаты.

Введение

Гигантские липосомы (часто называемые гигантские однослойные везикулы, или GUVs) имеют в основном были использованы для изучения физики и физической химии липидного бислоя, в том числе исследования двухслойных деформации, боковой фазе сосуществования («плоты»), слияние мембран и т.д. ^1-4. Они имеют чрезвычайно клеточной структуры: сферической оболочки мембраны, окружающей водной внутренний которые могут быть легко сделаны различные чем окружающие водном буфере. Они, по определению, ≈ 1-100 мкм в диаметре, так что они могут быть отображены с использованием различных подходов свет микроскопии. Они могут быть сделаны тугими использованием осмотических градиентов или механически применяться напряжение, так что в то время как обычно мягкие, их свойства можно манипулировать для легкой обработки. В частности, управление «жесткость» в липосомы делает его простым, чтобы сформировать "липосомы прилагается» или вырезают патчи для электрофизиологии. В прошлом, ионный канал восстановления в значительной степени выполнена в плоской б липидовilayers. Теперь, способность образовывать пятна от гигантских липосом и использовать значительную дрожь средства, разработанные для обычных электрофизиологии (флуоресцентной микроскопии, микропипетки аспирации, быстрой перфузии и контроля температуры, и т.д.) делает гигантские липосомы более привлекательной для приготовления исследования ^5,6.

Гигантские липосомы были сделаны многие стратегии. В самом деле, гигантские липосомы образуют спонтанно процесс набухания Когда сухой липидной пленки регидратируют ^4,7,8. Желание быстрее подготовить большее, более равномерное липосом привело исследователей к другим подходам, главным из которых electroformation ^1,9. Electroformation также зависит от гидратации высушенного липидную пленку, но ускоряет процесс путем применения переменного электрического поля через липидную пленку. Поле прикладывается через два электрода, либо проводов платины или индия-олова (ITO) покрытием предметные стекла, разделенных водой илибуфер и на которую липиды откладываются. За счет ускорения набухания липосомы, он достигает более высокий выход больше липосомы. Таким образом, electroformation стал метод по умолчанию для производства гигантских липосом ^4.

Механизм electroformation полностью не изучен, и большинство из протоколов разработаны эмпирически (например, ^10,11). Тем не менее, мы можем узнать немного о том, что ожидать с учетом теории и некоторые эмпирические результаты. Широко распространено мнение, что electroformation происходит при движении электро-осмотического потока буфера между отдельными бислоя липидов укладываются в осажденной липидная пленка ^10,11. Электростатический связь с тепловыми флуктуациями липидного бислоя, вероятно, также участвуют ^12. Эти гипотезы качественно предсказать верхний предел частоты электрического поля и силы, которые могут быть использованы ^10,12. В частности, он предсказал, что решения высокой проводимостью ( т.е. физиологические растворы солей) уменьшить электрогидродинамическое сил, которые могут инициировать липосомы electroformation ^12. Электроосмотического потока обычно уменьшается с увеличением концентрации солей и часто достиг максимума в некоторой частотой колебаний электрического поля (например, хотя и в различной геометрии, зеленый и др.. ^13). Таким образом, более высокие значения напряженности поля и высокие частоты разумны для решений высокой проводимостью, в пределах ^10.

Тем не менее, мембранные белки могут быть несовместимы с обычным методом осаждения липидов на электроды для electroswelling процедура, а именно в органических растворителях, которые затем выпаривают, чтобы оставить тонкой липидной пленки. Существуют два основных пути обойти эту трудность: включение белков после гигантских липосом, или адаптироваться, как липиды откладываются. Наш подход основан на других ^5,11 внести липидов и восстановления имtuted мембранного белка вместе с суспензией малые или большие "протеолипосом". Мы описываем длительный и более сложный процесс производства протеолипосомами из очищенных белков и липидов в другом месте (Коллинз и Гордон, в обзоре). Здесь мы описываем протокола в отсутствие какого-либо белка, но это то же самое, когда белок включена; мы включаем результаты, показывающие, что протеолипосом содержащий ионный канал TRPV1 может быть преобразована в GUVs и используется для патч-зажим электрофизиологии. В любом electroformation подход, визуальный осмотр липидного образца во время процесса осаждения липид имеет решающее значение для успеха.

Наш подход может иметь отношение пределы специальной приложение восстановления ионного канала. За время как мы впервые разработана этот протокол и сейчас было также показано, каким образом способ, в котором липиды откладываются на электродах для electroformation влияет на композиционной гетерогенности результате GUVs. Baykаль-Caglar соавт. ¹⁴ показано, что GUVs сформированный из тщательно обезвоженный липосом была в 2,5 раза меньше изменение температуры растворимость переход GUVs сформированы из смеси различных фосфолипидов и холестерина. Их работа показывает, что липиды и особенно холестерина, может выпадать в осадок из липидной смеси при осаждении из органических растворителей, в результате чего большое пространственное изменение в составе осажденного липидной пленки. Это особенно важно для изучения фазового поведения липидов мембран, но также может иметь решающее значение для количественных экспериментов по функции ионного канала. Байкал-Caglar соавт. С протоколом похожа, но не идентична нашей, Читателям предлагается изучить его, а также.

Этот протокол (см. обзор, рис. 1) является одним из многих, которые могут быть использованы. В принципе успех electroformation зависит от смеси липидов, гидратации, температура, другие растворенные вещества (в частности, ионов), а такжеКонечно, напряжения и частоты, используемые в формировании. Как electroformation становится более понятным, мы рассчитываем усовершенствовать наш протокол больше.

Наконец, часто крутой кривой обучения в гальванопластики гигантские липосомы. Мы предлагаем освоение обычного протокола (разделы 1 и 4, и, при необходимости, раздел 5) перед обучением внести липидов из липосомальной суспензии (разделы 2-5).

протокол

1. Осаждение липидов из органических растворителях: классического протокола

1. Удалить липидов из хранения при -20 ° С или -80 ° С; нагреться до комнатной температуры. Внимание: липиды чрезвычайно гигроскопичным и многих чувствительных к кислороду. Крышка липидов в сухой газ аргон или азот, и на всех этапах минимуму воздействия воздуха.
2. При необходимости приостановить липидов в хлороформе или циклогексана при 1-10 мг / мл; обратите внимание, что заявил концентрации производителей, как правило, только номинальным ВНИМАНИЕ: Носить соответствующие перчатки и другие средства индивидуальной защиты при использовании органических растворителей.. Снимите СИЗ быстро, если растворитель пролил на них, так как большинство материалов по-прежнему проницаемой для этих растворителей и они только обеспечивают временную защиту.
3. Очистите обе стороны два 25 х 37,5 мм ITO покрытием слайды стекло с этанолом
4. Смешать липиды, чтобы достичь желаемого молярных соотношениях. Для каждого 1 см ² площади ITO скользит должна быть покрыта губаID, смешать ~ 15-20 мкг липидов. Например, если оба 25 х 37,5 мм слайды были быть полностью покрытый, мы обычно используют 30 мкл 10 мг / мл смеси липидов. Примечание: добавление 0,1% мол Texas Red-DPPE для флуоресцентных изображений, и см. ниже предупреждает о флуоресцентных красителей.
5. Убедитесь, что ITO покрытой стороне стекла слайдов вверх путем измерения поверхностного сопротивления омметром или мультиметром.
6. Аспирируйте липидов в устойчивые к растворителям шприца. Внимание: Нет клеев или полимерных материалов, кроме тефлона, следует обратиться в органическом растворителе.
7. С помощью шприца игла не совсем касается поверхности ITO, медленно применить липидов перемещение иглы назад и вперед через слайда. Покройте поверхность, равномерно, ищет "радуги блеск" на поверхности стекла.
8. Поместите препараты быстро под <1 Торр (1 мм рт.ст.) вакуума в течение 0,5-1 ч, чтобы удалить следы растворителя. Выпуск вакуум инертным газом.
9. Нанесите силиконовую прокладку, стонким слоем силиконовой вакуумной смазки на обеих сторонах. Оставьте не менее 5 мм непокрытого слайд подвергается на одном конце слайда.
10. Немедленно приступить к разделу 4.

2. Малый липосом для контролируемой Обезвоживание

1. Подготовьте смесь липидов, как и в шаге от 1,1 до 1,4.
2. Сушат липидов с помощью потока аргона или азота газа в 10-15 мм пробирку с культурой диаметра. Для небольших количеств липидов, ≤ 0,5 мг, в результате пленка может быть гидратированный непосредственно после размещения его в вакууме в течение 0,5-1 часов, чтобы удалить остаточный растворитель; перейти к этапу 2.5. Большие количества липидов как правило, ловушка органических растворителей в густой гель, даже под вакуумом и лучше подготовлены путем лиофилизации, см. шаги 2.3-4.
3. Приостановить высушенной пленки липидов в циклогексана, крышка с аргоном и печать с пробкой, Поместите пробирку в холодный блок и заморозить при -80 ° С в течение 1 часа минимум.
4. Поместите холодный блок и липидов образца в вакуумной системеспособных достигать 100 мтор. Применить вакуум, она будет "стойло" на расстоянии около 1 Торр в качестве растворителя сублимируется прочь. Как только растворитель полностью удаляют (~ 1 час) вакуумный упадет ниже этого уровня. Выпуск вакуум инертным газом и запечатать трубу или гидрат немедленно.
5. В то время как липиды находятся под вакуумом, дегазации гидратации буфера с помощью вакуума и барботирования ^15-17.
6. Гидрат липиды использованием дегазированной буфере до конечной концентрации 1-10 мг / мл. Разрешить липидов для увлажнения медленно. Через 30 мин-1 ч, вихревые разбить оставшиеся сгустки. Ждать еще 0,5-1 часа для обеспечения полной гидратации. Используйте osmoticant, такие как сорбит или сахароза до 200 мм, чтобы в полной дегидратации в действия.
7. Подготовка 100-200 нм, диаметр липосом экструзией. См. экструзии протоколом производителя за более подробной информацией. Следует отметить, что буфер должен иметь менее ~ 25 мМ ионной силы или специальные протоколы напряжение electroformation будут необходимы в разделе 4.

3.Осаждение липидов Контролируемые Обезвоживание малых липосомы

1. Внимание: Наш протокол требует липидов быть помещены в равновесии с паром насыщенных солевых растворов в течение многих часов. Мы рекомендуем выполнения протокола в атмосфере инертного газа с использованием камеры с перчатками или аналогичных корпуса.
2. Внимание: При подготовке образцов, содержащих белки, избежать полного обезвоживания. Гидрат атмосферы в любой корпус с стакан с теплой водой или на основе ультразвукового увлажнителя. Использование гигрометр для обеспечения есть по крайней мере 30% относительной влажности. Использование сорбитом или сахарозой в небольшом липосома буфер в качестве дополнительной меры предосторожности, чтобы избежать полного обезвоживания.
3. Подготовка насыщенным раствором соли соответствующим относительной влажности. Цель влажность зависит от осмолярность препарата везикул. Для препаратов с физиологическим осмолярности, используйте 30-45% относительной влажности, в то время как низкий препараты везикул осмолярности может быть адекватно обезвоженной вравновесии с 75-90% относительной влажности (см. также таблицу 1).
4. Положите насыщенный раствор соли и избыток соли в плотно закрывающуюся емкость с внутренняя полка. Коммерческая контейнеры для пищевых продуктов для работы йогурт и мюсли очень хорошо. Замените полку после заполнения, и убедитесь, что жидкость составляет 5-10 мм ниже полки.
5. Чистый ITO покрытием слайды, как в разделе 1. Использовать мультиметр, чтобы определить, какая сторона является проводящей, и маркировать непроводящих бок с названия образца.
6. Слегка смазать с обеих сторон силикон (USP класса VI), прокладку (ы) с одним или несколькими отверстиями.
7. Поместите препараты проводящей стороной вверх на скамейке, и применить силиконовые прокладки (ей) каждый слайд, на который липидов будет применяться, убедившись, что есть по крайней мере 5 мм оголенного слайдов на одном конце для подключения к electroformation аппарата. Гладкая прокладка для обеспечения хорошего уплотнения.
8. Развести препарат в пузырьке с низким содержанием соли isosmotic буфера до ~ 1-2 мг / мл. Мы считаем, что более высокие концобъема производят плохие результаты.
9. Применить липидов к слайду в 1-10 мкл капли. Меньшие капель обычно производят лучшие результаты.
10. Поместите слайд на внутренней полке над насыщенным раствором соли и запечатать контейнер плотно. Оставить при комнатной температуре в течение 3 часов, чтобы O / N. Контейнер может быть помещен при 4 ° С, но обратите внимание, что для некоторых солей RH сильно зависит от температуры, и холодный увеличит время установления равновесия.
11. Полученная пленка может иметь легким блеском радуги к нему, но в любом случае должно появиться почти высушенной. Высоко осмотического исходных растворов может быть невозможно полностью высохнуть к липидной пленки, это не повлияет негативно на результаты.

4. Electroformation гигантских липосом

1. Липид фильмов, особенно те, которые образованы из обезвоженных липосомы, которые легко удалить. Тщательно гидрат каждую лунку, помещая 27 G иглу шприца на краю прокладки и медленно применением буфера. Буферы могутвключают воду, ≤ 200 мМ сахарозы, 1 ≤ M ≤ сорбит и 5 мМ HEPES. Более 10 мм раствор соли может потребовать альтернативных протоколов electroformation напряжения. Переполнения каждой прокладки также на ~ 10%.
2. Обратите внимание: как липиды увлажненной, проведен в кратчайшие сроки выполнить остальные действия, так как липидных пленок начинают расслаиваться немедленно. Доходность и размер увеличить, если бы electroformation начинается быстро.
3. Одним плавным движением, нанесите второй слайд ITO, проводящий в лице, в начало прокладку. Удостоверьтесь, чтобы иметь по крайней мере 5 мм свес за пределами области прокладки и напротив первого навеса. Нажимайте мягко, чтобы обеспечить хорошее уплотнение.
4. Очистите два свесы с использованием этанола и убедиться, что стороны, обращенные к прокладке являются проводящими с мультиметра.
5. Камера может быть обеспечено дальнейшее парафином или светло-клипы натяжение пружины при желании.
6. Подключите камеру electroformation к источнику напряжения, обеспечивая алюминия или меди бары, "EMI ГАСКET пена », или проводящих клейкой ленты с проводящими поверхностями двух слайдов. Мы используем EMI прокладки пены. Планы на джиг и зажим показано на рисунке 5.
7. Убедитесь, что нет короткого замыкания между контактами, и что контакты правильно встать на ITO поверхности, используя мультиметр.
8. Нагреть камеры 10 ° C выше самой высокой температуры плавления любого из липидов, присутствующих, например, в DPPC, нагревают до 52 ° C минимум, 10 ° С выше температуры плавления цепь 42 ° C.
9. Для низким содержанием соли буферы, применять 10 Гц синусоидальной волны, ~ 0,7 В _RMS для каждого миллиметра разрыв между двумя ITO покрытием поверхностей, в течение 60-90 мин. За высокие буферы соль, другие протоколы напряжения должны использоваться (см. ссылки).

5. Работа с изображениями и устранение неисправностей

1. Изображение липосомы с использованием инвертированного микроскопа, снабженного фильтром куба для Родамин или Texas Red красителей. Липосомы должна иметь сферическую форму,однослойные преимущественно на глаз, и без дефектов, таких как «струн» висит у липосомы.
2. Если липосомы слишком малы, использовать меньше липидов.
3. Если есть много дефектов или нескольких липосомы, это может быть связано с гель-фазу липидов. Рассмотреть вопрос о повышении electroformation температуры.
4. Если мало или совсем нет гигантские липосомы, образованные на всех из обезвоженных небольшой липосомы, снижение осмотической силы липосом буфера или увеличение осмотического сила electroformation буфера. Пусковой буфера в концентрированный раствор внедрения буфер может вызвать отслоение хранение липидной пленки.
5. Если пузырек выход, качество, или размер плохое, и вы в том числе соли или рН буферов в electroformation липосомы или буферы, рассмотреть альтернативные протоколы electroformation напряжения. Например, Потта и соавт. ^11, рекомендуют три шага протокола с использованием 500 Гц синусоида, повышение напряжения от 50-1,300 Vpp / м в течение 30 мин, выдержка в течение 90 минн уменьшения частоты до 50 Гц в течение 30-60 мин. Платиновый или титановые электроды могут быть необходимы в данном случае, но это не существенно изменить протокола.

Результаты

В нашем примере мы готовить липосом из смеси приблизительно 55% мол POPC (1-пальмитоил-2-олеоил-Sn-глицеро-фосфохолина), 15% мол POPS (1-пальмитоил-2-олеоил-Sn-глицеро-фосфосерин , 30 моль% холестерина и 0,1 моль% Texas Red меченых 1,2-дипальмитоил-Sn-фосфоэтаноламин (TxR-DPPE). Эта композиция была в?...

Обсуждение

Electroformation гигантских липосом превратился в гибкую технику совместимы с различным липиды, препараты, и буферы. Тщательный контроль процесса осаждения липидов наиболее важными для успеха. Мы представили простые инструменты, чтобы сделать контролируемое осаждение липидов из небольших л...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667